專利名稱：：用于傷寒沙門菌dna芯片轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜的基因組特異引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一組基于傷寒沙門菌基因組序列的基因組特異引物(genomedirectedprimers,GDP引物)，共34條，屬于生物信息學(xué)及分子生物學(xué)領(lǐng)域?？捎糜趥抽T菌基因轉(zhuǎn)錄譜分析，尤其活體條件下基因表達(dá)譜分析，提高了靈敏度及特異性；同時可指導(dǎo)已知序列基因組的擴(kuò)增以構(gòu)建基因文庫。
背景技術(shù)：
：全基因組DNA芯片表達(dá)譜分析技術(shù)具有高通量和平行性的優(yōu)勢，能同時分析不同條件下成千上萬個基因的表達(dá)情況。DNA芯片雜交所需探針通常由轉(zhuǎn)錄本mRNA反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記熒光素生成。目前，傷寒沙門菌DNA芯片轉(zhuǎn)錄譜所用探針，通常仍使用PatBrown法(http:〃cmgm.stanford.edu/pbrown/protocols/4—Ecoli—RNA.txt)由N6或N7隨機(jī)引物通過反轉(zhuǎn)錄酶催化獲得熒光素標(biāo)記的cDNA。隨機(jī)引物理論上能夠覆蓋幾乎所有的序列，但同時，也能與除mRNA外的rRNA和tRNA互補(bǔ)，從而造成高背景；另外，細(xì)菌侵襲過程中，使用DNA芯片分析基因表達(dá)情況時，細(xì)菌RNA通常會混有宿主細(xì)胞RNA,隨機(jī)引物不僅能標(biāo)記細(xì)菌RNA，也能標(biāo)記宿主細(xì)胞RNA，以致降低了細(xì)菌RNA檢測的靈敏度，增加了非特異性雜交信號。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服隨機(jī)引物標(biāo)記探針的靈敏度低及非特異性強(qiáng)的不足，提供一種基于傷寒沙門菌基因組序列的GDP引物。該引物在傷寒沙門菌DNA芯片基因表達(dá)譜分析中標(biāo)記RNA時，不僅可提高靈敏度和特異性，還可用于活體條件下的基因表達(dá)譜分析，避免宿主細(xì)胞RNA所產(chǎn)生的影響，同時可指導(dǎo)已知序列基因組的擴(kuò)增。本發(fā)明所說的基于傷寒沙門菌基因組序列的基因組特異引物，含有引物34條，其3序列如下-1GCGGCG2ACGCCG3CAGCAG4TCATCA5GCCAGA6CGCCAA7GGTTTT8ATCCAG9TTTCAT10GCGATA11TATTTT12GCCTGA13CGGCAA14AAAATC15TGCCGT16GCGCAT17AAATGC18ATTTGC19ATAAAT20TGAATA21ATTTCC22CAGTAC23ATACCG24TGGCGC25AACAAT26CGTAAC27TTACCA28CTGTTG29GCGGAT30CAATCA31GGTGTT32ACGTGG33GAGCGC34CACGCA上述所說基因組特異引物，是通過下述方法設(shè)計(jì)得到使用FindGDPs軟件設(shè)計(jì)，如圖1所示，設(shè)計(jì)GDP引物時需滿足1)針對基因組所有序列做出篩選；2)針對所選目的基因3'-端50%的序列作為靶標(biāo)設(shè)計(jì)全基因組特異引物；3)引物長度為6bp;4)所設(shè)引物對ORF的覆蓋率。根據(jù)以上條件，我們共設(shè)計(jì)合成34條GDP引物，每條引物及其覆蓋率詳見表1。本發(fā)明的有益效果運(yùn)用傷寒沙門菌DNA芯片用基因組特異引物能對細(xì)菌mRNA進(jìn)行選擇性標(biāo)記，提高標(biāo)記的靈敏度和特異性。使得傷寒沙門菌全基因組DNA芯片的應(yīng)用范圍增加，不僅可用于傷寒沙門菌的體外基因表達(dá)譜研究，還可用于體內(nèi)的基因表達(dá)譜研究，對開展傷寒沙門菌的致病機(jī)理研究，以及作為原核模式生物的研究平臺，對認(rèn)識生物細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)研究，具有極其重要的作用。下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。圖1.