專利名稱：一種重組人胰島素及其類似物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明提供一種新型N-端前導(dǎo)肽序列的人胰 島素原或其類似物分子(PreproinsuUn)，及一種利用該分子生產(chǎn)人胰島素的方法，以及有關(guān)的 表達(dá)載體與丄程細(xì)胞的構(gòu)建、人胰島素原的表達(dá)和純化工藝。
背景技術(shù)：
糖尿病是僅次于心血管和腫瘤的第三大致死疾病，現(xiàn)今世界上已有2億糖尿病患者，而 且每年新增約600萬(wàn)新病例，每年死于糖尿病及相關(guān)并發(fā)癥者達(dá)到320萬(wàn)(2006年6月美國(guó) 糖尿病年會(huì)報(bào)告)。胰島素從20世紀(jì)20年代用于治療糖尿病，現(xiàn)在仍是無(wú)法替代的糖尿病特 效藥，而且在治療中使用胰島素的劑量為mg水平。每個(gè)I型糖尿病病人每天需要用胰島素 1.4-2.1mg，II型糖尿病患者對(duì)胰島素也有相當(dāng)大的需求，導(dǎo)致發(fā)達(dá)國(guó)家每年要消耗胰島素4600 公斤。隨著糖尿病患者人群的擴(kuò)大和胰島素用藥方式的多樣化(口服給藥、肺部給藥和口腔 噴霧給藥等)，胰島素的用量迅速增加。因此，提高胰島素的產(chǎn)量，降低胰島素的生產(chǎn)成本， 滿足廣大糖尿病患者用藥的需求，不僅具有重要的經(jīng)濟(jì)意義，而且具有重要的社會(huì)意義。
現(xiàn)有技術(shù)
重組人胰島素是人類使用基因工程的方法生產(chǎn)的第一個(gè)生物工程藥物，并成功上市。從 國(guó)內(nèi)國(guó)際市場(chǎng)的發(fā)展趨勢(shì)來(lái)看，重組人胰島素已逐步取代用提取法制備的動(dòng)物胰島素。
目前重組人胰島素及其類似物的生產(chǎn)采用了兩套系統(tǒng)，其一是用酵母系統(tǒng)(CN1414974A; CN1873006A; CN1125081C); 其二是用大腸桿菌系統(tǒng)(；CN1163600C; CN1011073006A; JuanA.Asenjo， CRCPress, 1990)。酵母系統(tǒng)采用了分泌人胰島素原類似物的方式，分泌出來(lái)的人胰島素前體己具有了天然的二硫鍵及正確的N-端。缺點(diǎn)在于酵母菌生長(zhǎng)滿，導(dǎo)致生產(chǎn)周 期長(zhǎng)，且表達(dá)水平很低。應(yīng)用大腸桿菌表達(dá)重組人胰島素生產(chǎn)的方式主要包括三種方式一 種是美國(guó)禮來(lái)公司1982年采用的重組大腸桿菌分別表達(dá)胰島素的A鏈和B鏈，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng) 溴化氰(bromine cyanide, CNBr)切下融合導(dǎo)肽片段后，得到的A鏈和B鏈經(jīng)純化后再進(jìn)行 復(fù)性，最后得到有活性的重組人胰島素。由于該方式的復(fù)性率只有10%左右，采用這條工藝 生產(chǎn)的胰島素成本太高。第二種也是美國(guó)禮來(lái)公司建立的，目前仍然是諸多公司生產(chǎn)重組人 胰島素的主要方式。由于正常序列的人胰島素原(B-C-A)在大腸桿菌中不穩(wěn)定而容易降解， 通常采用融合蛋白的形式，將人胰島素原接在一個(gè)較大的N-端融合蛋白后面，大大增加了胰 島素原的表達(dá)量(10%-30%) (Castellanos-Serra, et al. 1996; Tikhonov, et al. 2001),表達(dá)產(chǎn)物通 過(guò)溴化氰釋放出人胰島素原。由于C肽的存在，胰島素原能形成良好的空間構(gòu)象，折疊率到 達(dá)70%，從而在一定程度上降低了胰島素的生產(chǎn)成本。第三種方式是丹麥諾和諾德公司采用 的A、 B鏈同時(shí)表達(dá)的方法，在A鏈前端和A、 B鏈中間均有甲硫氨酸。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)溴化氰 處理，得到A鏈和B鏈，再經(jīng)過(guò)復(fù)性和純化得到有活性的重組人胰島素，這種方式與第一種 方式存在著同樣的因?yàn)閺?fù)性效率帶來(lái)的成本問(wèn)題。
