專利名稱：具有高產(chǎn)α-環(huán)糊精能力的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的突變體及突變方法
技術(shù)領(lǐng)域：
具有高產(chǎn)a-環(huán)糊精能力的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的突變體及突變方法，本 發(fā)明屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。具體地說本發(fā)明是利用蛋白質(zhì)工程的定點(diǎn)突 變方法改善環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGT酶)的產(chǎn)物特異性的技術(shù)。
背景技術(shù)：
環(huán)糊精是由六個(gè)以上葡萄糖連結(jié)而成的具有環(huán)狀疏水圓錐形結(jié)構(gòu)的低聚糖 非還原性化合物系列，其中最常用的是a-、 (3-、 Y-環(huán)糊精，它們分別由6、 7、 8 個(gè)葡萄糖單元構(gòu)成。目前，環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)均采用酶法合成，即在CGT酶
催化作用下，通過環(huán)化反應(yīng)轉(zhuǎn)化淀粉及相關(guān)基質(zhì)合成環(huán)糊精。由于環(huán)糊精能與 許多客體分子形成包合物，從而改變客體分子的物理和化學(xué)性質(zhì)如溶解度、穩(wěn) 定性等，因此在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。
CGT酶是一個(gè)多功能型的酶，它能催化四種不同的反應(yīng)三種轉(zhuǎn)糖基化反 應(yīng)(歧化反應(yīng)、環(huán)化反應(yīng)和偶合反應(yīng))和水解反應(yīng)。CGT酶通過環(huán)化反應(yīng)能利用 淀粉生產(chǎn)環(huán)糊精，這是其工業(yè)應(yīng)用的基礎(chǔ)。用CGT酶生產(chǎn)環(huán)糊精一個(gè)主耍的不 利條件是所有己知的野生型CGT酶生產(chǎn)的是a-、 p-、 Y-環(huán)糊精的混合物。這不 僅給產(chǎn)物的分離純化帶來很大不便，而且提高了生產(chǎn)成本。目前，兩種工藝可 以用于從環(huán)糊精混合物中純化單一的環(huán)糊精(3-環(huán)糊精的選擇性結(jié)晶(P-環(huán)糊精 溶解度相對低)和有機(jī)溶劑選擇性絡(luò)合。a-環(huán)糊精一般用癸醇，但這個(gè)化合物 很難從水溶液中去除，因?yàn)槠浞悬c(diǎn)高達(dá)229"C; —般用環(huán)十二酮對Y-環(huán)糊精進(jìn)行 絡(luò)合和選擇性沉淀，但是這個(gè)溶劑對于商業(yè)使用來講太貴，而且，有機(jī)溶劑使 用的不利因素還包括它們的毒性和可燃性以及需要溶劑回收工藝，因此，目前 a-、 Y-環(huán)糊精的利用很大程度上受到限制。即使是P-環(huán)糊精的生產(chǎn)工藝也不是很 理想，因?yàn)閷τ诖蠖鄶?shù)應(yīng)用來講，目前工藝使P-環(huán)糊精的生產(chǎn)成本還是太高。因 此，如果所得到CGT酶所生產(chǎn)的環(huán)糊精中某一種特定的環(huán)糊精比例大大增高， 那么就可以避免上述成本太高和有機(jī)溶劑污染等問題。
本發(fā)明所使用的來源于Peam'6ac/〃M macerara JFB 05-01(CCTCC NO: M 208063)的CGT酶雖然在酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)初期主要生產(chǎn)a-環(huán)糊精，但后期a-環(huán)糊精 的含量偏低，在未使用有機(jī)溶劑的情況下，反應(yīng)混合液中(3-環(huán)糊精的含量甚至高 于ot-環(huán)糊精，因此，進(jìn)一步提高該酶的產(chǎn)a-環(huán)糊精能力對工業(yè)上a-環(huán)糊精的生 產(chǎn)是相對有利的。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供提高P ma^ra/w JFB 05-01 CGT酶產(chǎn)a-環(huán)糊精能
