專利名稱：：利用混合菌種提高天然牧草生產(chǎn)燃料乙醇利用率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于利用天然多年生牧草生產(chǎn)綠色可再生生物質(zhì)燃料乙醇
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及利用自主篩選的混合優(yōu)化菌種，提高天然多年生牧草及其雜類草生產(chǎn)綠色可再生生物質(zhì)燃料乙醇利用率的方法。二
背景技術(shù)：
：綠色生物燃料乙醇是不加變性劑，可以直接作為燃料使用的無(wú)水乙醇，這種燃料在使用過(guò)程中可降低對(duì)不可再生能源的消耗；燃燒后放出的碳?xì)錃怏w與碳氮?dú)怏w的量明顯少于一般汽油燃燒所產(chǎn)生的此類氣體的量，因而可以有效降低溫室效應(yīng)；燃料乙醇貯運(yùn)方便，且生產(chǎn)原料來(lái)源于綠色可再生物質(zhì)，為綠色低碳汽油。因此，燃料乙醇的使用符合能源、環(huán)境、農(nóng)業(yè)發(fā)展的需要，是為解決能源危機(jī)、環(huán)境惡化、糧食短缺等一系列問(wèn)題而發(fā)展起來(lái)的一種新型、綠色、可再生的替代能源。從原料性質(zhì)看，燃料乙醇的發(fā)展經(jīng)歷了二個(gè)階段。第一階段是以糖類、淀粉類為主要生產(chǎn)原料的發(fā)展階段這個(gè)階段生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，但原料成本占生產(chǎn)成本的40%以上，而且產(chǎn)量的增加有一定的限度，成本也難以降低，以美國(guó)玉米原料生產(chǎn)燃料乙醇為例用于燃料乙醇生產(chǎn)的玉米每增加250萬(wàn)噸，玉米價(jià)格就上漲1.20-2.00美元；中國(guó)能用于燃料酒精生產(chǎn)的糧食原料更有限，形成燃料乙醇生產(chǎn)"與糧爭(zhēng)地，與民爭(zhēng)糧"的尷尬現(xiàn)狀；第二階段是以利用木質(zhì)纖維類物質(zhì)為主的發(fā)展的階段這類物質(zhì)種類繁多，是地球上最豐富的可再生資源；年生物量巨大，蘊(yùn)藏著巨大的生物質(zhì)能，可以為燃料乙醇生產(chǎn)提供充足的原料。天然多年生牧草類群作為木質(zhì)纖維類物質(zhì)的其中一種，在燃料乙醇的生產(chǎn)過(guò)程中具有原料成本價(jià)廉、易獲取、原料周年供應(yīng)；不占用耕地和農(nóng)田、不與牲畜爭(zhēng)飼料；生態(tài)效益顯著的特點(diǎn)，是燃料乙醇生產(chǎn)過(guò)程中極具應(yīng)用價(jià)值的一種原料。相對(duì)于糖類與淀粉類作物，以木質(zhì)纖維類物質(zhì)為底物生產(chǎn)燃料乙醇過(guò)程存在一定的瓶頸，這是因?yàn)槟举|(zhì)纖維類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以降解。木質(zhì)纖維類物質(zhì)主要包括三種主要成分纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，其中纖維素是骨骼物質(zhì)，木質(zhì)素和半纖維素以包容物的形式分散在纖維素之中。木質(zhì)素由松柏醇、芥子醇和對(duì)香豆醇的脫氫聚合物和對(duì)香豆酸組成，由于這三類醇的共聚化產(chǎn)生了不均勻、無(wú)光旋性、交叉鍵合、高度分散及高度抗生物降解的芳香高聚物，對(duì)絕大多數(shù)微生物的攻擊具有抗性，因而木質(zhì)素的分解特別慢，而且木質(zhì)素降解后也無(wú)法形成可發(fā)酵糖類。在完整的木質(zhì)組織中，木質(zhì)素以一種物理屏障的形式存在，包圍在纖維素外圍，保護(hù)纖維素免遭微生物襲擊和降解酶進(jìn)攻，其降解必須先于纖維素分解。因此，木質(zhì)纖維類物質(zhì)的利用必須先進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，以除去木質(zhì)素或破壞木質(zhì)素層，降低纖維素的結(jié)晶度，提高纖維素的可及性，從而達(dá)到有效利用纖維物質(zhì)的目的。常規(guī)預(yù)處理方式包括物理、化學(xué)、生物或混合法。