專(zhuān)利名稱(chēng)：一種用添加山梨醇提高發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
利用重組畢赤酵母作為宿主高效表達(dá)堿性果膠酶， 一種用添加山梨醇提高 發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶產(chǎn)量的方法，涉及碳源添加策略在發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化中的應(yīng)用 技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
堿性果膠酶是一類(lèi)能在堿性條件下高效分解植物組織中果膠質(zhì)(由D-半乳糖 醛酸以a-l， 4糖苷鍵連接形成的直鏈狀的聚合物)的酶的總稱(chēng)，作為一種用于紡織 清潔生產(chǎn)的全新溫和的生物精練酶制劑而備受關(guān)注。在前期研究中，本研究室 在分離篩選得到一株堿性果膠酶高產(chǎn)菌株WSHB04-02的基礎(chǔ)上，將其原核堿性 果膠酯裂解酶基因尸丄利用穿梭載體pPIC9K的連接，并成功表達(dá)于畢赤酵母 GS115中，菌種保藏號(hào)為CGMCCN0.2143。之后的研究工作都圍繞重組畢赤酵 母發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化而展開(kāi)。在發(fā)酵過(guò)程的誘導(dǎo)階段，由于長(zhǎng)時(shí)間的流加甲醇，對(duì) 細(xì)胞活力有著較強(qiáng)的毒害作用，因此如何在高效的誘導(dǎo)表達(dá)階段又可以維持細(xì) 胞的活力是進(jìn)一步提高酶活的關(guān)鍵問(wèn)題。利用山梨醇的低速流加便可以解決這 一問(wèn)題，提高果膠酶的產(chǎn)量，尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用添加山梨醇的策略提高發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶產(chǎn) 量的方法，利用本發(fā)明能顯著提高堿性果膠酶的產(chǎn)量。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一種用添加山梨醇提高發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶產(chǎn)量的方
法，用重組畢赤酵母GS115為發(fā)酵菌株，在發(fā)酵誘導(dǎo)期以恒速或加速添加山梨
醇到發(fā)酵液中，以提高細(xì)胞活力，減弱甲醇的毒害作用，進(jìn)而提高堿性果膠酶
的產(chǎn)量；
流加速度從0.9g/h至7.2g/h的固體山梨醇計(jì)范圍內(nèi)任選一恒定速度，配成 體積百分濃度50%山梨醇溶液進(jìn)行流加；
或流加速度以每10h提高流速0.6g/h，從0.9g/h逐步提高至7.2g/h，配成 體積百分濃度50%山梨醇溶液進(jìn)行流加。
堿性果膠酶的產(chǎn)量隨山梨醇流速的提高而提高，但是當(dāng)其流速過(guò)高時(shí)，堿 性果膠酶的產(chǎn)量又會(huì)減少。在山梨醇的恒定添加速度為3.6g/h時(shí)，堿性果膠酶 的產(chǎn)量由對(duì)照(不添加山梨醇)的930U/mL提高到1389U/mL。當(dāng)采用梯度增加山 梨醇的添加流速時(shí)，發(fā)現(xiàn)堿性果膠酶的產(chǎn)量提高到1541U/mL。
堿性果膠酶酶活的測(cè)定取一定量發(fā)酵液于10000 r/min離心10 min，上清液作為堿性果膠酶活性測(cè)定的樣品。反應(yīng)體系中包括粗酶稀釋液(一般稀釋
200-800倍不等)20 pL， 2 mL含0.2y。聚半乳糖醛酸的甘氨酸-NaOH緩沖液(緩 沖液配方甘氨酸1.8775g， NaOH0.35g， CaCl2-2H20 0.028g定容至500mL)， 以無(wú)活性的酶液作為空白對(duì)照，以含底物的緩沖溶液的加入起動(dòng)酶促反應(yīng)；反 應(yīng)條件為45 。C反應(yīng)15 min，用3 mL 0.03 mol/L的磷酸終止反應(yīng)，在235 nm處 測(cè)定其吸光度值。
一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活單位(l U)定義為每分鐘使聚半乳糖醛酸裂解產(chǎn)生1 pmol的 不飽和聚半乳糖醛酸的酶量。
本發(fā)明的有益效果利用本發(fā)明能顯著提高堿性果膠酶的產(chǎn)量。較低的山 梨醇添加量不僅不會(huì)抑制甲醇對(duì)菌體的產(chǎn)酶效果，還可以從一定程度上削弱菌 體受到的甲醇毒害作用，從而進(jìn)一步提高產(chǎn)酶效率。此外，本發(fā)明所提供的通 過(guò)添加山梨醇提高產(chǎn)外源蛋白的策略對(duì)其它的畢赤酵母的表達(dá)體系也有一定的 借鑒和指導(dǎo)作用。
具體實(shí)施例方式
對(duì)照實(shí)施例本發(fā)明所用的菌種重組畢赤酵母P戶O^W^GS115為宿主，
整合來(lái)自Ba"7/M sp. WSHB04-02菌株中的堿性果膠酶的編碼基因，具有His+ 和Mut+表型，拷貝數(shù)為2-3個(gè)。重組畢赤酵母P ; wtor^ GS115已在生物工程 學(xué)報(bào)2008.24 (4) .p635陽(yáng)639公開(kāi)。
土昔養(yǎng)基
