專利名稱：豬肺炎支原體p97r1基因重組畢赤酵母及表達(dá)蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種豬肺炎支原體P97R1基因重組畢赤酵母及表達(dá)蛋白，屬于生 物蛋白制備技術(shù)領(lǐng)域。特別是涉及豬肺炎支原體P97R1畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建 與表達(dá)方法。帝IJ備的蛋白可用于P97R1研究、試劑盒和基因工程疫苗的研制。
二背景技術(shù)：
豬月巿炎支原體(M[ycop/aswaf/^op"e"附o"/ae， Mz/ )是引起豬氣喘病(MPS) 的病原。后者是豬群中流行最廣、傳播最快、最難凈化的疫病之一。豬肺炎支原 體通過呼吸道傳播，感染呼吸道上皮后導(dǎo)致呼吸道纖毛萎縮、脫落、損壞，上皮 細(xì)胞壞死，降低呼吸道黏膜的免疫功能，引起肺部功能損傷，容易產(chǎn)生其它呼吸 道病原的繼發(fā)感染。據(jù)報道，該病可使豬的飼料轉(zhuǎn)化率降低10%，生長速度降低 12% 15%，出欄時間延長l個月，與胸膜肺炎放線桿菌、豬繁殖與呼吸綜合征 病毒、豬圓環(huán)病毒等混合感染時，情況更為嚴(yán)重，該病一旦爆發(fā)就難以控制，給 養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
目前對該病致病機(jī)理還不十分清楚。在檢測方面，國內(nèi)外已建立了多種血清 學(xué)檢測方法，如免疫瓊擴(kuò)和間接血凝等，但免疫瓊擴(kuò)和間接血凝法存在著靈敏度 不高等問題。由于Mhp與非致病支原體之間存在著交叉反應(yīng)，所以血清學(xué)檢測方 法的研發(fā)困難重重。豬肺炎支原體的黏附因子(P97蛋白)被證明參與豬肺炎支原 體對豬呼吸道黏膜上皮纖毛的黏附，另外，研究發(fā)現(xiàn)豬肺炎支原體感染時P97引 發(fā)的免疫反應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于其他抗原蛋白所引起的免疫反應(yīng)。Hsu等(1998)利用 Tnl000插入誘變產(chǎn)生的不同的重組產(chǎn)物，初步定位了P97的黏附作用部位和抗 原識別表位。免疫印跡顯示，單抗識別的表位在R1，需要至少2.5個5aa重復(fù)基 元。不同重組產(chǎn)物的體外吸附測定表明，Rl區(qū)是直接參與黏附的區(qū)域，Rl區(qū)下 游的序列不起作用。而且與豬體內(nèi)常寄居的其他支原體進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，P97R1 區(qū)高度保守，為肺炎支原體種特異性抗原成份，無交叉反應(yīng)。因此，可以應(yīng)用 P97R1蛋白作為抗原，建立ELISA診斷方法，對于豬支原體肺炎的早期診斷有很 重要的意義。
而目前的研究主要是在大腸桿菌里對其進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)的蛋白大多以融合蛋 白的形式存在，對后續(xù)應(yīng)用可能存在一定的干擾，并且由于大腸桿菌成份的存在， 表達(dá)蛋白需要進(jìn)行煩瑣的純化后才能用于后期的研究。而巴斯德畢赤酵母表達(dá)系 統(tǒng)是近年發(fā)展起來的一種新型真核表達(dá)系統(tǒng)，它既可以進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)，也可進(jìn)行 分泌表達(dá)。據(jù)報道，在酵母表達(dá)系統(tǒng)里表達(dá)結(jié)核分枝桿菌CFP32蛋白與原核表 達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的該蛋白的Western Blotting結(jié)果顯示，酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的該蛋白與抗體的結(jié)合能力更強(qiáng)，而且ELISA結(jié)果也顯示，結(jié)核病人的血清以及接種過 疫苗的健康人的血清與酵母表達(dá)的CFP32蛋白的結(jié)合能力較原核表達(dá)的該蛋白 強(qiáng)。因此，選用了酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)P97R1蛋白具有較好的前景。
三
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
針對上述領(lǐng)域中的缺陷，本發(fā)明提供了一種豬肺炎支原體P97R1基因畢赤 酵母表達(dá)系統(tǒng)，其表達(dá)蛋白純度高、工藝簡單、生物安全度高、成本低廉、易于 生產(chǎn)和應(yīng)用等特點(diǎn)，為進(jìn)一步研究P97蛋白、開發(fā)研制檢測試劑盒和基因工程疫 苗奠定基礎(chǔ)。
技術(shù)方案
本發(fā)明的具體實(shí)施方案如下-
1.豬肺炎支原體P97R1基因重組畢赤酵母GS115/pPICZa-A/P97Rl屬巴斯 德畢赤酵母(i^/^》paWw7;y)，于2009年4月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中 心，菌種保藏號為CCTCCNO:M209071。
上述豬肺炎支原體P97R1基因重組畢赤酵母GS115/pPICZa-A/P97Rl的構(gòu) 建方法，包括
1) 引物設(shè)計