力的突變方案。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提出具有更高a-環(huán)糊精生產(chǎn)能力的突變體酶 D372K， Y89D， Y89R及D372K/Y89R，及其構(gòu)建方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案
來源于軟化類芽孢桿菌(Pe"m'6"c/〃ws wacera似)JFB 05-01的環(huán)糊精葡萄 糖基轉(zhuǎn)移酶，簡稱CGT酶，的三種單突變體酶D372K， Y89D及Y89R:將CGT 酶基因中第372位的天冬氨酸Asp突變成了賴氨酸Lys，命名為D372K;將CGT 酶基因中第89位的酪氨酸Tyr分別突變成了天冬氨酸Asp或精氨酸Arg，分別 命名為Y89D及Y89R;它們相比于野生型CGT酶具有更高的產(chǎn)a-環(huán)糊精能力。
三種單突變體酶D372K， Y89D及Y89R的制備方法，根據(jù)i3 w"ceram JFB 05-01 CGT酶基因序列，分別設(shè)計(jì)并合成引入D372K， Y89D或Y89R突變的引 物，對CGT酶基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，測定DNA序列，分別鑒別出第372位Asp 密碼子變成Lys密碼子，第89位Tyr密碼子分別變成Asp或Arg密碼子的突變 體，并進(jìn)行大腸桿菌表達(dá)。
Z3 macerara JFB 05-01 CGT酶的一種雙突變體酶D372K7Y89R:將單突變體 酶D372K基因中第89位的酪氨酸Tyr突變成了精氨酸Arg，命名為 D372K/Y89R，其相比于野生型CGT酶具有更高的產(chǎn)a-環(huán)糊精能力。
一種雙突變體酶D372K/Y89R的制備方法，以單突變體酶D372K基因?yàn)槟?板，設(shè)計(jì)并合成引入Arg密碼子于89位的定點(diǎn)突變引物，對D372K基因進(jìn)行 定點(diǎn)突變，測定序列，鑒別出89位的Tyr突變成Arg的突變體，并進(jìn)行大腸桿 菌表達(dá)。
所述的突變體酶D372K， Y89D， Y89R及D372K/Y89R的制備 (1)定點(diǎn)突變
單突變體酶D372K， Y89D和Y89R的定點(diǎn)突變利用快速PCR技術(shù)，以
表達(dá)載體c^/pET-20b(+)為模板，
引入D372K密碼子的定點(diǎn)突變引物為
正向引物5'- GACCGGCGATGGCAAACCCAACAACC -3，(下劃線為突變堿基) 反向引物5，- GGTTGTTGGGTTTGCCATCGCCGGTC -3 ，(下劃線為突變堿基)
引入Y89D密碼子的定點(diǎn)突變引物為
正向引物5，- CTCCGTCATCAAGGATTCCGGCGTTA -3，(下劃線為突變堿基) 反向引物5，- TAACGCCGGAATCCTTGATGACGGAG -3，(下劃線為突變堿基)
引入Y89R密碼子的定點(diǎn)突變引物為
正向引物5，- CTCCGTCATCAAGCGTTCCGGCGTTA -3，(下劃線為突變石咸基) 反向引物5，- TAACGCCGGAACGCTTGATGACGGAG -3 ，(下劃線為突變堿基)雙突變體酶D372K/Y89的定點(diǎn)突變利用快速PCR技術(shù)，以單突變體酶 D372K基因?yàn)槟０澹?弓I入Y89R密碼子的定點(diǎn)突變引物為
正向引物5，- CTCCGTCATCAAGCGTTCCGGCGTTA -3'(下劃線為突變堿基)
反向引物5，- TAACGCCGGAACGCTTGATGACGGAG -3，(下戈U線為突變堿基)
PCR反應(yīng)體系均為10x￡x ra《buffer 5 ^L， 2.5 mM dNTPs 5 ^L，正向引 物(10 pM) l(iL，反向引物(10 ^M) lpL，模板DNA 1 ^L，五jc r"《HS (5 U/pL) 0.25 ^L，加入雙蒸水至50iuL。
PCR擴(kuò)增條件均為94。C預(yù)變性4min;隨后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)(94。C 30 s， 55°C 30 s， 72。C6min);最后72。C保溫10 min。