本發(fā)明GDP引物設(shè)計(jì)流程具體實(shí)施例方式本實(shí)施例以比較GDP引物和隨機(jī)引物標(biāo)記探針的基因表達(dá)譜差異為例說明具體過程為(1)GDP引物的設(shè)計(jì)使用FindGDPs軟件設(shè)計(jì)，流程如圖1所示，1)目的基因選定選擇全部傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株Ty2全基因組基因(保藏號:ATCC19430;來源日本岐阜大學(xué)病原微生物保存中心；全基因組序列基因BANK登錄號AE014613)，剔除所有IS序列相關(guān)基因、整合酶基因、轉(zhuǎn)座酶基因及大小在150bp以下的基因、彼此間在核苷酸水平上高度同源的基因，再加選傷寒沙門菌z66陽性株(保藏號3P91;來源日本岐阜大學(xué)病原微生物保存中心；部分基因序列信息基因BANK登錄號AB108532)和CT18菌株(保藏號3P97;來源日本岐阜大學(xué)病原微生物保存中心；全基因組序列基因BANK登錄號AL513382)獨(dú)有基因41條，及作為陽性對照的傷寒沙門菌16SrRNA基因，最后共選定傷寒沙門菌4224條基因，導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫，待用。2)候選反向引物的確定以所選4224條目的基因序列的3'-端50%的序列為靶標(biāo)設(shè)計(jì)獲得反向引物，將每個目的基因序列的3'-端50%的序列(共4224條)，導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫。每個目的基因序列的3'-端50%的序列中每6個堿基構(gòu)成一個引物，存于單獨(dú)的反向引物表中，待用。3)最佳反向引物的確定大部分序列中均能blast到的候選反向引物確定為最佳反向引物，存于最佳反向引物表。最后挑選出能夠覆蓋所有序列的系列6堿基引物作為基5因組特異引物，用于傷寒沙門菌DNA芯片基因表達(dá)譜分析。根據(jù)以上條件，我們共設(shè)計(jì)合成34條GDP引物，每條引物及其覆蓋率詳見表l。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(2)基因表達(dá)譜的應(yīng)用將傷寒沙門菌z66陽性野生菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長期，提取出穩(wěn)定的RNA后，分3份，一份取20嗎的RNA,以六堿基隨機(jī)引物或上述GDP引物分別標(biāo)記獲得cDNA探針，標(biāo)記過程使用SuperScriptIII反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)直接摻入法摻入Cy5-dCTP。一份則以1:50的比例摻入單細(xì)胞系THP-1(ATCCTIB-202)RNA至20嗎，再分別使用六堿基隨機(jī)引物或GDP引物標(biāo)記獲得摻入Cy3-dCTP的cDNA探針。分別混合六堿基隨機(jī)引物標(biāo)記獲得的兩種cDNA和GDP引物標(biāo)記獲得的兩種cDNA,QiaquickPCRpurificationkit(Qiagen)純化后，65。C分別與兩張芯片雜交，用GenePixPersonal4100芯片掃描儀(AxonInstruments)掃描芯片。經(jīng)分析，與純傷寒沙門菌RNA獲得的熒光信號相比，兩種引物標(biāo)記的混合RNA均含有非特異性的熒光信號(可能是由于單細(xì)胞系THP-1具有與傷寒沙門菌相似序列導(dǎo)致)，其中GDP引物標(biāo)記的探針，獲得的熒光信號中非特異性熒光信號為12.3%,而隨機(jī)引物標(biāo)記的探針，非特異性熒光信號高達(dá)34.6%。由此可見，GDP引物相較隨機(jī)引物而言，降低了對RNA純度和濃度的要求，更適合于活體的基因表達(dá)譜研究，可提高靈敏度及特異性，為疫苗的研制及藥物治療奠定了一定基礎(chǔ)。SEQUENCELISTING<110>江蘇大學(xué)<120>用于傷寒沙門菌DNA芯片轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜的基因組特異引物<130><160>34<170>Patentlnversion3.3<210><211><212><213>16DNA人工序列<400>1gcggcg<210><211><212><213>26DNA人工序列<400>2acgccg<210><211><212><213>36DNA人工序列<400>3cagcag<210><211><212><213>46DNA人工序列<400>tcatca<210><211><212><213>6DNA人工序列<400>gccaga<210><211><212><213>66DNA人工序列<400>6cgccaa<210><211><212><213>6DNA人工序列<400>ggtttt<210><211><212><213>86DNA人工序列<400>8atccag<210><211><212>96DNA9<213>人工序列<400>9tttcat6<210>10<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>10gcgata6<210>11<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>11tatttt6<210>12<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