種子培養(yǎng)基葡萄糖20g/L,蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L。 分批發(fā)酵培養(yǎng)基為85。/。磷酸26.7mL/L， CaSO40.93 g/L， K2S04 18.2 g/L，
MgS04.7H20 14.9 g/L， KOH4,13g/L，甘油40.0 g/L， PTM1 4.35 mL/L， 25%氨
水調(diào)pH5.5。
補(bǔ)料生長(zhǎng)培養(yǎng)基50 %(『/^)甘油(含12 mL/L PTM1)。 發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)基100%甲醇(含12mL/LPTMl)。
培養(yǎng)條件先從保藏菌種的甘油管轉(zhuǎn)至搖瓶在3(TC， 200rpm的搖床中培養(yǎng) 24小時(shí)，然后在3L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，第一階段為生長(zhǎng)期36h左右，第二階段 為誘導(dǎo)期100h左右，發(fā)酵條件為pH5.5，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量維持溶氧30% 以上，通氣速率2.0 wm，生長(zhǎng)期溫度維持在30。C,誘導(dǎo)期溫度降為22。C。
基于此工藝下的發(fā)酵法生產(chǎn)堿性果膠酶，產(chǎn)量可達(dá)930U/mL左右。
實(shí)施例l:發(fā)酵罐發(fā)酵采用山梨醇恒速添加策略，其余條件同對(duì)照實(shí)施例。 發(fā)酵進(jìn)入誘導(dǎo)期時(shí)添加山梨醇(50%， v/v， 1.8g/h的固體山梨醇)。結(jié)果堿性果 膠酶的產(chǎn)量由對(duì)照的930U/mL提高到1176U/mL。
實(shí)施例2:發(fā)酵罐發(fā)酵采用山梨醇恒速添加策略，其余條件同對(duì)照實(shí)施例。 發(fā)酵進(jìn)入誘導(dǎo)期時(shí)添加山梨醇(50y。，v/v， 3.6g/h的固體山梨醇)。結(jié)果堿性果膠酶的產(chǎn)量由對(duì)照的930U/mL提高到1389U/mL。
實(shí)施例3:發(fā)酵罐發(fā)酵采用山梨醇恒速添加策略，其余條件同對(duì)照實(shí)施例。 發(fā)酵進(jìn)入誘導(dǎo)期時(shí)添加山梨醇(50%, v/v， 5.4g/h的固體山梨醇)。結(jié)果堿性果 膠酶的產(chǎn)量由對(duì)照的930U/mL提高到1211U/mL。
實(shí)施例4:發(fā)酵罐發(fā)酵采用山梨醇變速添加策略，其余條件同對(duì)照實(shí)施例。 發(fā)酵進(jìn)入誘導(dǎo)期時(shí)添加山梨醇(50Q/。，v/v，流加速度從0.9g/h逐步提高至7.2g/h， 每10h提高流速0.6g/h)。結(jié)果堿性果膠酶的產(chǎn)量由對(duì)照的930U/mL提高到 1541U/mL0
權(quán)利要求
1、一種用添加山梨醇提高發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶產(chǎn)量的方法，其特征是用重組畢赤酵母GS115為發(fā)酵菌株，在發(fā)酵誘導(dǎo)期以恒速或加速添加山梨醇到發(fā)酵液中，以提高細(xì)胞活力，減弱甲醇的毒害作用，進(jìn)而提高堿性果膠酶的產(chǎn)量；流加速度從0.9g/h至7.2g/h的固體山梨醇計(jì)范圍內(nèi)任選一恒定速度，配成體積百分濃度50％山梨醇溶液進(jìn)行流加；或流加速度以每10h提高流速0.6g/h，從0.9g/h逐步提高至7.2g/h，配成體積百分濃度50％山梨醇溶液進(jìn)行流加。
全文摘要
一種用添加山梨醇提高發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶產(chǎn)量的方法，涉及碳源添加策略在發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化中的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明用重組畢赤酵母GS115為發(fā)酵菌株，在發(fā)酵誘導(dǎo)期以恒速或加速添加山梨醇到發(fā)酵液中，以提高細(xì)胞活力，減弱甲醇的毒害作用，進(jìn)而提高堿性果膠酶的產(chǎn)量。較低的山梨醇添加量不僅不會(huì)抑制甲醇對(duì)菌體的產(chǎn)酶效果，還可以從一定程度上削弱菌體受到的甲醇毒害作用，從而進(jìn)一步提高產(chǎn)酶效率。當(dāng)山梨醇采用變速流加(0.9g/h-7.2g/h)時(shí)，酶活從對(duì)照的930U/ml提高到1541U/ml。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單有效，而且可應(yīng)用于今后果膠酶的工業(yè)化生產(chǎn)中，且對(duì)其它的畢赤酵母發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化具有一定的指導(dǎo)意義。
文檔編號(hào)C12N9/26GK101525604SQ20091003083
公開(kāi)日2009年9月9日 申請(qǐng)日期2009年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月17日
發(fā)明者堵國(guó)成, 張東旭, 李江華, 汪志浩, 堅(jiān) 陳 申請(qǐng)人:江南大學(xué)