專利名稱：一種在桿狀病毒—昆蟲表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)德國(guó)小蠊過敏原BgGSTD1蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在桿狀病毒一昆蟲表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)德國(guó)小蠊過敏原BgGSTDl蛋白的方法。
背景技術(shù)：
過敏性疾病是人類重大疾病之一。其發(fā)病率目前估計(jì)約占世界人口的30 40%，而且正以每年大于1%的速度增加，以兒童患者的發(fā)病率上升最為明顯。在過去幾十年，過敏性疾病的發(fā)生率在全球有顯著和迅速的增加，西方國(guó)家比發(fā)展中國(guó)家多，城市比農(nóng)村地區(qū)多。以過敏性哮喘(哮喘)為例，英國(guó)現(xiàn)有520萬哮喘病人IIO萬兒童(占兒童總?cè)丝诘?A0)和410萬成人(占成人總?cè)丝诘?/12)，平均每年有1400人死于哮喘。根據(jù)美國(guó)健康調(diào)査統(tǒng)計(jì)報(bào)告，2002美國(guó)約有3800萬病人21卯萬成人，890萬0 17歲的兒童。2004年世界哮喘日會(huì)議報(bào)告指出在過去的20年內(nèi)，哮喘的發(fā)病率在亞太地區(qū)一些國(guó)家上升了近5倍，值得關(guān)注。我國(guó)近年來對(duì)全國(guó)的大規(guī)模調(diào)査顯示，兒童哮喘發(fā)病率比10年前明顯增加，僅小兒哮喘患者達(dá)1000萬之多，其中過敏為主要誘因(全國(guó)哮喘兒童防治協(xié)作組2003)。此外，與癌癥和心腦血管疾病不同，哮喘對(duì)人類社會(huì)和經(jīng)濟(jì)的影響是不能簡(jiǎn)單地以其死亡率來衡量的，而要從這種疾病的發(fā)作頻度來衡量其給人類造成的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。由于哮喘多發(fā)生在年輕人群，其對(duì)人類社會(huì)和經(jīng)濟(jì)的影響就更嚴(yán)重。世界衛(wèi)生組織認(rèn)為哮喘造成的社會(huì)負(fù)擔(dān)超過艾滋病與肺結(jié)核的總和，以英國(guó)為例就超過了年88.9億英鎊。目前治療過敏性疾病的方法主要體現(xiàn)在減輕癥狀?；颊呓?jīng)常服用一些抗組胺類以及類固醇藥物以緩解癥狀，然后這些藥物并不能抑制IgE抗體的產(chǎn)生并經(jīng)常帶來副作用。近年來特異性免疫治療(脫敏治療)在過敏性疾病中的作用得到了肯定，被認(rèn)為是當(dāng)前過敏性疾病唯一的對(duì)因治療方法。該療法是在確定患者的過敏原后，對(duì)患者給予由低到高劑量的過敏原治療。通過反復(fù)給藥誘導(dǎo)其對(duì)此過敏原的耐受性，當(dāng)再次接觸此類過敏原時(shí)就不產(chǎn)生或減輕過敏反應(yīng)。然而，用于治療的過敏反應(yīng)提取物是從天然來源分離得到的蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)成分的粗混合物，這些資源或者含有大量與過敏原無關(guān)的成分，或者幾乎不含有造成患者高敏感性的過敏原。在最近幾年，隨著雜交瘤技術(shù)的進(jìn)展，可以利用基于單克隆抗體的免疫試驗(yàn)對(duì)主要過敏原含量進(jìn)行鑒定，由此導(dǎo)致了在過敏反應(yīng)提取物的標(biāo)準(zhǔn)化方面取得了重要進(jìn)展，所有對(duì)一種特定的過敏反應(yīng)提取物敏感的患者都繼續(xù)接受含全部提取物成分的相同的復(fù)雜混合物的治療，但是這有可能導(dǎo)致副作用的產(chǎn)生，這個(gè)副作用主要是由于對(duì)提取物中所有蛋白質(zhì)成分具有抗性的另外的
3IgE抗體所引起。就過敏診斷而言，這種使用整個(gè)過敏反應(yīng)提取物來進(jìn)行皮膚測(cè)試的方法妨礙了導(dǎo)致患者敏感的特殊過敏原的檢測(cè)。針對(duì)這些缺點(diǎn)，許多研究人員采用生物化學(xué)分離和純化技術(shù)的方法得到單獨(dú)的過敏原。然而，盡管這個(gè)方法對(duì)于過敏原的鑒定可能有效，但卻不足以制備工業(yè)規(guī)模上的過敏原。因?yàn)檫@個(gè)過程極其耗費(fèi)人力，并且從昂貴的自然資源中純化出過敏原產(chǎn)量通常情況下都很低?；谶@些原因，用于合成過敏原蛋白質(zhì)的重組DNA技術(shù)引起了人們的注意。利用可生長(zhǎng)在大發(fā)酵罐的微生物表達(dá)系統(tǒng)可以大規(guī)模獲得重組過敏原。因此，這些技術(shù)使得重組過敏原以一致純度大量生產(chǎn)。除此以外，使用重組DNA技術(shù)可以表達(dá)抗原表位片斷或修飾的過敏原以方便應(yīng)用于過敏性疾病的診斷或處理。早在上世紀(jì)60年代，就有蟑螂引起哮喘的報(bào)道。但直到近年來，蟑螂在哮喘發(fā)病中的作用才逐漸受到人們的關(guān)注。