其中物理預(yù)處理成本高，條件苛刻；化學(xué)預(yù)處理試劑回收困難、成本高、有效成分損失率大；物理化學(xué)預(yù)處理成本復(fù)雜，環(huán)境污染嚴(yán)重、試劑回收困難等問(wèn)題。生物預(yù)處理具有處理?xiàng)l件溫和、設(shè)備要求低，處理成本低廉、環(huán)境污染小的優(yōu)勢(shì)，因此，在生產(chǎn)過(guò)程中經(jīng)常被用到。生物預(yù)處理主要通過(guò)微生物生長(zhǎng)過(guò)程中所分解的木質(zhì)纖維素降解酶類對(duì)木質(zhì)纖維類物質(zhì)直接作用，從而達(dá)到有效利用的原理。自然界中能夠進(jìn)行木質(zhì)纖維類物質(zhì)降解的微生物種類較少，而且存在微生物產(chǎn)酶活力低，降解周期長(zhǎng)等需要進(jìn)一步解決的問(wèn)題。因而有效提高微生物的降解能力，縮短微生物的降解周期將有效的提高生物預(yù)處理的效果，進(jìn)而提高木質(zhì)纖維類物質(zhì)生產(chǎn)燃料乙醇的利用率。自然界中，木質(zhì)纖維類物質(zhì)的完全降解是在真菌、細(xì)菌及相應(yīng)微生物群落共同作用下完成的，其中真菌起主導(dǎo)作用。不同微生物生長(zhǎng)過(guò)程所產(chǎn)生的酶的種類與酶的數(shù)量不同，酶的性質(zhì)與酶的作用效果也相應(yīng)的不同，因此將不同的菌種混合，會(huì)產(chǎn)生一定的協(xié)同效應(yīng)，從而有效提高了對(duì)木質(zhì)纖維類物質(zhì)的降解。能夠進(jìn)行木質(zhì)素降解的真菌包括白腐菌、褐腐菌、軟腐菌，其中前二者的木質(zhì)素降解能力較強(qiáng)，主要產(chǎn)生木質(zhì)素降解酶；后者的纖維素降解能力較強(qiáng)，主要產(chǎn)生纖維素降解酶類，它們對(duì)木質(zhì)纖維類物質(zhì)的降解效果也相應(yīng)的不同。將木質(zhì)纖維類降解菌混合，利用菌種間相互協(xié)同效應(yīng)，結(jié)合不同的木質(zhì)纖維素降解酶類，能夠提高對(duì)木質(zhì)纖維類物質(zhì)的降解率，相應(yīng)的提高其燃料乙醇生產(chǎn)的利用性。本發(fā)明研究的主要原理是利用可再生的、能夠周年提供的、綠色、環(huán)保的多年生牧草作用燃料乙醇生產(chǎn)原料，將木質(zhì)素降解菌與纖維素降解菌混合，利用不同菌種的不同產(chǎn)酶特性，從而有效提高多年生天然牧草生產(chǎn)燃料乙醇利用率的方法。由于利用多年生天然牧草生產(chǎn)燃料乙醇，與利用秸稈和陳化糧生產(chǎn)燃料乙醇相比，具有原料成本低廉、易得、可再生、不與人爭(zhēng)糧、不與糧爭(zhēng)地、不與牲畜爭(zhēng)飼料的特點(diǎn)；而利用我們自主篩選的混合菌種協(xié)同作用過(guò)程，條件要求簡(jiǎn)便、設(shè)備簡(jiǎn)單、處理成本低廉，可有效提高多年生天然牧草生產(chǎn)燃料乙醇生產(chǎn)效率，因此，本發(fā)明為提高天然多年生牧草生產(chǎn)燃料乙醇的利用率與轉(zhuǎn)化效率，具有重要的實(shí)際意義與科學(xué)應(yīng)用價(jià)值。誠(chéng)然，經(jīng)我們?cè)趪?guó)家專利網(wǎng)(www.sipo.gov.cn/sipo/default.htm)上和相關(guān)文獻(xiàn)網(wǎng)上檢索結(jié)果表明，"利用混合優(yōu)化菌種提高多年生天然牧草生產(chǎn)燃料乙醇利用率"的研究，尚未見(jiàn)報(bào)道，為我們申報(bào)發(fā)明專利提供了依據(jù)。
發(fā)明內(nèi)容1、本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明關(guān)鍵點(diǎn)是選擇適宜的生物菌種類型，進(jìn)行不同微生物菌種相互配合的問(wèn)題。本發(fā)明利用幾種不同的多年生木質(zhì)素降解菌種與纖維素降解菌種兩兩組合混合培養(yǎng)，通過(guò)混合菌種初篩、復(fù)篩、優(yōu)化與工程制備，尋找能夠協(xié)同生長(zhǎng)、高效產(chǎn)木質(zhì)纖維素降解酶類的混合優(yōu)化菌群，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)多年生天然牧草降解過(guò)程的調(diào)控和優(yōu)化，降解力高，分解力強(qiáng)，能為多年生天然牧草的有效利用，提供有效的生物降解菌群，從而解決木質(zhì)纖維類物質(zhì)生產(chǎn)燃料乙醇的關(guān)鍵技術(shù)難題。