專利名稱：一種鑒定單核苷酸多態(tài)性等位位點比例的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鑒定單核苷酸多態(tài)性等位位點比例的方法，尤其涉及一種 鑒定已知SNP等位位點比例的方法。
背景技術(shù)：
單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism,簡稱SNP)主要是指 在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DM序列多態(tài)性。它是人類可遺 傳的變異中最常見的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類基因組中 廣泛存在，平均每500 1000個堿基對中就有1個，估計其總數(shù)可達300萬個 甚至更多。
SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉(zhuǎn) 換(transition)或顛換(transversion)所引起，也可由堿基的插入或缺失所致， 但通常所說的SNP并不包括后兩種情況。
理論上講，SNP既可能是二等位多態(tài)性，也可能是3個或4個等位多態(tài)性， 但實際上，后兩者非常少見，幾乎可以忽略，因此，通常所說的SNP都是二等 位多態(tài)性的。這種變異可能是轉(zhuǎn)換，也可能是顛換，所謂轉(zhuǎn)換是指同型堿基之 間的轉(zhuǎn)換，如嘌呤與嘌呤(G—A)、嘧腔與嘧啶(T—C)間的替換；所謂顛換是指 發(fā)生在嘌呤與嘧啶(A—T、 A—C、 C—G、 G—T)之間的替換。
人們對SNP的研究方法進行了許多探索和改進。SNP分析技術(shù)按其研究對象 主要分為兩大類，即
(1) 對未知SNP進行分析，即找尋未知的SNP或確定某一未知SNP與某種疾病 的關(guān)系。檢測未知SNP有許多種方法可以使用，如溫度梯度凝膠電泳(TGGE)、 變性梯度凝膠電泳(DGGE)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、變性的高效液相色譜檢測 (DHPLC)、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)，以及DNA 直接測序等。
(2) 對已知SNP進行分析，即對不同個體DNA中已知SNP的堿基形式直接進行 檢測以探討與疾病的關(guān)系。檢測已知SNP的方法有等位基因特異寡核苷酸片段分析(AS0)、突變錯配擴增檢驗(MAMA)、基因芯片技術(shù)(gene chips)等。
隨著人類基因組計劃的的實施，許多物種也開展了基因組的測序工作，并 建立了大量數(shù)據(jù)庫，比較這些來自不同實驗室不同個體的序列，就可以發(fā)現(xiàn)SNP。 目前，可供利用的公開SNP網(wǎng)上資源主要包括
(1) 由美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health, NIH)提供的主 要是與癌癥和腫瘤相關(guān)的候選SNP數(shù)據(jù)庫http:〃cgap. nci. nih. gov/GAI;
(2) 由NIH開辟的適于生物醫(yī)學(xué)研究的dbSNP多態(tài)性數(shù)據(jù) http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov/SNPi
(3) 德國的HGBAS網(wǎng)站提供的人類SNP數(shù)據(jù)庫hUp:〃hgbas.Cgr.ki. sei等。 另外，日本建立了 J STSNP數(shù)據(jù)庫http:〃snp. Ims.utolkyo.ac.jp;我國也 于2001年底啟動了 "863"計劃，進行中華民族基因組SNP系統(tǒng)目錄的構(gòu)建與 研究。
研究者可從各種SNP數(shù)據(jù)庫中選擇自己感興趣的SNP,采用現(xiàn)在建立的各種 成熟的鑒別已知SNP的技術(shù)對其中的堿基形式做出鑒定，以上工作無論對基礎(chǔ) 研究還是臨床檢測均具有重大意義。但現(xiàn)在SNP檢測中面臨一個棘手的問題就 是常規(guī)的SNP鑒定方法可以鑒定等位位點的類型，但這些方法大多不能鑒定出 SNP位點2種堿基之間的比例關(guān)系。而鑒定出SNP位點2種堿基之間的比例關(guān)系 對某些疾病的研究意義重大。