另外，在應(yīng)用大腸桿菌表達(dá)體系方面，美國(guó)禮來(lái)公司實(shí)驗(yàn)室(Heath, et al. 1992)使用了倒 置胰島素原(A-B-C)在大腸桿菌系統(tǒng)的非融合形式表達(dá)，有一定的意義。倒置胰島素原復(fù) 性率較高，后加工也有所簡(jiǎn)化，但是表達(dá)效率較低(10%),后加工時(shí)副反應(yīng)強(qiáng)烈，從而阻礙 了這一方案在工業(yè)中的應(yīng)用。該公司還開(kāi)發(fā)了應(yīng)用短導(dǎo)肽(僅兩個(gè)氨基酸)表達(dá)正常人胰島 素原及其類似物的方法(Belagaje, et al. 1997)。這類方法的優(yōu)點(diǎn)是短導(dǎo)肽對(duì)胰島素原的復(fù)性沒(méi) 有影響，可以在復(fù)性后由胰蛋白酶切除，避免了溴化氰的使用。同吋由于短導(dǎo)肽僅兩個(gè)氨基 酸殘基，有效地增加了表達(dá)產(chǎn)物中胰島素原的比例，具有一定優(yōu)勢(shì)，但表達(dá)量較低，在7%-15% 間。
綜上所述，現(xiàn)有的重組人胰島素的生產(chǎn)方法中存在表達(dá)量較低或者在生產(chǎn)過(guò)程中使用劇毒溴化氰的技術(shù)缺陷。雖然應(yīng)用大腸桿菌系統(tǒng)的第二種方式在一定程度上有效的提高了融合 胰島素原的表達(dá)量，但是胰島素原在表達(dá)產(chǎn)物中所占比例較低。而溴化氰的使用，可能對(duì)環(huán) 境產(chǎn)生較大污染，操作條件苛刻。本發(fā)明綜合現(xiàn)在胰島素表達(dá)生產(chǎn)遇到的問(wèn)題，提供了一類 新型含有N-端前導(dǎo)肽序列的人胰島素原或其類似物分子，并提供了一種利用該胰島素原分 子，采用大腸桿菌高密度發(fā)酵體系生產(chǎn)人胰島素原的方法，可以大大提高胰島素原的表達(dá)量， 而且克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的使用有毒有害物質(zhì)溴化氰的技術(shù)缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種用于制備重組人胰島素及其類似物的新型胰島素前體。 本發(fā)明的另一目的就是提供一種利用該新型胰島素前體高效簡(jiǎn)便的生產(chǎn)人胰島素或其類 似物的方法。
本發(fā)明的再一 目的就是提供用于該方法的表達(dá)載體及工程細(xì)胞。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于制備重組人胰島素及其類似物的新型胰島素前體， 其特征在于，所述前體從氨基端至羧基端分別含有以下元件
(a) 具有式Met-Ser-(Xaa)mZi所示的導(dǎo)肽元件，式中Xaa為20種天然氨基酸中任一種， m為0-30的正整數(shù)，Zi為Arg或Lys;
(b) 人胰島素B鏈或其類似物；
(c) 具有式Z2(Xaa)nZ3所示的連接肽元件，式中Xaa為20種天然氨基酸中任一種，n 為非負(fù)整數(shù)或者0， Z2為Arg或Lys， Z3為Arg或Lys;
(d) 人胰島素A鏈或其類似物。
在一優(yōu)選例中，導(dǎo)肽元件Met-Ser-(XaaV^式中m=0， &為Arg且所述的導(dǎo)肽元件序列為MSR。
在另一優(yōu)選例中，導(dǎo)肽元件Met-Ser-(Xaa)mZi式中m=2， Z！為Aig，且所述的導(dǎo)肽元件 序列為SEQ ID NO:l所示的氨基酸序列。
在另一優(yōu)選例中，導(dǎo)肽元件Met-Se"Xaa^Z！式中m=4， Zx為Arg，且所述的導(dǎo)肽元件 序列為SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在另一優(yōu)選例中，導(dǎo)肽元件Met-Ser-(Xaa)n^式中m=6, Zi為Arg，且所述的導(dǎo)肽元件 序列為SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在另一優(yōu)選例中，導(dǎo)肽元件Met-Ser-(Xaa)m^式中n^10， A為Arg，且所述的導(dǎo)肽元件 序列為SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在另一優(yōu)選例中，導(dǎo)肽元件Met-Ser-(XaaVZi式中m-12， Z,為Arg，且所述的導(dǎo)肽元件 序列為SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的連接肽元件為人胰島素C肽。
本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的DNA序列，它編碼本發(fā)明上述的新型胰島素前 體。還提供了含有所述DNA的表達(dá)載體，以及含有表達(dá)載體或所述DNA的宿主細(xì)胞。
在一優(yōu)選例中，表達(dá)載體是上海一就生物醫(yī)藥有限公司提供的pAmk大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒。 在另一優(yōu)選例中，宿主細(xì)胞是五sc/ien'c/w'a co/"DHl)。
本發(fā)明的第三方面，提供了一種制備胰島素或其類似物的方法，包括從表達(dá)上述新型胰 島素前體并從前體中釋放和分離胰島素或其類似物的過(guò)程。