2、本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容要點(diǎn)(1)混合菌種的初選經(jīng)大量菌種試驗(yàn)，初步選擇二種木質(zhì)素降解菌雜色云芝(Cw/0/Mversfco/w)、硫磺菌(丄ae";pon^ra/;/we船)；二種高效產(chǎn)纖維素酶的菌種綠色木霉(7Wc/wJmwawW&)、旋孢菌(CocMo6o/肌w);高效產(chǎn)(3-葡糖苷酶的菌種黑曲霉菌種，將選出的菌種作為混合搭配的菌種，倆倆混合，以馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將斜面菌種接種于PDA平板上，觀察菌種間混合生長(zhǎng)的現(xiàn)象，觀察混合菌種的生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)外觀、菌種間相互影響的大?。?2)固態(tài)發(fā)酵復(fù)選進(jìn)一步利用固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，以多年生天然牧草為固態(tài)發(fā)酵原料，進(jìn)行固態(tài)降解實(shí)驗(yàn)。利用無(wú)機(jī)鹽溶液為混合菌種提供所需的營(yíng)養(yǎng)元素，固定固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)時(shí)間，并測(cè)定固態(tài)發(fā)酵過(guò)程混合菌種產(chǎn)生的木質(zhì)素降解酶活性、纖維素酶降解酶活性、天然多年生牧草中三素含量的變化，篩選能夠協(xié)同配合固態(tài)發(fā)酵的混合菌種類型；(3)菌種優(yōu)化組合將混合菌種與單一菌種所產(chǎn)生的降解酶的種類與降解酶活性的高低進(jìn)行對(duì)比，優(yōu)選所產(chǎn)生的降解酶活性強(qiáng)，木質(zhì)纖維類物質(zhì)降解率高的混合優(yōu)化組合，進(jìn)一步觀察其混合生長(zhǎng)的現(xiàn)象。(4)優(yōu)化混合菌種的工程制備將所篩選出的優(yōu)化混合菌種在一定的條件下，經(jīng)過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)成為具有一定數(shù)量和質(zhì)量的生產(chǎn)菌種，以作為進(jìn)一步擴(kuò)大菌體量及合成產(chǎn)物之用，其工程制備包括孢子制備和菌絲體制備。3、本發(fā)明的有益效果(1)操作過(guò)程簡(jiǎn)單菌種混合與單一菌種降解作用原理不同，但處理方式相同，利用利用微生物產(chǎn)生的酶對(duì)多年生牧草直接作用，因此本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、處理?xiàng)l件溫和、可達(dá)性強(qiáng)。(2)生產(chǎn)成本低廉由于在處理過(guò)程中，不需要使用耐高溫、耐高壓、耐腐蝕性強(qiáng)的儀器與設(shè)備；而且不需要過(guò)多使用額外的水、電、化學(xué)試劑等物質(zhì)，因而，分析投入成本低廉。(3)可有效提高木質(zhì)素降解率由于優(yōu)化菌種混合后，可提高菌種的協(xié)同互促效應(yīng)，產(chǎn)酶活性大大提高，對(duì)木質(zhì)素降解有利的酶的活力大大增強(qiáng)，因而分解木質(zhì)素的降解能力相應(yīng)得到增強(qiáng)。根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)，運(yùn)用優(yōu)化混合菌種配合后，木質(zhì)素降解率提高了46.25%，纖維素降解率提高了10.09%，半纖維素降解率提高了11%。(4)可有效提高木質(zhì)纖維類物質(zhì)的利用率由于利用混合菌種比單一菌種可使木質(zhì)纖維素的降解率提高，使三素交聯(lián)結(jié)構(gòu)得到的有效打破，從而可有效提高木質(zhì)纖維類物質(zhì)的利用率，為木質(zhì)纖維類物質(zhì)提供充足的分解菌種，提高了燃料乙醇的生產(chǎn)原料的利用率。