PCR產(chǎn)物經(jīng)Dp" I(購自加拿大Fermentas公司)消化，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM 109 感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞在LB固體培養(yǎng)基(含100pg/mL氨芐青霉素)培養(yǎng)過夜 后，挑單克隆于LB液體培養(yǎng)基(含100 ng/mL氨芐青霉素)中培養(yǎng)，后提取質(zhì)粒， 將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，所有突變質(zhì)粒均測 序正確。
(2)突變體的表達(dá)與純化
挑取轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主大腸桿菌BL21 (DE3)的單克隆于LB液體培養(yǎng)基(含100 ^g/mL氨芐青霉素)生長8~10 h，按4%接種量將種子發(fā)酵液接到TB液體培養(yǎng)基 (含100嗎/mL氨芐青霉素)；大腸桿菌在30 r搖床培養(yǎng)至OD6M=0.6，加入 O.OlmM終濃度的IPTG誘導(dǎo)胞外表達(dá)，并在25。C搖床繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵90小時(shí)后， 將發(fā)酵液于4 °C、 10000 rpm離心20 min除菌體，收集上清液并純化，分別得 到突變體酶D372K， Y89D， Y89R及D372K/Y89R制品。
軟化類芽f包桿菌(尸eam7)ac/〃w macerara) JFB 05-01(CCTCC NO: M 208063)，已在中國專利CN101294149A公開，
公開日2008年10月29日。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明構(gòu)建了 4個(gè)有意義的突變體，均實(shí)現(xiàn)了a-環(huán)糊 精產(chǎn)物特異性的提高，比野生型CGT酶更利于(x-環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)。


圖l野生型CGT酶和突變型酶的三種環(huán)糊精產(chǎn)量。A、野生型CGT酶；B、 突變體酶D372K; C、突變體酶Y89D; D、突變體酶Y89R; E、突變體酶D372K/Y89R。 其中4表示a-環(huán)糊精；《表示卩-環(huán)糊精；A表示Y-環(huán)糊精。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:本例說明突變體酶D372K， Y89D， Y89R, D372K/Y89R的制備。 1)定點(diǎn)突變
利用快速PCR技術(shù)，單突變體酶D372K， Y89D及Y89R的定點(diǎn)突變以 表達(dá)載體cg/pET-20b(+)為模板，
6引入D372K密碼子的定點(diǎn)突變引物為
正向引物5'- GACCGGCGATGGCAAACCCAACAACC -3，(下劃線為突變堿基) 反向引物5，- GGTTGTTGGGTTTGCCATCGCCGGTC -3，(下劃線為突變堿基)
引入Y89D密碼子的定點(diǎn)突變引物為
正向引物5'- CTCCGTCATCAAGGATTCCGGCGTTA -3，(下劃線為突變堿基) 反向引物5 ，- TAACGCCGGAATCCTTGATOACGGAG -3 ，(下劃線為突變堿基)
引入Y89R密碼子的定點(diǎn)突變引物為
正向引物5，- CTCCGTCATCAAGCGTTCCGGCGTTA -3，(下劃線為突變堿基) 反向引物5，- TAACGCCGGAACGCTTGATGACGGAG -3'(下劃線為突變堿基) 雙突變體酶D372K/Y89的定點(diǎn)突變利用快速PCR技術(shù)，以單突變體酶
D372K基因?yàn)槟０澹?br> 引入Y89R密碼子的定點(diǎn)突變引物為