資料顯示，美國(guó)哮喘患者中蟑螂過敏的發(fā)生率達(dá)到27.5 42%，歐洲為3.9 24.5%，非洲為30 44.6%，在我國(guó)，北京、上海等大城市中兒童哮喘患者的蟑螂過敏率也高達(dá)27.8 43.8%。哮喘發(fā)病率的不斷升高，在很大程度上與蟑螂污染加劇有關(guān)，蟑螂已經(jīng)成為僅次于塵螨的第二大過敏源。目前常見的美洲大蠊和德國(guó)小蠊過敏原己經(jīng)被鑒定出來，包括3種美洲大蠊過敏原和7種德國(guó)小蠊過敏原被鑒定出來。這使得運(yùn)用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)蟑螂過敏原用于蟑螂過敏診斷和治療成為可能。德國(guó)小蠊的delta型谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，簡(jiǎn)稱BgGSTDl為德國(guó)小蠊主要過敏原。它是一種肌球蛋白，也是一種泛過敏原。約有30%的蟑螂過敏病人對(duì)BgGSTDl陽性。目前該過敏原只是在大腸桿菌中被表達(dá)，但是沒有在桿狀病毒一昆蟲系統(tǒng)中表達(dá)的報(bào)道。桿狀病毒一 昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)其表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)特性與天然產(chǎn)物相似，具有可糖基化、磷酸化、酰胺化、信號(hào)肽和蛋白切割等后加工修飾功能，而且具有很高的克隆容量，表達(dá)產(chǎn)量高，細(xì)胞培養(yǎng)簡(jiǎn)單，適合大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛的用于各種外源基因的表達(dá)。桿狀病毒具有高度的種屬特異性，不感染脊椎動(dòng)物，相對(duì)于其他病毒載體，如腺病毒、痘病毒等載體而言，其安全性好。BgGSTDl是來源于昆蟲(蟑螂)的蛋白，在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)能保證表達(dá)產(chǎn)物具有活性，蛋白質(zhì)表達(dá)后修飾加工，信號(hào)肽的切除及磷酸化、糖基化等反應(yīng)，抗原性、免疫原性均與天然蛋白相似。因此是非常好的生產(chǎn)昆蟲過敏原的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種在桿狀病毒一昆蟲表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)德國(guó)小蠊過敏原BgGSTDl蛋白的方法。
未解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
一種在桿狀病毒一昆蟲表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)德國(guó)小蠊過敏原BgGSTDl蛋白的方法，包括如下步驟(1) 從德國(guó)小蠊組織提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過PCR方法獲得德國(guó)小蠊過敏原BgGSTDl編碼基因；
(2) 將該編碼基因克隆到桿狀病毒載體中，轉(zhuǎn)化昆蟲細(xì)胞以表達(dá)BgGSTDl蛋白；
(3) 采用親和層析方法對(duì)BgGSTDl蛋白進(jìn)行純化，從而到德國(guó)小蠊過敏原BgGSTDl蛋白。
步驟(1)中，所述的BgGSTDl編碼基因如SEQ ID No:l所示。
步驟(1)中，所述的BgGSTDl編碼基因，其所編碼的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。與國(guó)外來源的德國(guó)小蠊過敏原BgGSTDl有一個(gè)位點(diǎn)氨基酸差異，第6位為150位點(diǎn)是Glu而不是國(guó)外的Arg。
步驟(2)中，所述的桿狀病毒載體為/7FflW5flcZ/Z4。
步驟(2)中，所述的昆蟲細(xì)胞為^-9細(xì)胞。
步驟(3)中，所述的親和層析方法為Nickel親和層析法。所述的Nickel親和層析具體包括如下步驟P0病毒以感染復(fù)數(shù)為1感染500rnL sf9細(xì)胞，其細(xì)胞密度為2xl06/ml，到細(xì)胞出現(xiàn)腫脹的時(shí)候收集細(xì)胞，超聲裂解細(xì)胞，離心得到上清，上Nickel親和柱，用20mM Tris-HCl洗去非特異性結(jié)合蛋白，該Tris-HCl含有300mM NaCl和5。/0(v/v)甘油，之后改用20mM Tris-HCl洗脫，該Tris-HCl含有300mM NaCl、 250mM咪唑和5M(v/v)甘油，洗脫下的蛋白即為BgGSTDl蛋白。
有益效果本發(fā)明方法通過桿狀病毒一昆蟲表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)德國(guó)小蠊過敏原BgGSTDl蛋白，從而避免在不同的表達(dá)系統(tǒng)中(例如細(xì)菌和酵母菌)對(duì)BgGSTDl過敏原結(jié)構(gòu)造成影響的問題，并提供一種親和層析的方法，解決天然BgGSTDl過敏原純化工藝復(fù)雜的問題。