四1、圖l:顯示雜色云芝與綠色木霉混合在平板上的生長(zhǎng)狀況。2、圖2:顯示綠色木霉與硫磺菌SJ在平板上的生長(zhǎng)狀況。3、圖3:顯示雜色云芝與長(zhǎng)毛在平板上的生長(zhǎng)狀況。4、圖4:顯示長(zhǎng)毛與黑曲霉在平板上的生長(zhǎng)狀況。五、具體實(shí)施方案1、培養(yǎng)基制備與菌種培養(yǎng)條件-(1)PDA培養(yǎng)基(gl")制備取去皮新鮮馬鈴薯200g切成小塊放入鍋中，加水1000ml，煮沸20min后，用兩層紗布過(guò)濾。過(guò)濾液中加入葡萄糖20g、瓊脂17g，自來(lái)水定容至1000ml，12rC滅菌20min。PDA液體培養(yǎng)基中不加入相應(yīng)的瓊脂。(2)固體發(fā)酵培養(yǎng)基制備5g白茅粉末，加入30ml無(wú)機(jī)鹽溶液，放入300ml的三角瓶中，120。C滅菌20min。(3)無(wú)機(jī)鹽溶液(g")配制Massadeh配方作稍微的改動(dòng)，其中含有NaC10.5，MgSO40.5,(NH4)SO40.5，KH2PO40.5，Ca(NO3)20.3，F(xiàn)eS04.7H200.01,MnS040.015，ZnS04.7H200.015，Co(NO3)20.01。(4)菌種培養(yǎng)條件菌種初選與復(fù)篩在PDA固體培養(yǎng)平板、28'C條件培養(yǎng)，混合菌種在平板上的接種距離相距2cm左右。三種菌種在平板上各接種三點(diǎn)，形成兩個(gè)倒三角形；固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中將菌種倆倆互配，三點(diǎn)法接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基，28"固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)15d。(5)酶活測(cè)定液的制備準(zhǔn)確稱取固態(tài)發(fā)酵樣lg放入20ml離心管中，按1:10的比例加入去離子水，放于150rpm.min"搖床中振蕩浸提lh后，再將離心管放入5000rpm.min—1轉(zhuǎn)速的離心機(jī)中離心15min，上清液為酶活測(cè)定液。2、成分測(cè)定采用方法(1)測(cè)定成分漆酶(Lac)、錳依賴過(guò)氧化物酶(MnP)、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(LiP)、羧甲基纖維素酶(CMC)、濾紙酶活、木質(zhì)素、纖維素、半纖維素。(2)測(cè)定采用方法Lac、MnP、LiP、CMC、濾紙酶、P-葡糖苷酶活性的測(cè)定采用分光光度法，測(cè)定底物分別是愈創(chuàng)木酚、藜蘆醇、硫酸錳、羥甲基纖維素鈉、濾紙與水楊素，酶活性用每分鐘生成底物的毫摩爾數(shù)表示1U。木質(zhì)素、纖維素與半纖維素的測(cè)定采用改良王玉萬(wàn)法，用中性與酸性洗滌劑處理后，再用丙酮與水洗，將殘?jiān)娓珊?，用差減法進(jìn)行計(jì)算。3、菌種生長(zhǎng)、產(chǎn)酶與三素分解變化的觀測(cè)(1)混合菌種在平板上的生長(zhǎng)狀況觀測(cè)混合菌種的生長(zhǎng)狀況，詳見(jiàn)附圖1-4，從圖1-4可見(jiàn)，菌種組合后，根據(jù)混合菌種的不同，出現(xiàn)不同的生長(zhǎng)現(xiàn)象。具體以菌落的生長(zhǎng)速度、菌落的擴(kuò)展速度，菌落的覆蓋強(qiáng)度為觀測(cè)的指標(biāo)。表現(xiàn)為一株生長(zhǎng)相對(duì)較慢，并且逐漸被另一株不斷擴(kuò)大的菌株所覆蓋；兩株菌的生長(zhǎng)與擴(kuò)展相同，在所考察的時(shí)間內(nèi)，各自占有一定的培養(yǎng)空間，而且菌株之間沒(méi)有相互的交叉接觸；菌株生長(zhǎng)較快，菌落迅速擴(kuò)展，但菌落之間不出現(xiàn)相互的接觸現(xiàn)象，菌落間有明顯的空隙；兩種菌株的生長(zhǎng)都較好，菌絲伸長(zhǎng)較快，在菌落的接觸處，菌絲相互交錯(cuò)。