例如染色體異常，如21三體，18三體等染色體數(shù)目異常是一類嚴重影響人 類健康的疾病，在產(chǎn)前對它們作出診斷，特別是采用非創(chuàng)傷性手段作出診斷是 世界各國普遍關(guān)注的問題。利用SNP作為遺傳標記，可以對這類染色體數(shù)目異 常疾病作出診斷。不同于正常個體的是21三體，18三體等疾病SNP等位位點 2種堿基的比例不是1: l的關(guān)系，而可能是l: 2或2: l的關(guān)系，因此就涉及 到鑒別DNA或RNA序列中SNP等位位點2種堿基比例(allelic ratio)的問題。
針對以上難題，Pont-Kingdon等報道了利用熒光標記探針雜交結(jié)合融解曲 線來確定2種堿基之間的相對比例的方法(參見Clin Chem. 2003; 49(7) :1087-94. )， Lo YM等報道采用時間飛行質(zhì)譜儀來確定2種堿基之間的相 對比例的方法(參見Nat Med. 2007; 13(2) :218-23. ), GoAT等報道采用部分 變性高效液相色譜來確定2種堿基之間的相對比例的方法(參見Clin Chem.2008:54(2) :437-40.)。但以上方法需要昂貴的設(shè)備，實驗條件難以控制，無法 推廣至臨床應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種鑒定單核苷酸多態(tài)性等位位點比例的方法，降低對 設(shè)備的要求，降低成本，使鑒定易實現(xiàn)，適合于普通的科研單位和臨床醫(yī)院使 用。
為達到上述目的，本發(fā)明具體技術(shù)方案是， 一種鑒定單核苷酸多態(tài)性等位 位點比例的方法，包括以下步驟
(1) 提取待測的含SNP的DNA或RNA,如果為RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,得 到含SNP的擴增模板；DM或RNA可來源人和動、植物的各種組織、細胞、體液；
(2) 以步驟(1)所得的含SNP的DNA或cDM作為擴增模板，單核苷酸多態(tài)性等 位位點中含有2種堿基，根據(jù)其中1種堿基設(shè)計擴增所需的上游引物A,上游引 物A的5'端最后1位堿基用第1熒光基團修飾；根據(jù)其中另1種堿基設(shè)計擴增 所需的上游引物B，上游引物B的5'端最后1位堿基用第2熒光基團修飾；根 據(jù)單核苷酸多態(tài)性等位位點的位置設(shè)計下游引物C，下游引物C共用；上游引物 A和上游引物B的3'端最后1位堿基均用硫修飾；
采用3'端堿基特異性聚合酶鏈反應(yīng)分別擴增出SNP中含2種堿基的核酸片 段，反應(yīng)所用的酶為具有3'-5'外切酶校正活性的髙保真聚合酶，擴增完成后， 去除含熒光的游離引物，得到含熒光的擴增產(chǎn)物
所述第l熒光基團和第2熒光基團在光譜中激發(fā)峰的位置互相分離
(3) 利用熒光分光光度計分析含熒光的擴增產(chǎn)物，根據(jù)熒光光譜激發(fā)峰的位置 和強度計算對應(yīng)擴增產(chǎn)物的比例，從而判斷SNP等位位點比例，判斷規(guī)則如下
如果僅在第1熒光或第2熒光激發(fā)光譜位置出現(xiàn)單一峰，說明SNP位點純
合；
如果在第l熒光和第2熒光激發(fā)光譜位置上出現(xiàn)2個峰，且強度基本相等， 說明SNP等位位點比例為1: 1;
如果在第l熒光和第2熒光激發(fā)光譜位置上出現(xiàn)2個峰，強度相比為l: n 或n: 1,說明單核苷酸多態(tài)性等位位點比例為1: n或n: 1;其中n=2、 3或4。
5上述技術(shù)方案中，提取DNA或RM,將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,根據(jù)SNP等位 位點的2個堿基設(shè)計擴增所需的上游引物和下游引物的方法，在引物上修飾硫 或者熒光基團屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員公知技術(shù)。
上述技術(shù)方案中，第1熒光基團和第2熒光基團光譜中激發(fā)峰的位置不能 相同，可分別選自不同顏色的熒光基團，如綠色熒光基團FAM、 J0E等和紅色熒 光基團R0X、 TAMRA等，這樣可以根據(jù)熒光光譜激發(fā)峰的位置和強度來鑒定等位 位點的比例，本發(fā)明所述的第1熒光基團和第2熒光基團不限于以上綠色或紅 色熒光基團。