設(shè)計兩條引物，序列為
Pl: 5' ATAGAATTCTTACCTCAGCCGCCAGCAG 3'￡coi I P2: 5' CGCTCTAGAAAGCCATTGGGAAATAG 3' 勘I
2) PCR獲取P97R1目的基因
以P1和P2為引物，豬肺炎支原體JS99株DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；
3) 將獲取的目的基因克隆入pPICZa-A表達(dá)載體并進(jìn)行序列測定
PCR產(chǎn)物和pPICZa-A均用I 、 Wa I雙酶切，T4 DNA連接酶連接， 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化五.co// DH5a，重組表達(dá)質(zhì)粒用￡co/ I 、 J I雙酶切進(jìn)行鑒定陽 性的測序，構(gòu)建正確的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pPICZa-A/P97Rl;
4) 重組畢赤酵母的篩選和鑒定
畢赤酵母GS 115感受態(tài)與Sac I線性化pPICZa-A/P97Rl相混合，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷 的0.2cm電轉(zhuǎn)杯中，置冰上5min， 1.5kV、 25|_iF、 200Q電擊，立即加入lmL預(yù)冷 的lmol/L山梨醇，取200pL涂布于YPDS平板上，28 3(TC培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)，采 用PCR方法分析畢赤酵母轉(zhuǎn)化子，用煮-凍-煮法制備PCR模板，以通用引物 5'-AOX和3'-AOX為引物，其序列分別為5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3' 禾口5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'，進(jìn)行PCR鑒定，篩選到的陽性
4酵母菌即為豬肺炎支原體P97R1基因重組畢赤酵母GS115/pPICZa-A/P97Rl。 上述豬肺炎支原體P97R1基因重組畢赤酵母表達(dá)的蛋白，其制備方法包括 將豬肺炎支原體P97R1基因重組畢赤酵母GS115/pPICZa-A/P97R1接種到 5mL BMGY中，28~30'C 、 200r/min振蕩培養(yǎng)約22h至0"6oo達(dá)至ij2 6時，室溫 3000r/min離心2min，收集菌體重懸于25mL BMMY培養(yǎng)基，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)， 28~30°C、 200 r/min培養(yǎng)72h，期間每24h補(bǔ)加至終濃度體積比為l。/。的甲醇，72h 后，5000r/min離心10min，收集培養(yǎng)液上清，即為獲得的表達(dá)蛋白以可溶形式存 在的上清液。 有益效果
本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)如下
本發(fā)明所獲得的重組表達(dá)蛋白是由基因工程菌株畢赤酵母GS115體外甲醇
誘導(dǎo)表達(dá)后離心后取上清所得，該重組畢赤酵母含重組表達(dá)質(zhì)粒
pPICZa-A/P97Rl。本實(shí)驗(yàn)選用的重組表達(dá)質(zhì)粒為pPICZa-A載體，屬于分泌型載 體，它具有高效可調(diào)控啟動子AOX(醇氧化酶);具有Zeocin抗性篩選標(biāo)記基因， 具有a-因子前導(dǎo)信號序列，能有效地引導(dǎo)外源蛋白分泌到胞外。重組表達(dá)質(zhì)粒 pPICZa-A/P97Rl的表達(dá)式為-5，A0X1-a-factor-P97Rl gene-Zeocin-。 本發(fā)明的技術(shù)方案主要包括以下兩個方面
第一方面構(gòu)建了表達(dá)載體pPICZa-A/P97Rl。根據(jù)GenBank中報道的豬肺炎 支原體P97R1基因序列，參照畢赤酵母偏嗜密碼子自行設(shè)計一對特異性引物， 引物兩端分別加限制性酶切位點(diǎn)五co及I和^fl I及保護(hù)性堿基(Iiwitrogen公司 合成)，下劃線部分為酶切位點(diǎn)。
P1:5' ATAGAATTCTTACCTCAGCCGCCAGCAG 3'五coi I P2:5' CGCTCTAGAAAGCCATTGGGAAATAG 3'扁I 通過PCR獲取P97R1目的基因，將目的基因克隆入pPICZa-A表達(dá)載體， 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZa-A/P97Rl并進(jìn)行序列測定，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母 GS115感受態(tài)細(xì)胞，PCR鑒定陽性的質(zhì)粒即為重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZa-A/P97Rl。
第二方面通過重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZa-A/P97Rl體外誘導(dǎo)表達(dá)P97R1蛋白，經(jīng) 過SDS-PAGE電泳以及Western Blotting進(jìn)行鑒定，證明該蛋白具有良好的抗原 性，能特異性地與豬肺炎支原體陽性血清進(jìn)行結(jié)合，后再對表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化， 提高表達(dá)量，用分光光度法測定蛋白濃度可達(dá)499pg/mL。