(2)菌種在固態(tài)培養(yǎng)基上產(chǎn)酶狀況觀測(cè)從表2可見(jiàn)，不同菌種處理在固態(tài)培養(yǎng)基上的產(chǎn)酶狀況，由表1可見(jiàn)，黑曲霉高產(chǎn)(3-葡糖苷酶，雜色云芝高產(chǎn)Lac，同時(shí)也產(chǎn)生較高的CMC;綠色木霉高產(chǎn)CMC;SJ同時(shí)產(chǎn)生三種纖維素酶與MnP，但不產(chǎn)生Lac;長(zhǎng)毛菌產(chǎn)生一定的CMC、濾紙酶活與(3-葡糖苷酶。菌種混合培養(yǎng)所產(chǎn)生的酶活性的高低與種類與菌種單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的不同，由表1結(jié)果可以看出雜色云芝與綠色木霉混合培養(yǎng)，木質(zhì)素降解酶與纖維素酶的活性較單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)提高；雜色云芝與長(zhǎng)毛混合，各種酶的活性較菌種單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)高，其纖維素酶活性的增加較云芝與木霉混合時(shí)高；雜色云芝與黑曲霉混合后纖維素酶活性得到增強(qiáng)，而木質(zhì)素降解酶與卩-葡糖苷酶的活性下降；黑曲霉與綠色木霉混合后，纖維素酶活性大大增強(qiáng)，但木質(zhì)素降解酶活性較菌種單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)下降；黑曲霉與SJ混合培養(yǎng)時(shí)不產(chǎn)生Lac，產(chǎn)生較SJ單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)高的MnP活性；SJ與木霉混合培養(yǎng)，其纖維素酶活性升高，但MnP活性較木霉單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)低；長(zhǎng)毛與黑曲霉混合培養(yǎng)時(shí)其p-葡糖苷酶活性顯著增加，但濾紙酶與CMC酶活較黑曲霉單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)低；長(zhǎng)毛與木霉混合所產(chǎn)生的幾種酶的活性都較菌種單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)低。雜色云芝與綠色木霉菌混合、綠色木霉與黑曲霉混合、雜色云芝與長(zhǎng)毛菌混合對(duì)酶的產(chǎn)生與酶活性的提高，有積極的、互助的效應(yīng)和明顯的促進(jìn)效果。表l.不同菌種處理在固態(tài)培養(yǎng)基上的產(chǎn)酶狀況<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>不同酶活(Uml—1)CMC濾紙卩-葡糖苷漆酶錳依賴(3)天然牧草白茅中的三素變化情況觀測(cè)從表2可見(jiàn)，單一菌種與混合菌種對(duì)白茅成分的影響；由表3可見(jiàn)，單一菌種固態(tài)發(fā)酵15d，白茅中三種主要成分的含量發(fā)生了不同程度變化。幾種菌種對(duì)木質(zhì)纖維素均有一定的降解能力。從總纖維素的變化量看，接種綠色木霉菌處理的總纖維素含量降低最大，其次為雜色云芝與長(zhǎng)毛，SJ與黑曲霉的總纖維素的降低量最小。從半纖維素的變化情況看，不同處理半纖維素含量減小均不明顯，SJ處理的半纖維素含量幾乎沒(méi)有變化。從纖維素的變化量看，綠色木霉降解纖維素的能力最強(qiáng)，其次為長(zhǎng)毛與雜色云芝，黑曲霉的分解能力最低。從木質(zhì)素的變化量看，雜色云芝降解木質(zhì)素的能力最強(qiáng)，其次為SJ與綠色木霉。優(yōu)化菌種混合培養(yǎng)，白茅中三素含量發(fā)生了顯著的變化，有幾種菌種組合對(duì)白茅中三素的降解有明顯的促進(jìn)效果，它們分別是綠色木霉與雜色云芝混合、雜色云芝與長(zhǎng)毛。綠色木霉菌與雜色云芝混合，對(duì)白茅中木質(zhì)素的降解效果最好；SJ與黑曲霉、SJ與綠色木霉菌混合對(duì)木質(zhì)素的降解效果也較好；黑曲霉與綠色木霉混合，能夠有效促進(jìn)對(duì)纖維素與半纖維素的降解，半纖維素含量下降了4.2%。