本發(fā)明的一種用于制備重組人胰島素及其類似物的新型胰島素前體能帶來(lái)如下技術(shù)效 果該類前體能在上海一就生物醫(yī)藥有限公司提供的pAmk大腸桿菌表達(dá)體系中實(shí)現(xiàn)高表達(dá) 量的表達(dá)，胰島素原在表達(dá)產(chǎn)物中所占比例達(dá)到96.6% (Met-Ser-Aig-proinsulin，簡(jiǎn)稱 MSR-proinsulin)。該類前體能有效的應(yīng)用常規(guī)胰島素原復(fù)性方法復(fù)性，在轉(zhuǎn)化成為胰島素或 胰島素類似物時(shí)只須用胰蛋白酶和羧肽酶B就能釋放胰島素或胰島素類似物分子，不使用溴200 化氰，適合大規(guī)模生產(chǎn)重組人胰島素或其類似物。


圖1 質(zhì)粒pAmk-MS-proinsulin結(jié)構(gòu)圖。
圖2重組質(zhì)粒pAmk-MS-proinsulin部分基因測(cè)序結(jié)果。
圖3 SDS-PAGE電泳顯示pAmk-MS-proinsulin的表達(dá)和純化。1.標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白(kDa); 2.載荷pAmk-MS-proinsulin質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 (DH1)細(xì)胞全蛋白(乳糖誘導(dǎo)后)；3.載 荷pAmk-MS-proinsulin質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 (DH1)細(xì)胞全蛋白(乳糖誘導(dǎo)前)；4.陰離子 交換層析(DEAE-52)純化后的MS-proinsulin。
圖4 SDS-PAGE電泳顯示純化的重組人胰島素。1.純化后的MS-proinsulin; 2.純化的重組 人胰島素(氧化態(tài))；3.標(biāo)準(zhǔn)品人胰島素(氧化態(tài))；4.純化的重組人胰島素(還原態(tài))；5.標(biāo) 準(zhǔn)品人胰島素(還原態(tài))。
圖5純化的重組人胰島素AutoflexToF/ToF (BrukerDaitonics)質(zhì)譜圖。
圖6胰島素的HPLC檢測(cè)結(jié)果，A為本發(fā)明制備的重組人胰島素，B為標(biāo)準(zhǔn)品人胰島素。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明
材料
(1) 菌株和質(zhì)粒
宿主菌Escherichia coli(DHl)是基因工程常用工具菌種，在與基因工程研究有關(guān)的實(shí)驗(yàn)室 一般都有保存。
質(zhì)粒pET28a-23DT-proinsulin和質(zhì)粒pAmk均由本公司實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。
(2) 酶和試劑
分子克隆工具酶和試劑、質(zhì)粒抽提試劑盒為普洛麥格(Promega)公司產(chǎn)品，PCR回收 試劑盒和瓊脂糖膠回收試劑盒為上海華舜生物工程公司產(chǎn)品。
標(biāo)準(zhǔn)品天然人胰島素、胰蛋白酶和羧肽酶B購(gòu)至上海生物工程有限公司。
7(3) 培養(yǎng)基
LB培養(yǎng)基，配方見(jiàn)參考文獻(xiàn)Sambrook J, Fristsh EF, Maniatis T. Molecular Cloning; A Laboratory Manual 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。該書(shū)是基因工禾呈中支 術(shù)的經(jīng)典著作，在許多高校圖書(shū)館都有收藏。
(4) Cellouse-DEAE: DEAE-52為Whatman公司產(chǎn)品。
方法
質(zhì)粒提取、聚合酶鏈反應(yīng)、內(nèi)切酶酶切、DNA片段的回收、連接和轉(zhuǎn)化大腸桿菌，這些 在基因工程研究領(lǐng)域都是常規(guī)操作方法，參見(jiàn)Sambrook J， Fristsh EF， Maniatis T. Molecular Cloning; A Laboratory Manual 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Piess， 1989， pp. 16-340。
重組蛋白表達(dá)量的測(cè)定參見(jiàn)Sambrook J, Fristsh EF, Maniatis T. Molecular Cloning; A Laboratory Manual 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989，方法進(jìn)1亍。