本發(fā)明選取的目的基因長度為253bp，表達(dá)載體pPICZa-A/P97Rl構(gòu)建容易； 其次，pPICZa-A/P97Rl的表達(dá)產(chǎn)物具有良好的抗原性；第三，其表達(dá)產(chǎn)物都分 泌于上清液中，而畢赤酵母自身分泌的蛋白非常少，十分有利于純化；第四，純 化的表達(dá)蛋白不需要進(jìn)行蛋白復(fù)性就可使用。因此，本發(fā)明為進(jìn)一步研究豬肺炎支原體P97蛋白、開發(fā)研制檢測試劑盒和 基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。
四

圖1豬肺炎支原體P97R1基因重組畢赤酵母及表達(dá)蛋白技術(shù)路線示意圖 圖2重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZa-A/P97Rl PCR鑒定圖譜
泳道M為DL-2000 Marker;泳道1為重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZa-A/P97Rl PCR 鑒定結(jié)果；泳道2為pPICZa-A載體PCR鑒定結(jié)果。 圖3重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZa-A/P97Rl雙酶切鑒定圖譜
泳道M為DL-2000 Marker;泳道1為重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZa-A/P97Rl I 、 I雙酶切；泳道2為pPICZa-A載體￡coi I 、 Jt6a I雙酶切。 圖4重組畢赤酵母GS115/pPICZa-A/P97Rl的PCR篩選鑒定圖
泳道1為載體質(zhì)粒pPICZa-A電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115的克??；泳道2為重組 表達(dá)質(zhì)粒pPICZa-A/P97Rl電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSU5的陽性克隆；泳道M為 DL-2000 Marker。
圖5重組畢赤酵母GSl 15/pPICZa-A/P97Rl表達(dá)的SDS-PAGE圖譜
泳道l、 2、 3、 4分別為重組畢赤酵母GS115/pPICZa-A/P97Rl的4個克隆
誘導(dǎo)72h后離心取得上清；泳道5為畢赤酵母GSl 15/pPICZa-A誘導(dǎo)72h后離心
取得上清；泳道M蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖6表達(dá)蛋白的Western Blotting鑒定圖
泳道M蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1為畢赤酵母GS115/pPICZa-A誘導(dǎo)72h后
離心取得上清；泳道2為重組畢赤酵母GS115/pPICZa-A/P97Rl誘導(dǎo)72h后離心
取得上清。
五具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。
1. 引物設(shè)計
根據(jù)GenBank中報道的豬肺炎支原體P97R1基因序列(AE017243)，參照 畢赤酵母偏嗜密碼子設(shè)計兩條引物，由TaKaRa公司合成，引物序列為-Ph 5' ATAGAATTCTTACCTCAGCCGCCAGCAG 3'五coi I P2: 5' CGCTCTAGAAAGCCATTGGGAAATAG 3' 勘I
2. PCR獲取P97R1目的基因
以P1和P2為引物，豬肺炎支原體JS99株(國家獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心) DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系(25|iL): 10xPCR Buffer 2.5|iL ， MgCl2(25mmol/L)2.0|aL， dNTP( 1 Ommol/L) 1 .OpL，引物P 1 、 P2(20pmol/L)各0.25nL，
6ragTM0.25pL，模板0.25pL， ddH20 18.5^L (均購于TaKaRa公司)?；靹?，瞬間 離心，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為95'C預(yù)變性5min后，按94'C 30s， 52°C 30s， 72°C 30s循環(huán)30次，再于72。C延伸10min。取10pL PCR產(chǎn)物于質(zhì)量比1.5。/。TAE瓊 脂糖凝膠中電泳，切下目的片段，用小量膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
3. 將獲取的目的基因克隆入pPICZa-A表達(dá)載體并進(jìn)行序列測定