由于上述技術(shù)方案的應(yīng)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點 本發(fā)明在PCR擴增中，設(shè)計上下游引物時， 一方面利用"分子開關(guān)"機制， 在設(shè)計檢測SNP引物時，采用硫修飾，結(jié)合髙保真酶，可保證2種堿基擴增的 特異性，為進一步檢測奠定了基礎(chǔ)；另一方面分別用不同的熒光基團對2種上 游引物作了修飾，并且創(chuàng)造性地采用普通的熒光分光光度計鑒定單核苷酸多態(tài) 性等位位點形式和比例，價格低廉，且操作簡便，結(jié)果穩(wěn)定，適合于普通的科 研單位和臨床醫(yī)院使用，具有較大的推廣價值和應(yīng)用前景。


圖l.實施例所得擴增產(chǎn)物的熒光光譜圖(SNP等位位點G:G純合)； 圖2.實施例所得擴增產(chǎn)物的熒光光譜圖(SNP等位位點雜合比例為1: 1); 圖3.實施例所得擴增產(chǎn)物的熒光光譜圖(SNP等位位點雜合比例為1: 2或 2: 1)。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述，但并不限制本發(fā)明的使用
范圍
以下所附實施例均以人PLAC4基因上的一個SNP rs8130833為鑒定對象， 分別說明鑒定DNA和RM上SNP的使用，PLAC4基因位于21號染色體，處于唐 氏綜合征發(fā)生的關(guān)鍵區(qū)，在胎盤組織中特異表達RNA。
rs8130833等位位點中2種堿基分別為A和G，對其等位位點比例的鑒定有助于唐氏綜合征的診斷。
實施例一鑒定羊水細胞DNA中rs8130833等位位點A和G比例
(1) 羊水細胞DNA提取
取1. 5ml羊水標本于微量離心管中，離心5分鐘，去上清液，沉淀用TE 緩沖液洗一次。細胞沉淀中加50u 1裂解液(O. Immol/LNaOH, 2mol / L NaCl) 重懸，振蕩裂解。100'C煮沸2分鐘，再次振蕩。離心10分鐘去細胞碎片，取5 ul上清液作基因擴增。
(2) 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增包含SNP位點的DNA片段 采用單堿基延伸反應(yīng)擴增，為保證擴增的準確性，引入"分子開關(guān)"機制，
擴增A的上游引物為5'CACCATTTGGGTTAAATACAAGTTAGAT3', 5'端最后1位堿 基C用綠色熒光基團FAM修飾，擴增G的上游引物為 5'ACCATTTGGGTTAAATACAAGTTAGAC3' , 5'端最后1位堿基A用紅色熒光基團ROX 修飾，2條引物的3'最后1位堿基T和C均用硫修飾，下游引物共用，序列為 5，-CCATAAAAGCCTGTACATAAGGGATCT-3,。
PCR反應(yīng)體系為總反應(yīng)體積為25ii l,內(nèi)含IO倍反應(yīng)緩沖液2.5u l，dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP各200uM， 2條上游引物和1條下游引物各25pmol,硫酸鎂 為2 mM，羊水細胞DM提取液5y 1, 0. 5活性單位的高保真DNA聚合酶。反應(yīng) 條件為95'C預(yù)變性5分鐘，然后95tM0秒，601C30秒，72'C30秒經(jīng)35個循環(huán) 擴增。
(3) 擴增產(chǎn)物的純化
采用上海生工公司的UNIQ-10柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化擴增產(chǎn)物，去 除多余的引物等。
(4) 熒光光譜分析
將純化的擴增產(chǎn)物，用水稀釋至500iil，采用日立F4500熒光分光光度計 測定產(chǎn)物的激發(fā)光譜的位置和強度，綠色熒光基團FAM的激發(fā)光譜波長為520nm, 紅色熒光基團ROX的激發(fā)光譜波長為605mn,激發(fā)峰的強度反映了 A和G兩種擴 增產(chǎn)物量的關(guān)系。
如圖1所示，僅在605nm附近出現(xiàn)1個激發(fā)峰，表明SNP等位位點G:G純 合(同理可鑒定出A:A純合)；
7如圖2所示，在520n邁和605nm附近出現(xiàn)2個激發(fā)峰，且高度基本相等， 表明SNP等位位點雜合比例為1: l的關(guān)系；