實(shí)施例1 MSR-proinsulin重組基因工程菌的構(gòu)建 1.1 MS-proinsulin基因的獲得
以pAmk為模板，設(shè)計(jì)引物P1和P2，兩條引物核苷酸序列如下 PI: 5，GGAATTGTGAGCGGATAACA3， P2: 5'AAAACGACTCATAACGTATTCCTCT3'
通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增pAmk中Ascl酶切位點(diǎn)與表達(dá)導(dǎo)肽MS之間的片段。將其命名為 fragment-MS。使用Pfu DNA聚合酶擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94 °C， 45s、 53°C， 45s、 72°C， 30s。 共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用DNA膠回收試劑盒純化回收130bp左右的條帶。
以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的pET28a-23DT-proinsulin設(shè)計(jì)引物P3和P4: P3: 5'ATGAGTCGTTTTGTCAATCAGCACC3'P4: 5，CCGCCATGGCGCTTTTGATCC3，
擴(kuò)增pET28a-23DT-proinsulin中胰島素原與Nco I酶切位點(diǎn)之間片段。將其命名為 fragment-proinsulin。使用Pfu DNA聚合酶擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94 。C， 45s、 68°C， 120s。共30 個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用DNA膠回收試劑盒純化回收580bp左右的條帶。
利用重疊區(qū)延伸法獲得MS-proinsulin基因由于引物P2的5'端與引物P3的5'端有12 個(gè)堿基的互補(bǔ)，所以以fragment-MS與fragment-proinsulin為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增，在退火 時(shí)可以使fragment-MS基因的單鏈與fragment-proinsulin基因的單鏈配對(duì)，通過(guò)DNA聚合酶 的作用，得到將fragment-MS與fragment-proinsulin連接的片段。命名為 fragment-MSR-proinsulin。使用Pfu DNA聚合酶擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94 °C， 45s、 57°C， 50s、 72°C， 80s。共30個(gè)循環(huán)。
PCR產(chǎn)物用DNA膠回收試劑盒純化回收710bp左右的條帶。 1.2 pAmk-MS-proinsulin質(zhì)粒的構(gòu)建及相應(yīng)重組基因工程菌的構(gòu)建
將擴(kuò)增純化后的fragment-MSR-proinsulin基因片段用Asc I與Nco I進(jìn)行雙酶切，酶切后 產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收酶切產(chǎn)物。
采用堿裂解法對(duì)pAmk質(zhì)粒進(jìn)行抽提，抽提得到的質(zhì)粒也用Asc I與Nco I進(jìn)行雙酶切， 酶切反應(yīng)結(jié)束后用膠回收試劑盒回收大片段DNA。
將上述酶切回收后得到的fragment-MSR-proinsulin基因片段和pAmk質(zhì)粒大片段用T4連接 酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌&c/tm'c/u'fl co/z' BL21(DH1)，篩選后得到含有 fragment-MSR-proinsulin前體胰島素原蛋白基因的重組質(zhì)粒的基因工程菌，稱為 pAmk-MS-proinsulin重組基因工程菌，其結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)附圖l。從該工程菌中提取重組質(zhì)粒， 委托上海英俊公司進(jìn)行核酸序列分析，進(jìn)一步驗(yàn)證MS-proinsulin前體胰島素原蛋白基因及其 讀碼框的正確性，其結(jié)果見(jiàn)附圖2。
9實(shí)施例2 pAmk-MS-proinsulin重組基因工程菌發(fā)酵表達(dá)