PCR產(chǎn)物和pPICZa陽A (InvirtrogenTM life technologies)均用五coi I 、 I 雙酶切，T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化￡.co//DH5a (寶生物工程(大連)有 限公司)，重組表達(dá)質(zhì)粒用上述PCR反應(yīng)條件進(jìn)行鑒定，瓊脂糖凝膠電泳可以 看見一條約271bp (含目的基因、酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基)的條帶出現(xiàn)(圖2)， 用￡coiU 、 Wal雙酶切進(jìn)行鑒定，37'C水浴2h，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可以 看到一條約271bp的條帶出現(xiàn)(圖3)。鑒定陽性的質(zhì)粒送Invitrogen上海分公司 測序(見序列表SEQ ID NO.l)。構(gòu)建正確的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為 pPICZa-A/P97Rl 。
4. 重組畢赤酵母菌株的篩選和鑒定
畢赤酵母GS115感受態(tài)(Invirtrogen life technologies) (80pL)與SacI (TaKaRa公司)線性化pPICZa-A/P97Rl(5嗎)相混合，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的0.2cm電轉(zhuǎn) 杯(Bio-Rad)中，置冰上5min， 1.5kV、25pF、200Q電擊，立即加入lmL預(yù)冷的lmol/L 山梨醇，取200(aL涂布于YPDS平板(按照Pichia Expression Kit配制)上，28-30°C 培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)。詳細(xì)步驟參照PichiaExpressionKit。采用PCR方法分析畢赤 酵母轉(zhuǎn)化子，用煮-凍-煮法制備PCR模板，以通用引物5AOX和3AOX為引物，其 序列分別為5: GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'，和5' -GCAAATGGCATTC TGACATCC -3'反應(yīng)體系(20(aL): 2xPCR Mix 10pL,引物P1、 P2(20pmol/L)各 0.25pL，模板2.5nL， ddH20 7pL?；靹颍查g離心，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反 應(yīng)條件為94。C預(yù)變性4min后，按94'C lmin, 55°C lmin， 72'C lmin，循環(huán)30次， 再于72。C延伸10min。取10pl PCR產(chǎn)物于質(zhì)量比P/QTAE瓊脂糖凝膠中電泳，可見 擴(kuò)增到目的條帶786bp (見圖4)。
將篩選到的陽性酵母菌接種到5mL BMGY(按照Pichia Expression Kit配制) 中，28~30°C 、 200r/min振蕩培養(yǎng)約22h至OD6QQ達(dá)到2~6，室溫3000r/min離心 2min，收集菌體重懸于25mL BMMY培養(yǎng)基(按照Pichia Expression Kit配制)， 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。28~30°C、 200r/min培養(yǎng)72h，期間每24h補(bǔ)加至終濃度體積比 為1%的甲醇。72h后，5000r/min離心10min，收集培養(yǎng)液上清。培養(yǎng)上清進(jìn)行 SDS-PAGE電泳鑒定，約10KDa的表達(dá)蛋白以可溶形式存在于表達(dá)上清中(見 圖5)。然后再對重組菌株和表達(dá)條件進(jìn)行篩選和優(yōu)化，提高表達(dá)量，用分光光 度法測定蛋白濃度可達(dá)499|ag/mL。
5. 表達(dá)蛋白的Western Blotting鑒定將表達(dá)蛋白同上進(jìn)行SDS-PAGE電泳后進(jìn)行Western Blotting,以豬肺炎支 原體陽性血清(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG (武漢博 士德公司)為二抗，用DAB顯色試劑盒(武漢博士德公司)顯色，在醋酸纖維 素膜上可見到約10KDa的目的條帶(見圖6)，推導(dǎo)的氨基酸序列見SEQ ID N0.2。 Western Blotting鑒定證明表達(dá)的豬肺炎支原體P97R1蛋白具有良好的免疫反應(yīng) 性，能特異性地與豬肺炎支原體陽性血清進(jìn)行結(jié)合。因此，本發(fā)明為進(jìn)一步研究 P97蛋白、開發(fā)研制檢測試劑盒和基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。序列表
<110>江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
〈120〉豬肺炎支原體P97R1基因重組畢赤酵母及表達(dá)蛋白
<130>說明書
〈140〉 00
〈141〉 2009-05-05
<歸6
〈170〉 Patentln version 3.1
<210> 1
〈211〉 3790
〈212> DNA
<213>人工構(gòu)建
〈220〉
<221> 重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZ a -A / P97R1
〈222> (1)..(3790) <223>
<400> 1
tccaaagacg3犯ggttg肌tgaaacctttttgccatccgacstccacag60