如圖3所示，當2個激發(fā)峰的高度為1: 2或2: l時，表明SNP等位位點 雜合比例為1: 2或2: 1。
實施例二鑒定胎盤組織RNA中rs8130833等位位點A和G比例 (1)胎盤組織RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄
取約100mg新鮮胎盤組織標本，液氮存在下于研缽中磨碎后，采用Trizol 試劑提取總RNA，加25ul含焦磷酸二乙酯(DEPC)處理的水中，然后采用 Invitrogen公司的DNase I去除DNA污染。最后采用上海生工公司的第一鏈cDNA 合成試劑盒經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。
以下步驟同實施例1中的步驟(2)、 (3)、 (4)。
權(quán)利要求
1. 一種鑒定單核苷酸多態(tài)性等位位點比例的方法，其特征在于包括以下步驟(1)制備含待測單核苷酸多態(tài)性的擴增模板，單核苷酸多態(tài)性等位位點中含有2種堿基，根據(jù)其中1種堿基設(shè)計擴增所需的上游引物A，上游引物A的5’端最后1位堿基用第1熒光基團修飾；根據(jù)其中另1種堿基設(shè)計擴增所需的上游引物B，上游引物B的5’端最后1位堿基用第2熒光基團修飾；根據(jù)單核苷酸多態(tài)性等位位點的位置設(shè)計下游引物C，下游引物C共用；上游引物A和上游引物B的3’端最后1位堿基均用硫修飾；采用3’端堿基特異性聚合酶鏈反應(yīng)分別擴增出SNP中含2種堿基的核酸片段，反應(yīng)所用的酶為具有3’-5’外切酶校正活性的高保真聚合酶，擴增完成后，去除含熒光的游離引物，得到含熒光的擴增產(chǎn)物；所述第1熒光基團和第2熒光基團在光譜中激發(fā)峰的位置互相分離；(2)利用熒光分光光度計分析含熒光的擴增產(chǎn)物，根據(jù)熒光激發(fā)光譜的位置和強度計算對應(yīng)擴增產(chǎn)物的種類和比例，判斷單核苷酸多態(tài)性等位位點的比例，判斷規(guī)則如下如果在僅第1熒光或第2熒光激發(fā)光譜位置出現(xiàn)單一峰，說明單核苷酸多態(tài)性等位位點純合；如果在第1熒光和第2熒光激發(fā)光譜位置上出現(xiàn)2個峰，且強度基本相等，說明單核苷酸多態(tài)性等位位點比例為1∶1；如果在第1熒光和第2熒光激發(fā)光譜位置上出現(xiàn)2個峰，2個峰的強度相比為1∶n或n1，說明單核苷酸多態(tài)性等位位點比例為1n或n1；其中n＝2、3或4。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的鑒定單核苷酸多態(tài)性等位位點比例的方法，其特 征在于步驟(l)中制備含待測SNP的擴增模板的方法為提取含待測單核苷酸多態(tài) 性的DNA,即為含待測單核苷酸多態(tài)性的擴增模板。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的鑒定單核苷酸多態(tài)性等位位點比例的方法，其特 征在于-步驟(l)中制備含待測SNP的擴增模板的方法為提取含待測單核苷酸多態(tài) 性的RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，即為含待測單核苷酸多態(tài)性的擴增模板。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒定SNP等位位點形式和比例的方法，在PCR擴增SNP等位位點的2個堿基時，設(shè)計上下游引物中，一方面利用“分子開關(guān)”機制，在設(shè)計檢測SNP引物時，采用硫修飾，結(jié)合高保真酶，可保證2種堿基擴增的特異性，為進一步檢測奠定了基礎(chǔ)；另一方面分別用不同的熒光基團對2種上游引物作了修飾，并且創(chuàng)造性地采用普通的熒光分光光度計鑒定單核苷酸多態(tài)性等位位點形式和比例，價格低廉，且操作簡便，結(jié)果穩(wěn)定，適合于普通的科研單位和臨床醫(yī)院使用，具有較大的推廣價值和應(yīng)用前景。
文檔編號C12Q1/68GK101481734SQ20091002905
公開日2009年7月15日 申請日期2009年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月16日
發(fā)明者斌 朱, 谷 楊 申請人:蘇州大學(xué)