正向引物5，- CTCCGTCATCAAGCGTTCCGGCGTTA -3，(下劃線為突變堿基) 反向引物5'- TAACGCCGGAACGCTTGATGACGGAG -3 ，(下劃線為突變堿基) PCR反應(yīng)體系均為10x￡x r叫buffer 5 ptL， dNTPs (2.5 mM) 5 pL，正向引
物(10 pM) lpL，反向引物(10 nM) lpL，模板DNA 1 |iL， ￡x &《HS (5 U L)
0.25 (iL，加入雙蒸水至5(HiL。
PCR擴(kuò)增條件均為94。C預(yù)變性4min;隨后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)(94。C 30 s， 55°C
30 s， 72。C6min);最后72。C保溫10 min。
PCR產(chǎn)物經(jīng)D;w I (購自加拿大Fermentas公司)消化，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109
感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞在LB固體培養(yǎng)基(含100pg/mL氨芐青霉素)培養(yǎng)過夜
后，挑單克隆于LB液體培養(yǎng)基(含100pg/mL氨芐青霉素)中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，
突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，突變質(zhì)粒均測序正確。 2)突變體酶的表達(dá)與純化
挑取轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主大腸桿菌BL21 (DE3)的單克隆于LB液體培養(yǎng)基(含100 嗎/mL氨芐青霉素)生長8~10 h，按4%接種量將種子發(fā)酵液接到TB液體培養(yǎng)基 (含100嗎/mL氨芐青霉素)；大腸桿菌在30 。C搖床培養(yǎng)至OD6。。=0.6，加入 O.OlmM終濃度的IPTG誘導(dǎo)胞外表達(dá)，并在25t:搖床繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵90小時(shí)后， 將發(fā)酵液于4 。C、 10000 rpm離心20 min除菌體，收集上清液。
上清液中加入70%固體硫酸銨鹽析過夜，4 。C、 10000 rpm離心20 min， 取沉淀物用適量含20mM磷酸鈉、0.5M氯化鈉、20mM咪唑、pH7.4的緩沖 液A溶解，并在緩沖液A中透析過夜后，通過0.22pm膜過濾后制成上樣樣品； Ni親和柱用緩沖液A平衡后，將上樣樣品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分別 用緩沖液A、含20-480 mM咪唑的緩沖液A、含480mM咪唑的緩沖液A洗脫， 流速lmL/min，檢測波長為280nm，分部收集含CGT酶酶活的洗脫液；活力組分在50 mM磷酸鈉緩沖液(pH=6)中透析過夜后，分別得到純化突變體酶D372K， Y89D， Y89R及D372K/Y89R。
實(shí)施例2:本實(shí)施例說明酶活分析。1)酶活測定方法
甲基橙法測定a-環(huán)化活力的方法取適當(dāng)稀釋的酶液0.1mL，加入裝有0.9mL預(yù)先用50mM磷酸緩沖液(pH6.5)配制的3n/。(w/v)可溶性淀粉溶液中，在40。C下反應(yīng)10min后，加入l.OmL l.ON的鹽酸停止反應(yīng)，再加入1.0 mL用50mM磷酸緩沖液配制的O.l mM甲基橙，在16"C下保溫20min，在505nm下測定吸光度。 一個(gè)酶活單位定義為在該條件下每分鐘生成1 ^mola-環(huán)糊精所需酶量。
酚酞法測定(3-環(huán)化活力的方法取適當(dāng)稀釋的酶液O.l mL，加入裝有0.9 mL預(yù)先用50mM磷酸緩沖液(pH6.5)配制的3。/。(w/v)可溶性淀粉溶液的試管中，在4(TC下反應(yīng)10min后，加入3.5mL 30mM NaOH和0.5mL由5mM Na2C03溶液配制的0.02%(w/v)酚酞停止反應(yīng)，在室溫下保溫20min,在550nm下測定吸光度。 一個(gè)酶活單位定義為在上述條件下每分鐘生成1^imol卩-環(huán)糊精所需酶量。