>12gcctga6<210>13<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>13cggcaa6<210>14<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>14aaaatc<210><211><212><213>156DNA人工序列<400>15tgccgt<210><211><212><213>166DNA人工序列<400>16gcgcat<210><211><212><213>176DNA人工序列<400>17aaatgc<210><211><212><213>186DNA人工序列<400>18atttgc<210>19<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>19ataaat6<210>20<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>20tgaata6<210>21<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>21atttcc6<210>22<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>22cagtac6<210>23<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>23ataccg6<210>24<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>24tggcgc<210>25<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>25aacaat6<210>26<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>26cgtaac<210>27<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>27ttacca6<210>28<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>28ctgttg6<210><211><212><213><400>gcggat<210><211><212><213><400>csatca<210><211><212><213><400>ggtgtt<210><211><212><213><400>acgtgg<210><211><212><213><400>gagcgc296DNA人工序列296306DNA人工序列306316DNA人工序列316326DNA人工序列326336DNA人工序列33'614<210>34<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>34cacgca權(quán)利要求1.一種用于傷寒沙門菌DNA芯片轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜的基因組特異引物，其特征在于，含有特異引物34條，其序列如下1)GCGGCG2)ACGCCG3)CAGCAG4)TCATCA5)GCCAGA6)CGCCAA7)GGTTTT8)ATCCAG9)TTTCAT10)GCGATA11)TATTTT12)GCCTGA13)CGGCAA14)AAAATC15)TGCCGT16)GCGCAT17)AAATGC18)ATTTGC19)ATAAAT20)TGAATA21)ATTTCC22)CAGTAC23)ATACCG24)TGGCGC25)AACAAT26)CGTAAC27)TTACCA28)CTGTTG29)GCGGAT30)CAATCA31)GGTGTT32)ACGTGG33)GAGCGC34)CACGCA。全文摘要本發(fā)明屬于生物信息學(xué)及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及用于傷寒沙門菌DNA芯片轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜的基因組特異引物，共34條。它是通過FindGDPs軟件針對傷寒沙門菌基因組序列所有基因3′-端50％的序列為靶標(biāo)設(shè)計(jì)的全基因組特異引物。用于傷寒沙門菌基因轉(zhuǎn)錄譜分析時提高了靈敏度及特異性；活體條件下基因表達(dá)譜分析時降低了對傷寒沙門菌RNA純度和濃度的要求，特異性高；同時可指導(dǎo)已知序列基因組的擴(kuò)增以構(gòu)建基因文庫。文檔編號C12Q1/68GK101575638SQ20091003116公開日2009年11月11日申請日期2009年4月24日優(yōu)先權(quán)日2009年4月24日發(fā)明者張海方,徐順高,生秀梅,許化溪,黃新祥申請人:江蘇大學(xué)