gtccattctc3C3cataagtgccaaacgca8C3gg郷ggatacactagcagcagaccgt120
tgca犯cgc3ggacctccsctcctcttctcctcaacacccacttttgccatcgaa犯acc180
agcccagttaUgggcttgettaggct8Cta240
acaccatgactttattagcctgtctatcctggcccccctggcg兆gttcatgtttgttta300
tttccg3atgcaacaagctccgcattacacCCg犯C3tC3ctccag3tgagggctttctg360
agtgtggggtcaaatagtttcatgttcccc犯3tggCCC3aaactgacagtttaaacgct420
gtcttggaacctaatatgacaaaagcgtgatctcatccaagatgaact肌gtttggttcg480
ttgaaatgctaacggccagtg幼acttccataccgtttgt540
cttgtttggtattgattgacg犯tgctcaa3tt犯tgCttagcgcagtct600
ctctatcgcttctg犯ccccggtgc獄tgtgccg犯acgca肌tggggaaacacccgct660
ttttggatgattatgcattgtctccacattgtatgcttccaagattctggtggg犯tact720
gctgatagcctaacgttcatgatcaaaatttaactgttctaacccctacttgacagcaat780
ccctgtcttaaacctttttttttatcatcattattagctt840
actttcataattgcgsctggttccaattgacaagcttttgattttaacgactttt犯cga900
C38Ctttgagaagatca肌aaacaac taattattcga犯cgatgagatttccttcaattt960
ttactgctgttttattcgcagcatcctccgcattagctgctcc兆tcaacactac犯cag1020
ggcacaaattccggctg卿ctgtcatcggttactc3gatttsg卿ggg1080
atttcgatgttgctgtmgccattttccataacgggttattgttteitaa1140
atactactattgCC3gC3ttgctgctaaag卿卿gggtatctctcgag■
ctgaagctgaattcttacctcagccgccagcagctaaacctg肌gcagca幼accagtag1260
cagcts犯cctgaagcagcaaaaccagtagcagctaaacc1320
cagctaaacctg肌gC3gC8cggcta犯ccaaaccagtag畫
cagctaaaccagttgctactctaatactggcttttcactt1440
ctatttcccaatggctttctctcatctcagELELgglggaitCt1500
g肌tegcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattgagtttgtsgccttagacatgactg1560
ttcctcagttc肌gttgggc3Ctt8cg3ga3gaccggtcttgct3gattct肌tC犯g3g1620
g3tgtC3g犯tgccatttgcctg卿gatgcaggcttcatttttgatacttttttatttg1680taacctatat agtataggat tttttttgtc attttgtttc ttctcgtacg agcttgctcc 1740
tgatcagcct atctcgcagc tgatgaatat cttgtggtag gggtttggga aaatcattcg 1800
agtttgatgt ttttcttggt atttcccELCt cctcttcaga gtacagaaga ttaagtgaga I860
ccttcgtttg tgcggatccc ccacacacca tagcttc犯a atgtttctac tcctttttta 1920
ctcttccaga ttttctcgga ctccgcgcat cgccgtacca cttcaaaaca cccaagcaca 1980
gcatactaaa ttttccctct ttcttcctct agggtgtcgt taattacccg tactaaaggt 2040
ttgga肌ag8L aaaaagagac cgcctcgttt ctttttcttc gtcg犯aaag gcaataaaaa 2100
tttttatcac gtttcttttt cttgaaattt ttttttttag tttttttctc tttcagtgac 2160
ctccattgat atttaagtta ataaacggtc ttcaatttct caagtttcag tttcattttt 2220
cttgttctat tacaactttt tttacttctt gttcattaga犯ga犯gcat agcaatctaa 2280
tctaaggggc ggtgttgaca attaatcatc ggcatagtat atcggcatag tataatacga 2340
caaggtgagg aactaaacca tggccaagtt gaccagtgcc gttccggtgc tcaccgcgcg 2400
cgacgtcgcc ggagcggtcg agttctggac cgaccggctc gggttctccc gggacttcgt 2460