溴甲酚氯法測定Y-環(huán)化活力的方法如下取適當(dāng)稀釋的酶液O.l mL，加入裝有0.9 mL預(yù)先用50mM磷酸緩沖液(pH6.5)配制的3。/。(w/v)可溶性淀粉溶液的試管中，在40'C下反應(yīng)10min后，加入50(iL l.ON的鹽酸停止反應(yīng)，再加入2mL0.2M檸檬酸緩沖液(pH 4.2)和100|liL 5 mM溴甲酚氯溶液，在室溫下保溫20min，在630nm下測定吸光度。 一個(gè)酶活單位定義為在上述條件下每分鐘生成l)imol Y-環(huán)糊精所需的酶量。
2)酶活比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表l，將突變體純酶制品與野生型純酶制品相比，可以發(fā)現(xiàn)單突變體酶D372K的a-環(huán)化活力雖有所上升，但(3-環(huán)化活力下降了 51°/。； Y89D的a-環(huán)化活力上升了 10%， (3-環(huán)化活力也有輕微的上升；Y89R的a-環(huán)化活力下降了 18%， P-環(huán)化活力降低了 56°/。；雙突變體酶D372K/Y89R的a-環(huán)化活力比野生型酶上升了 24%， P-環(huán)化活力下降了 67%。 Y89D， Y89R和D372K/Y89R的總環(huán)化活力上升了 10%左右。而且，突變體酶D372K， Y89D，Y89R和D372K/Y89RY89D的a-環(huán)化活力占總環(huán)化活力的比例高于野生型酶。
表l酶a-環(huán)化活力卩-環(huán)化活力Y-環(huán)化活力總活力
(U/mg)(U/mg)(U/mg)(U/mg)
野生型190.432.21.1223.7
D372K202.515.61.0219.1
Y89D210.733.61.6245.9
Y89R225.414.00.7240.1
D372K/Y89R235.610.50.6246.7
8實(shí)施例3:本實(shí)施例說明HPLC方法分析環(huán)糊精生成量。
配制5%(濕基，含水量8%， w/v)可溶性淀粉溶液作為底物，5g淀粉溶解在 90mL磷酸鈉緩沖液(pH6.0)中，定容至100mL，在沸水中煮沸30min。分別加入 一定量的野生CGT酶、突變酶D372K， Y89D， Y89R或D372K/Y89R使反應(yīng)體 系中酶活為0.2U/mL,置于40 。C下反應(yīng)40h，隔時(shí)間取樣600nL， 12000 rpm離 心10min，取上清500iiL，加5jiL糖化酶(70 U/mL)，在30 。C糖化lh, 10min 煮沸滅活，12000 rpm離心30 min，取上清0.45[im超濾膜過濾后取20|iL上HPLC
分析。 一
反應(yīng)液中a-, (3-,和Y-環(huán)糊精的濃度采用HPLC測定，采用HPLC進(jìn)行產(chǎn)物 分析的色譜條件是Waters 600HPLC色譜儀，Waters自動進(jìn)樣器，色譜柱 LichrosorbNH2(4.6mmxl50mm)， Waters2410示差檢測器；流動相(V/V)為65% 乙腈水溶液，流速lmLmin";柱溫30 °C。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于圖1，將上述突變體表達(dá)獲得的突變體純酶制品與野生型純酶 制品相比，可以發(fā)現(xiàn)，突變體D372K， Y89D， Y89R， D372K7Y89R實(shí)現(xiàn)了a-環(huán)糊精生產(chǎn)能力的提高。表3可以看出，通過40h培養(yǎng)后，單突變體酶D372K 的a-環(huán)糊精產(chǎn)量增加了29。/。， P-環(huán)糊精產(chǎn)量減少了23。/o; Y89D的a-環(huán)糊精產(chǎn)量 增加了 12%， P-環(huán)糊精產(chǎn)量減少了 10%，而Y89R的a-環(huán)糊精產(chǎn)量上升了 35%， P-環(huán)糊精產(chǎn)量下降了 30%;雙突變體酶D372K/Y89R優(yōu)于野生型酶和單突變體 酶，a-環(huán)糊精產(chǎn)量增加了 50%， P-環(huán)糊精產(chǎn)量比野生型減少了 43%，野生型酶 的最終環(huán)糊精比例為41.8:54.4:3.8，雙突變體酶的最終環(huán)糊精比例為65:31.9:3.1。