圖1為重組Bacmid的PCR鑒定。其中1、 2為鑒定陽性的重組Bacmid。圖2為重組Bacmid誘導(dǎo)表達(dá)及其純化的SDS-PAGE圖譜。其中1.重組質(zhì)粒感染的sf-9全細(xì)胞裂解物;2.上清上Nickel柱后穿透峰；3.用20mM Tris-HCl (含有300mMNaCl， 5%甘油，pH8.0)洗下的蛋白；4.用20mM Tris-HCl (含有300mMNaCl 5%甘油，20mM咪唑，pH8.0)洗脫后的蛋白；5-8.用20mMTris-HCl (含有300mMNaCl 5%甘油，250mM咪唑，pH8.0)洗脫下的蛋白。
圖3為純化后的蛋白(BgGSTDl)免疫印跡(Westernblot)鑒定圖。圖4為純化后的蛋白(BgGSTDl)電泳圖。其中，1.用20mM Tris-HCl (含有300mMNaCl， 5%甘油，250mM咪唑，pH8.0)洗脫下的蛋白；2在20mM Tris-HCl (含有300mM NaCl, 5%甘油)中透析后的蛋白。
具體實(shí)施例方式
根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
實(shí)施例l:德國(guó)小蠊總RNA的提取。
取人工飼養(yǎng)的凍存德國(guó)小蠊(來自江蘇省疾病控制中心)，液氮研磨，按照100mg/mLTrizol試劑加入Trizol試劑。提取德國(guó)小蠊總RNA。
實(shí)施例2: PCR擴(kuò)增出德國(guó)小蠊過敏原BgGSTDl的基因并克隆。
將提取出來的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)已發(fā)表的德國(guó)小蠊過敏原BgGSTDl基因序列設(shè)計(jì)引物5'-ATGACCATTGATTTCTATTAC-3，和5，-TCATTTTTGCGTGAGATTATC-3'，用PCR方法(94。C預(yù)變性10分鐘后，94°C30秒，50°C45秒，72°C1分鐘共35個(gè)循環(huán))擴(kuò)增出BgGSTDl基因，并克隆到pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中。涂板過夜培養(yǎng)。篩選陽性菌，抽提質(zhì)粒PCR和測(cè)序鑒定。得到德國(guó)小蠊過敏原BgGSTDl基因，其核苷酸序列如SEQ ID No: 1所示。
實(shí)施例3:德國(guó)小蠊過敏原BgGSTDl桿狀病毒載體pFastBacHTA的構(gòu)建。
將得到的BgGSTDl基因通過EcoR I and Sal I酶切位點(diǎn)克隆到質(zhì)粒pFastBacHTA中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109。篩選出陽性克隆。
實(shí)施例4:重組桿狀病毒質(zhì)粒(Bacmid)的構(gòu)建及其PCR鑒定。
以含有BgGSTDl基因的pFastBacHTA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH10Bac，在DH10Bac菌內(nèi)質(zhì)粒助手的幫助下，BgGSTDl基因可轉(zhuǎn)座到含桿狀病毒基因組的Bacmid大質(zhì)粒上。得到重組Baemid。抽提重組Bacmid， PCR鑒定。結(jié)果見圖1。
實(shí)施例5:重組Bacmid的轉(zhuǎn)化到昆蟲細(xì)胞Sf9。
將PCR鑒定陽性的重組Bacmid，用Cellfectin試劑盒轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9。在HyQ液體培養(yǎng)基中27'C培養(yǎng)7天后。收集上清得到PO病毒。對(duì)上清及細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)鑒定。用His單抗做western blot，發(fā)現(xiàn)在35 50kDa之間有反應(yīng)條帶，表明BgGSTDl蛋白被誘導(dǎo)表達(dá)(圖2)。
實(shí)施例6: PI病毒擴(kuò)增。
PO病毒以感染復(fù)數(shù)0.1感染100mLsf9細(xì)胞(2xl06/1111)，4天收集上清得到PI病毒 (4 dpi)。實(shí)施例7:大規(guī)模感染和純化
PO病毒以感染復(fù)數(shù)為1感染500mLsf9細(xì)胞(2><106/ml)，到細(xì)胞出現(xiàn)腫脹的時(shí)候收集細(xì)胞。超聲裂解細(xì)胞離心得到上清。上Nickel親和柱，用20mM Tris-HCl (含有300mM NaCl, 5%甘油)洗去非特異性結(jié)合蛋白后，改用20mM Tris-HCl (含有300mMNaCl，250mM咪唑，5%甘油)洗脫洗脫下的蛋白即為BgGSTDl蛋白。SEQUENCE LISTING
<110>江蘇省人民醫(yī)院
〈120〉 一種在桿狀病毒一昆蟲表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)德國(guó)小蠊過敏原BgGSTDl蛋白的方法