ggaggacgac ttcgccggtg tggtccggga cgacgtgacc ctgttcatca gcgcggtcca 2520
ggaccaggtg gtgccggaca acaccctggc ctgggtgtgg gtgcgcggcc tggacgagct 2580
gtacgccgag tggtcggagg tcgtgtccac gaacttccgg gacgcctccg ggccggccat 2640
gaccgagatc ggcgagcagc cgtgggggcg ggagttcgcc ctgcgcgacc cggccggcaa 2700
ctgcgtgcac ttcgtggccg aggagcagga ctgacacgtc cgacggcggc ccacgggtcc 2760
caggcctcgg agatccgtcc cccttttcct ttgtcgatat catgtaatta gttatgtcac 2820
gcttacattc acgccctccc cccacatccg ctctaaccga aaaggaagga gttagacaac 2880
ctgaagtcta ggtccctatt tattttttta tagttatgtt agtattaaga acgttattta 2940
tatttcaaat ttttcttttt tttctgtaca gacgcgtgta cgcatgtaac attatactga 3000
aaaccttgct tgagaaggtt ttgggacgct cgaaggcttt aatttgcaag ctggagacca 3060
acatgtgagc肌犯ggccag c犯犯ggcca ggaaccgtaa犯8ggccgcg ttgctggcgt 3120
ttt"tccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 3180
ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc 3240
gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctx ccttcgggaa 3300
gcgtggcgct ttctcaatgc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct 3360
ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta 3420
actatcgtct tgagtcc犯c ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 3480
g加c鄉(xiāng)3t tsgcag柳g aggtetgtag gcggtgctac卿gttcttg 3agtggtggc 3540
ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg犯gccagtta 3600
ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 3660
gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa g犯gatcctt 3720
tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacga犯a ctcacgtt犯gggattttgg 3780
tcatgagatc 3790 〈210> 2 〈211〉 87 <212〉 PRT
〈213〉重組酵母分泌表達(dá) 〈220〉
〈221〉分泌表達(dá)蛋白P97 Rl 〈222〉 (l).. (87) 〈223〉 〈400> 2Glu Phe Leu 1
Val Ala Ala
Ala Ala Lys 35
Ala Lys Pro 50
Asn Thr Asn 65
Asp Tyr Phe
Pro Gin 5
Lys Pro 20
Pro Val
Glu Ala Ala Lys 55 Gly
Thr Asn Thr 70
Pro Met Ala 85
Pro Pro Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro
10 15 Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu
25 30 Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala 40 45 Pro Val Ala Ala Lys Pro Val Ala Thr 60
Phe Ser Leu Thr Asn Lys Pro Lys Glu 75 80
Phe
<210> <211> <212〉 <213> <220> <221> <222〉 <223> <400>
3
28 DNA人工合成
P97R1 PCR引物Pl (l).. (28)
3
atagaattct tacctcagcc gccagcag 〈210> 4 26 DNA
人工合成
28
<211> <212> <213> <220> 〈221〉 <222> <223〉 <400〉
P97R1 PCR引物P2 (l).. (26)
4
cgctctsgaB agccsttggg 3肌t3g <210> 5 21 DNA
人工合成26
〈211> <212> <213〉 <220〉 <221> 〈222> <223> <400>
引物5'A0X (l).. (21)
5
g3CtggttCC a3ttg3C犯g c
〈210〉 6 <211> 21 〈212> DNA