表3
酶淀粉轉(zhuǎn)化率(％)a產(chǎn)物te/i) P
野生型42.37.6(41.8)9.9 (54.4)0.69 (3.8)
D372K42.09.8(54.3)7.6(42.1)0.65 。.6)
Y89D42.08.5(47.1)8.9 (49.3)0.64 (3.6)
Y89R41.110.3 (58.2)6.8 (38.4)0.60 (3.4)
D372K/Y89R40.811.4 (65.0)5.6(31.9)0.55 (3.1)
9序列表
<210> SEQ ID NO: 1
正向引物5， - GACCGGCGATGGCAAACCCAACAACC墨3，反向引物5，誦GGTTGTTGGGTTTGCCATCGCCGGTC畫3，
<210> SEQ ID NO: 2
正向引物5， -CTCCGTCATCAAGGATTCCGGCGTTA-3'反向引物5， -TAACGCCGGAATCCTTGATGACGGAG-3，
<210> SEQ ID NO: 3
正向引物5， -CTCCGTCATCAAGCGTTCCGGCGTTA-3，反向引物5， -TAACGCCGGAACGCTTGATGACGGAG-3，
權(quán)利要求
1、來源于軟化類芽孢桿菌(Peanibacillus macerans)JFB05-01的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，簡稱CGT酶，的三種單突變體酶D372K，Y89D及Y89R，其特征是將CGT酶基因中第372位的天冬氨酸Asp突變成了賴氨酸Lys，命名為D372K；將CGT酶基因中第89位的酪氨酸Tyr分別突變成了天冬氨酸Asp或精氨酸Arg，分別命名為Y89D及Y89R；它們相比于野生型CGT酶具有更高的產(chǎn)α-環(huán)糊精能力。
2、 權(quán)利要求1所述的三種單突變體酶D372K， Y89D及Y89R的制備方法， 其特征在于根據(jù)P JFB 05-01 CGT酶基因序列，分別設(shè)計(jì)并合成引入 D372K， Y89D或Y89R突變的引物，對CGT酶基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，測定DNA 序列，分別鑒別出第372位Asp密碼子變成Lys密碼子，第89位Tyr密碼子分 別變成Asp或Arg密碼子的突變體，并進(jìn)行大腸桿菌表達(dá)。
3、 P wacerara JFB 05-01 CGT酶的一種雙突變體酶D372K/Y89R，其特征 是將單突變體酶D372K基因中第89位的酪氨酸Tyr突變成了精氨酸Arg，命 名為D372K/Y89R，其相比于野生型CGT酶具有更高的產(chǎn)a-環(huán)糊精能力。
4、 權(quán)利要求3所述的一種雙突變體酶D372K/Y89R的制備方法，其特征是 以單突變體酶D372K基因?yàn)槟０澹O(shè)計(jì)并合成引入Arg密碼子于89位的定點(diǎn) 突變引物，對D372K基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，測定序列，鑒別出89位的Tyr突變成 Arg的突變體，并進(jìn)行大腸桿菌表達(dá)。
5、 權(quán)利要求2或4所述的突變體酶D372K， Y89D， Y89R及D372K/Y89R 的制備，其特征是(1)定點(diǎn)突變單突變體酶D372K， Y89D及Y89R的定點(diǎn)突變利用快速PCR技術(shù)，以 表達(dá)載體cgf/pET-20b(+)為模板， 引入D372K密碼子的定點(diǎn)突變引物為正向引物5 ，- GACCGGCGATGGCAAACCCAACAACC -3'，反向引物5 ， - GGTTGTTGGGTTTGCCATCGCCGGTC隱3 ，， 引入Y89D密碼子的定點(diǎn)突變引物為正向引物5 ， - CTCCGTCATCAAGGATTCCGGCGTTA -3 ，，反向引物5 ， - TAACGCCGGAATCCTTGATGACGGAG畫3 ，， 引入Y89R密碼子的定點(diǎn)突變引物為正向引物5 ，- CTCCGTCATCAAGCGTTCCGGCGTTA -3 ，，反向引物5， - TAACGCCGGAACGCTTGATGACGGAG -3"，下戈U線為突變堿基，雙突變體酶D372K/Y89的定點(diǎn)突變利用快速PCR技術(shù)，以單突變體酶下劃線為突變堿基， 下劃線為突變堿基，下劃線為突變堿基， 下劃線為突變堿基，下劃線為突變堿基，D372K基因?yàn)槟０?