<130> JPH090301
〈160〉 4
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
〈211〉 648
<212> DNA
<213> 德國(guó)小蠊(German cockroach)
<220>
〈221> CDS 〈222〉 (1).. (648)
<400> 1
acc att gat ttc tat Thr lie Asp Phe Tyr 1 5
ctg ctg gca get aaa Leu Leu Ala Ala Lys 20
aac ctg atg get gga Asn Leu Met Ala Gly 35
cct caa cat aca att Pro Gin His Thr lie 50
gaa age cga get ate Glu Ser Arg Ala lie 65
tac ttg ccc ggc agt get cca tgc cgc tea gtc Tyr Leu Pro Gly Ser Ala Pro Cys Arg Ser Val 10 15
48
get ttt ggg gtt gat eta aac etc aaa gtg act Ala Phe Gly Val Asp Leu Asn Leu Lys Val Thr 25 30
96
gaa cat etc aca cca Glu His Leu Thr Pro 40
gaa ttt ttg aaa atg aat Glu Phe Leu Lys Met Asn 45
144
cct aca ctg aat gat Pro Thr Leu Asn Asp 55
aat ggc ttt tgc Asn Gly Phe Cys 60
etc tgg Leu Trp
192
etc Leu 70
tea tat ttg get Ser Tyr Leu Ala
gac caa tat ggc Asp Gin Tyr Gly 75
3aa gat Lys Asp 80
240<image>image see original document page 9</image>Thr lie Asp Phe Tyr Tyr Leu Pro Gly Ser Ala Pro Cys Arg Ser Val 15 10 15
Leu Leu Ala Ala Lys Ala Phe Gly Val Asp Leu Asn Leu Lys Val Thr 20 25 30
Asn Leu Met Ala Gly Glu His Leu Thr Pro Glu Phe Leu Lys Met Asn 35 40 45
Pro Gin His Thr lie Pro Thr Leu Asn Asp Asn Gly Phe Cys Leu Trp 50 55 60
Glu Ser Arg Ala lie Leu Ser Tyr Leu Ala Asp Gin Tyr Gly Lys Asp 65 70 75 80
Asp Ser Leu Tyr Pro Lys Asp Pro Lys Lys Arg Ala Leu Val Asp Gin 85 90 95
Arg Leu Tyr Phe Asp Leu Gly Thr Leu Tyr Gin Arg Phe Gly Asp Tyr 100 105 110
Tyr Tyr Pro lie Met Phe Ala Lys Ala Ser Pro Asp Ala Glu Lys Met 115 120 125
Lys Lys Leu Glu Glu Ala Tyr Gin Phe Leu Asp Glu Phe Leu Glu Gly 130 135 140
Gin Lys Phe Val Ala Gly Asn Ser Leu Thr lie Ala Asp lie Ala Thr 145 150 155 160
lie Ala Ser Val Ser Thr Ala Ala lie Leu Gly Phe Asp lie Thr Arg 165 170 175Tyr Pro Asn Val Asn Lys Trp Phe Glu Asn Ala Lys Lys Val lie Pro 180 185 190
Gly Tyr Asp Glu Leu Asn His Ser Gly Cys Leu Glu Phe Lys Lys Met 195 200 205
Trp Asp Asn Leu Thr Gin Lys 210 215
<210> 3
〈211〉 21
<212> 腿
〈213> Artificial
〈220〉
〈223〉根據(jù)已發(fā)表的德國(guó)小蠊過敏原BgGSTDl基因序列設(shè)計(jì)引物
〈400〉 3
atgaccattg atttctatta c
〈210〉 4
〈211〉 21
〈212〉 DNA
<213〉 Artificial
<220>
〈223〉根據(jù)已發(fā)表的德國(guó)小蠊過敏原BgGSTDl基因序列設(shè)計(jì)引物
〈400〉 4
tcatttttgc gtgagattat c
權(quán)利要求