21<213〉人工合成 〈220〉
<221〉 引物3'A0X
<222〉 (l).,咖 <223〉
〈400〉 6
gcaaatggca ttctgacatc c 2權(quán)利要求
1.豬肺炎支原體P97R1基因重組畢赤酵母，該重組畢赤酵母GS115/pPICZα-A/P97R1屬巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)，于2009年4月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏號為CCTCC NOM209071。
2. 權(quán)利要求1所述豬肺炎支原體P97R1基因畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括:1) 引物設(shè)計 設(shè)計兩條引物，序列為Ph 5' ATAGAATTCTTACCTCAGCCGCCAGCAG 3'￡coi I P2: 5' CGCTCTAGAAAGCCATTGGGAAATAG 3' H2) PCR獲取P97R1目的基因以P1和P2為引物，豬肺炎支原體JS99株DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3) 將P97R1目的基因克隆入pPICZa-A表達(dá)載體PCR產(chǎn)物和pPICZa-A均用五co及I 、 Wfl I雙酶切，T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化五.co/z' DH5a，對用五coi I 、 I雙酶切進(jìn)行鑒定陽性的重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行測 序，測序結(jié)果見SEQIDNO.l,構(gòu)建正確的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pPICZa-A/P97Rl;4) 重組畢赤酵母菌株的篩選和鑒定畢赤酵母GS115感受態(tài)與S"cI線性化的pPICZa-A/P97Rl相混合，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的 0.2cm電轉(zhuǎn)杯中，置冰上5min， 1.5kV、 25pF、 200Q電擊，立即加入lmL預(yù)冷的lmol/L 山梨醇，取200pL涂布于YPDS平板上，28-3(TC培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)，采用PCR方法分析 畢赤酵母轉(zhuǎn)化子，用煮-凍-煮法制備PCR模板，以通用引物5'AOX和3'AOX為引物，其 序歹iJ分別為5' -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'禾口5:GCAAATGGCATTCTGA CATCC-3'，進(jìn)行PCR鑒定，篩選到的陽性酵母菌即為豬肺炎支原體P97R1基因重組畢 赤酵母GS115/pPICZa-A/P97Rl 。
3. 權(quán)利要求1或2所述豬肺炎支原體P97R1基因重組畢赤酵母表達(dá)的蛋白。
4. 權(quán)利要求3所述表達(dá)蛋白的制備方法，包括將豬肺炎支原體P97R1基因重組畢赤酵母GS115/pPICZa-A/P97Rl接種到5mL BMGY中，28~30°C、 200r/min振蕩培養(yǎng)約22h至OD6oo達(dá)到2 6時，室溫3000r/min離心 2min,收集菌體重懸于25mL BMMY培養(yǎng)基，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，28~30°C、 200r/min培養(yǎng) 72h，期間每24h補(bǔ)加至終濃度體積比為P/。的甲醇，72h后，5000r/min離心10min，收集 培養(yǎng)液上清，即為獲得的表達(dá)蛋白以可溶形式存在的上清液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬肺炎支原體P97R1基因重組畢赤酵母及表達(dá)蛋白，涉及生物蛋白制備領(lǐng)域。主要經(jīng)基因的獲得、表達(dá)載體的構(gòu)建、目的蛋白的表達(dá)。利用PCR方法用設(shè)計的引物從豬肺炎支原體基因組DNA中擴(kuò)增獲得目的基因，再經(jīng)酶切和連接克隆入酵母表達(dá)載體pPICZα-A，構(gòu)建成分泌型重組酵母表達(dá)載體pPICZα-A/P97R1，pPICZα-A/P97R1經(jīng)Sac I酶切線性化后電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母菌株GS115。重組的畢赤酵母經(jīng)甲醇誘導(dǎo)分泌表達(dá)P97R1蛋白。該方法制備的豬肺炎支原體P97R1蛋白較純，且具有良好的免疫反應(yīng)性，可用于豬肺炎支原體P97蛋白的研究、豬肺炎支原體免疫檢測試劑盒和基因工程疫苗的研制。
文檔編號C12P21/02GK101565680SQ200910027159
公開日2009年10月28日 申請日期2009年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月22日
發(fā)明者馮志新, 劉茂軍, 吳敘蘇, 王海燕, 源 甘, 祝永琴, 邵國青 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院