，引入Y89R密碼子的定點(diǎn)突變引物為正向弓l物5，- CTCCGTCATCAAGCGTTCCGGCGTTA -3'，下劃線為突變堿基， 反向引物5,- TAACGCCGGAACGCTTGATGACGGAG -3,，下戈U線為突變堿基， PCR反應(yīng)4本系均為lOx五;c buffer 5 pL， 2.5 mM dNTPs 5 |aL， 10 ^M正 向引物l(iL， 10 pM反向引物liiL，模板DNAlpL， 5 U/|iL￡x化《HS 0.25 juL， 加入雙蒸水至50)aL;PCR擴(kuò)增條件均為94。C預(yù)變性4min;隨后進(jìn)行94。C30s， 55°C 30 s， 72°C 6min35個(gè)循環(huán)；最后72。C保溫10 min;PCR產(chǎn)物經(jīng)Dp" I消化，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞在 含100嗎/mL氨芐青霉素的LB同體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜后，挑單克隆于含100 嗎/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，后提取質(zhì)粒，將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá) 宿主大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，所有突變質(zhì)粒均測序正確； (2)突變體的表達(dá)與純化 挑取轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主大腸桿菌BL21 (DE3)的單克隆于含100 pg/mL氨芐青 霉素的LB液體培養(yǎng)基生長8~10 h，按4%接種量將種子發(fā)酵液接到含100 (ig/mL 氨芐青霉素的TB液體培養(yǎng)基；大腸桿菌在30 。C搖床培養(yǎng)至OD6。。=0.6，加入 O.OlmM終濃度的IPTG誘導(dǎo)胞外表達(dá)，并在25。C搖床繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵90小時(shí)后， 將發(fā)酵液于4 °C、 10000 rpm離心20 min除菌體，收集上清液并純化，分別得 到突變體酶D372K， Y89D， Y89R及D372K/Y89R制品。
全文摘要
具有高產(chǎn)α-環(huán)糊精能力的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的突變體及突變方法，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明改進(jìn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(簡稱CGT酶)的產(chǎn)物特異性，提供了提高來源于Peanibacillus macerans JFB 05-01(CCTCC NOM 208063)的CGT酶產(chǎn)α-環(huán)糊精能力的突變方案，將CGT酶的372位的Asp替換為Lys，89位的Tyr分別替換為Asp及Arg，分別獲得單突變體酶D372K，Y89D及Y89R，它們的α-環(huán)糊精生產(chǎn)能力較野生型CGT酶有所提高；將帶有Lys372的CGT酶的基因片段替代Y89R基因的相應(yīng)片段，可獲得雙突變體酶D372K/Y89R，其α-環(huán)糊精產(chǎn)量比野生型CGT酶增加了1.5倍，而β-環(huán)糊精產(chǎn)量降低了57％。這些突變體比野生型CGT酶更利于α-環(huán)糊精的生產(chǎn)。
文檔編號C12R1/01GK101503681SQ20091002915
公開日2009年8月12日 申請日期2009年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月6日
發(fā)明者敬 吳, 張佳瑜, 李兆豐, 堅(jiān) 陳 申請人:江南大學(xué)