從pAmk-MS-proinsulin重組基因工程菌的培養(yǎng)平板上挑取單菌落，接種于含有25 y g/ml 鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37'C恒溫振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按1免比例轉(zhuǎn)接種入20升LB液體培養(yǎng) 基(25 U g/ml鏈霉素)中，并加入終濃度為0.5mmol/L的a-乳糖誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白MS-proinsulin。 誘導(dǎo)后12小時(shí)離心問(wèn)收菌體(共計(jì)濕菌體5kg)， 15免SDS-PAGE電泳再經(jīng)薄層掃描顯示已經(jīng)實(shí) 現(xiàn)了MS-proinsulin前體胰島素原蛋白基因的表達(dá)，表達(dá)的蛋白占細(xì)菌總蛋白的44.2%，結(jié)果見(jiàn) 附圖3。
實(shí)施例3 MS-proinsiilin前體胰島素原蛋白的分離純化
誘導(dǎo)表達(dá)后的工程菌經(jīng)離心回收菌體，將菌體懸浮在菌體裂解液(pH8.0， 50mMTris-Cl， 0.5%TritOnX-100， 0.02%溶菌酶)中，37。C攪拌過(guò)夜。離心回收沉淀，沉淀經(jīng)包涵體洗滌液 (pH8.0， 50mMTris-Cl, 0.2% Triton X-100)、低濃度尿素溶液(pH8.0， 50mMTris-Cl， 3M 尿素)洗滌，洗滌后離心回收沉淀。沉淀裂解于高濃度尿素中(pH8.0， 50mM Tris-Cl， 7M 尿素)，離心回收上清。上清經(jīng)亞硫酸鹽解(亞硫酸鈉、連四硫酸鈉)，陰離子交換(DEAE-52) 層析純化。層析用緩沖液包含pH8.0， 50mMTris-Cl， 7M尿素，梯度洗脫用0-0.3M NaCl梯度 進(jìn)行，目的蛋白層析峰經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)已達(dá)到電泳純，結(jié)果見(jiàn)附圖3。
實(shí)施列4 MS-proinsulin前體胰島素原蛋白轉(zhuǎn)化為人胰島素
為形成正確的二硫鍵，將純化后的MS-proinsulin前體胰島素原蛋白(-S-磺酸鹽)溶解于 含有50mM甘氨酸的緩沖液pH10.6中，濃度為0.5g/1。在巰基乙醇(10mol/mol前體胰島素原) 作用下，4'C攪拌過(guò)夜，然后用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.5,離心去除沉淀。上清液用50mMTris調(diào)節(jié)pH 至9.0，按質(zhì)量比l: IOOO-I: 1000 (E/S，即酶/前體胰島素原)分別加入胰蛋白酶和羧肽酶B， 37。C反應(yīng)30min，產(chǎn)物經(jīng)陰離子交換層析(DEAE-52)純化。層析用緩沖液包含pH9.0， 50raMTris-Cl，梯度洗脫用0-0.8M NaCl梯度進(jìn)行，胰島素析峰經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)已達(dá)到電泳純， 結(jié)果見(jiàn)附圖4。目的峰經(jīng)脫鹽、凍干后保存。
凍干品經(jīng)AutoflexToF/ToF 〔Bruker Daitonics)質(zhì)譜測(cè)定分子量為5807.29Da，與理論分 子量相比誤差為0.01%，見(jiàn)附圖5。
實(shí)施列5重組人胰島素RP-HPLC檢測(cè)
實(shí)施例4中純化的重組人胰島素和人胰島素標(biāo)準(zhǔn)品，分別按美國(guó)藥典USP28th的方法進(jìn)行 RP-HPLC檢觀U，見(jiàn)圖6。結(jié)果表明重組人胰島素和人胰島素標(biāo)準(zhǔn)品具有同樣的RP-HPLC保留性質(zhì)。<110>上海一就生物醫(yī)藥有限公司 <120>—種重組人胰島素及其類似物的制備方法
<160> 5
<210> 1
<211>5 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>當(dāng)m=2時(shí)導(dǎo)肽元件的序列 <400> 1
Met Ser Leu Asn Arg 1 5
<210> 2 <2">7 <212> PRT <213>人工序列<220>
<223>當(dāng)ra=4時(shí)導(dǎo)肽元件的序列 <400> 2
Met Ser Leu Asn Thr Ser Arg 1 5
<210> 3 <211>9 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>當(dāng)m=6時(shí)導(dǎo)肽元件的序列 <400> 3
Met Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Arg 1 5