表3表示了不同菌種處理對(duì)白茅中不同成分的降解率，由表3可見(jiàn)，單一菌種處理纖維素的降解效果較好，降解率可以達(dá)到30%-49%，而對(duì)木質(zhì)素與半纖維素的降解效果較差，特霉木云曲色色毛黑綠雜長(zhǎng)w降解率(％)菌種木質(zhì)素纖維素半纖維素總纖維量雜色云芝17.8939.904.0523.94黑曲霉7.631.086.4917.90長(zhǎng)毛10.7142.286.1023.68綠色木霉11.8148.4416.029.55SJ12.3233.336.0020.02云芝+木霉64.1449.9924.8746.70云芝+SJ61.3842.5033.4544.99云芝+黑曲55.8644.2921.6941.01云芝+長(zhǎng)毛62.3046.6228.0545.57黑曲+木霉48.5148.5531.7543.81SJ+黑曲62.3047.5520.5043.87SJ+木霉51.7248.2820.8641.48長(zhǎng)毛+黑曲45.2951.7024.0442.20長(zhǎng)毛+木霉43.9152.9425.7442.88長(zhǎng)+黑+SJ59.0850.5026.3145.989別是半纖維素的降解率較低。混合菌種處理，白茅中的三素含量發(fā)生了不同程度的降解，其中纖維素的降解率提高了10.09%，長(zhǎng)毛與綠色木霉菌混合對(duì)纖維素的降解率最大，雜色云芝與SJ混合對(duì)纖維素的降解率最低；木質(zhì)素的降解率較單一菌種降解，降解率提高了46.25%，表2.不同菌種處理白茅中三素的變化情況木質(zhì)素石二木霉云芝+木霉云芝+SJ云芝+黑曲云芝+長(zhǎng)毛黑曲+木霉SJ+黑曲SJ+木霉長(zhǎng)毛+黑曲長(zhǎng)毛+木霉長(zhǎng)+黑+SJ17.8620.1019.4219.1819.077.88.49.68.211.28.210.511.912.28.9成分含j纖維素(%)半纖維素總纖維]22.1625.4121.2819.0124.5818.4421.2020.5419.6818.9719.3419.0717.8117.3518.2522.0362.0521.4766.9821.5662.2619.2857.4721.5965.2417.2543.4915.2844.8817.9848.1216.5244.4015.6745.8418.2545.7918.1747.7417.4447.1517.0546.6016.9244.07表3.不同菌種處理對(duì)白茅中三素的降解率色曲毛色w雜黑長(zhǎng)綠其中雜色云芝與綠色木霉菌混合對(duì)木質(zhì)素的降解率最高，其次為雜色云芝與長(zhǎng)毛菌混合培養(yǎng)，長(zhǎng)毛菌與綠色木霉菌混合對(duì)木質(zhì)素的降解效果最差；不同菌種處理對(duì)半纖維素的降解率較小，單一菌種降解，白茅的半纖維素的降解率為4.05-16.0%，菌種混合對(duì)半纖維素的降解有明顯的促進(jìn)作用，降解率為20.86-33.45%;菌種混合后總纖維素降解率提高，降解率為41.01-46.70?；旌蟽?yōu)化菌種固態(tài)發(fā)酵過(guò)程對(duì)天然牧草的三素的降解有明顯的促進(jìn)作用，提高了天然牧草生產(chǎn)燃料乙醇的利用率。4.混合優(yōu)化菌種的工程制備將所篩選出的優(yōu)化混合菌種在一定的條件下，經(jīng)過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)成為具有一定數(shù)量和質(zhì)量的生產(chǎn)菌種，以作為進(jìn)一步擴(kuò)大菌體量及合成產(chǎn)物之用，其工程制備包括孢子制備和菌絲體制備等系列過(guò)程(詳細(xì)過(guò)程略)。權(quán)利要求1、一種提高天然多年生牧草及其雜類草生產(chǎn)綠色可再生生物質(zhì)燃料乙醇利用效率的方法，其特征是由多年生木質(zhì)素降解菌與纖維素降解菌混合優(yōu)化培養(yǎng)而成，由以下步驟構(gòu)成(1)混合菌種初選在PDA固態(tài)培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)大量菌種試驗(yàn)，初步選擇能夠進(jìn)行混合的多年生木質(zhì)素降解菌與纖維素降解菌，以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將斜面菌種培養(yǎng)7d，觀察菌種在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