1、一種在桿狀病毒-昆蟲表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)德國(guó)小蠊過敏原BgGSTD1蛋白的方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)從德國(guó)小蠊組織提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過PCR方法獲得德國(guó)小蠊過敏原BgGSTD1編碼基因；(2)將該編碼基因克隆到桿狀病毒載體中，轉(zhuǎn)化昆蟲細(xì)胞以表達(dá)BgGSTD1蛋白；(3)采用親和層析方法對(duì)BgGSTD1蛋白進(jìn)行純化，從而到德國(guó)小蠊過敏原BgGSTD1蛋白。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的在桿狀病毒一昆蟲表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)德國(guó)小蠊過敏原 BgGSTDl蛋白的方法，其特征在于步驟(1)中，所述的BgGSTDl編碼基因如SEQ ID No:l所示。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的在桿狀病毒一昆蟲表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)德國(guó)小蠊過敏原BgGSTDl 蛋白的方法，其特征在于步驟(1)中，所述的BgGSTDl編碼基因，其所編碼的氨基酸 序列如SEQIDNo:2所示。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的在桿狀病毒一昆蟲表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)德國(guó)小蠊過敏原BgGSTDl 蛋白的方法，其特征在于步驟(2)中，所述的桿狀病毒載體為/7^w詔"c//7^。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的在桿狀病毒—昆蟲表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)德國(guó)小蠊過敏原BgGSTDl 蛋白的方法，其特征在于步驟(2)中，所述的昆蟲細(xì)胞為#-9細(xì)胞。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的在桿狀病毒一昆蟲表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)德國(guó)小蠊過敏原BgGSTDl 蛋白的方法，其特征在于步驟(3)中，所述的親和層析方法為Nickel親和層析法。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的在桿狀病毒一昆蟲表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)德國(guó)小蠊過敏原 BgGSTDl蛋白的方法，其特征在于所述的Nickel親和層析具體包括如下步驟P0病毒 以感染復(fù)數(shù)為l感染500mLsf9細(xì)胞，其細(xì)胞密度為2xl06/ml，到細(xì)胞出現(xiàn)腫脹的時(shí)候 收集細(xì)胞，超聲裂解細(xì)胞，離心得到上清，上Nickel親和柱，用20mMTris-HCl洗去非 特異性結(jié)合蛋白，該Tris-HCl含有300mM NaCl和5%甘油，之后改用20mM Tris-HCl 洗脫，該Tris-HCl含有300mM NaCl、 250mM咪唑和5%甘油，洗脫下的蛋白即為 BgGSTDl蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種在桿狀病毒—昆蟲表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)德國(guó)小蠊過敏原BgGSTD1蛋白的方法從德國(guó)小蠊組織提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過PCR方法獲得德國(guó)小蠊過敏原BgGSTD1編碼基因；將該編碼基因克隆到桿狀病毒載體中，轉(zhuǎn)化昆蟲細(xì)胞以表達(dá)；采用親和層析方法進(jìn)行純化，從而到德國(guó)小蠊過敏原BgGSTD1蛋白。本發(fā)明方法通過桿狀病毒—昆蟲表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)德國(guó)小蠊過敏原BgGSTD1蛋白，從而避免在不同的表達(dá)系統(tǒng)中(例如細(xì)菌和酵母菌)對(duì)BgGSTD1過敏原結(jié)構(gòu)造成影響的問題，并提供一種親和層析的方法，解決天然BgGSTD1過敏原純化工藝復(fù)雜的問題。
文檔編號(hào)C12N15/866GK101492693SQ20091002499
公開日2009年7月29日 申請(qǐng)日期2009年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月4日
發(fā)明者何韶衡, 魏繼福 申請(qǐng)人:江蘇省人民醫(yī)院