<210> 4 <211>13 <212> PRT<213>人工序列 <220>
<223>當(dāng)m-lO時(shí)導(dǎo)肽元件的序列 <400> 4
Met Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Gly Ala Ser Thr Arg 1 5 10
<210> 5 <211>17 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>當(dāng)m=12時(shí)導(dǎo)肽元件的序列 <400> 5
Met Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Gly Ala Ser Thr Met Gin Glu Glu Arg 15 10 1權(quán)利要求
1. 本專利涉及一種用于制備重組人胰島素及其類似物的新型胰島素前體。
2. 條款l所述的胰島素前體，其特征在于，所述前體從氨基端至羧基端分別含有以下元件a) 具有式Met-Ser-(XaaV^所示的導(dǎo)肽元件，式中Xaa為20種天然氨基酸中任一種，m為 0-30的正整數(shù)，Zi為Arg或Lys;b) 人胰島素B鏈或其類似物；c) 具有式Z2(Xaa)nZ3所示的連接肽元件，式中Xaa為20種天然氨基酸中任一種，n為非負(fù) 整數(shù)或者O， Z2為Aig或Lys， Z3為Arg或Lys;d) 人胰島素A鏈或其類似物。
3. 條款1或2所述的前體，其特征在于a) 當(dāng)m-O時(shí)，導(dǎo)肽元件的序列為MSR;b) 當(dāng)m=2時(shí)，導(dǎo)肽元件的序列為SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列；c) 當(dāng)m=4時(shí)，導(dǎo)肽元件的序列為SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列；d) 當(dāng)m=6時(shí)，導(dǎo)肽元件的序列為SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列；e) 當(dāng)m=10時(shí)，導(dǎo)肽元件的序列為SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；f) 當(dāng)m-12時(shí)，導(dǎo)肽元件的序列為SEQIDNO:5所示的氨基酸序列。
4. 一種分離的DNA序列，其特征在于，它編碼條款l-3中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的胰島素前體。
5. —種表達(dá)載體，其特征在于，它含有條款4所述的DNA序列。
6. —種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有條款5所述的表達(dá)載體或含有條款4所述的DNA序列。
7. —種制備胰島素或其類似物的方法，其特征在于，表達(dá)條款1-3中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的胰島素 前體并從前體中釋放并分離胰島素或其類似物。
8. 條款l中的重組人胰島素類似物包括甘精胰島素、谷甘胰島素、賴脯胰島素、門(mén)冬胰島素等。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新型N-端前導(dǎo)肽序列的人胰島素原或其類似物分子(Preproinsulin)，及一種利用該分子生產(chǎn)人胰島素的方法，以及有關(guān)的表達(dá)載體與工程細(xì)胞的構(gòu)建、人胰島素原的表達(dá)和純化工藝。將編碼帶有本發(fā)明N-端前導(dǎo)肽序列的人胰島素原或其類似物的核酸序列導(dǎo)入原核表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)入大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)該類分子以包涵體形式的表達(dá)。產(chǎn)物具有表達(dá)量高、易純化、制備方法不使用CNBr、加工成為重組胰島素過(guò)程工藝簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/19GK101519446SQ20091003004
公開(kāi)日2009年9月2日 申請(qǐng)日期2009年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月31日
發(fā)明者景 侯, 劉景晶, 劉素麗, 劉言華, 婧 孔, 張笑巖, 楊亞男, 豪 范, 勇 魯 申請(qǐng)人:上海一就生物醫(yī)藥有限公司