)外觀、菌種間相互作用的現(xiàn)象；(2)固態(tài)發(fā)酵復(fù)選利用固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，將能夠混合的菌種，在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上以一定的接種比例接種，固態(tài)發(fā)酵測(cè)定木質(zhì)素降解酶活性、纖維素降解酶活性、天然牧草中三素含量的變化，篩選能夠協(xié)同配合固態(tài)發(fā)酵的混合菌種；(3)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)化將混合菌種與單一菌種所產(chǎn)生的降解酶的種類與降解酶活性的高低進(jìn)行對(duì)比，優(yōu)選所產(chǎn)生的降解酶活性強(qiáng)，多年生木質(zhì)纖維類物質(zhì)降解率高的混合優(yōu)化組合，進(jìn)一步觀察其混合生長(zhǎng)的現(xiàn)象；(4)優(yōu)化菌種組合工程制備將所篩選出的優(yōu)化混合菌種在一定的條件下，經(jīng)過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)成為具有一定數(shù)量和質(zhì)量的生產(chǎn)菌種，以作為進(jìn)一步擴(kuò)大菌體量及合成產(chǎn)物之用。其工程制備包括孢子制備和菌絲體制備等。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述提高天然多年生牧草及其雜類草生產(chǎn)綠色可再生生物質(zhì)燃料乙醇利用效率的方法，其特征是木質(zhì)素降解菌為雜色云芝(CoHo/mw&co/w)或硫磺菌a^印omyw/p/we^)，纖維素降解菌為綠色木霉(7Wc/zofl^wav/n'&)、旋胞菌(CocW/o6o/肌i^)或黑曲霉"5pwg/〃^w'gw)為優(yōu)化混合菌種群。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述提高天然多年生牧草及其雜類草生產(chǎn)綠色可再生生物質(zhì)燃料乙醇利用效率的方法，其特征是混合優(yōu)化菌種組合為雜色云芝與綠色木霉菌種組合、雜色云芝與長(zhǎng)毛菌組合及工程制備。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述提高天然多年生牧草及其雜類草生產(chǎn)綠色可再生生物質(zhì)燃料乙醇利用效率的方法，在利用木質(zhì)纖維類物質(zhì)作燃料乙醇生產(chǎn)原料中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于利用天然多年生牧草生產(chǎn)綠色可再生生物質(zhì)燃料乙醇
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及利用自主篩選混合優(yōu)化菌種提高天然多年生牧草及其雜類草生產(chǎn)綠色可再生生物質(zhì)燃料乙醇利用率的方法。本發(fā)明初步選擇能夠混合生長(zhǎng)的木質(zhì)素降解菌與纖維素降解菌；再經(jīng)過(guò)固態(tài)發(fā)酵復(fù)選、優(yōu)化菌種組合、優(yōu)化混合菌種工程制備的方式，將雜色云芝、硫磺菌、綠色木霉、黑曲霉、長(zhǎng)毛菌五種菌種兩兩混合，固態(tài)發(fā)酵優(yōu)選出混合菌種組合-雜色云芝與綠色木霉、雜色云芝與長(zhǎng)毛，固態(tài)發(fā)酵天然多年生雜類草，使木質(zhì)素的降解率較單一菌種發(fā)酵提高46.25％，纖維素降解率較單一菌種發(fā)酵提高10.09％，半纖維素降解率提高11％。該方法操作簡(jiǎn)單易行，可有效提高木質(zhì)素降解率和木質(zhì)纖維類物質(zhì)的利用率，大大降低生產(chǎn)成本，提高了利用多年生天然牧草生產(chǎn)生物燃料乙醇的利用率和轉(zhuǎn)化效率，為發(fā)展能源草業(yè)提供了科學(xué)支撐。文檔編號(hào)C12R1/645GK101591679SQ20091003202公開(kāi)日2009年12月2日申請(qǐng)日期2009年7月7日優(yōu)先權(quán)日2009年7月7日發(fā)明者醉余,李建龍,娟范,趙蕓晨申請(qǐng)人:南京大學(xué)