專利名稱：一種蠟狀芽孢桿菌及其在促進(jìn)楊樹生長(zhǎng)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物肥料領(lǐng)域中的微生物肥料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種楊樹根際高效解磷 的蠟狀芽孢桿菌及其在促進(jìn)楊樹生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
磷在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，是植物必需的重要營(yíng)養(yǎng)元素之一。我國(guó)耕
地土壤中有1/3~1/2的土壤缺磷，但這種缺磷是"遺傳學(xué)缺磷"而非"土壤學(xué)缺磷"，即土壤 有效磷含量很低，而大部分土壤磷處于植物不能吸收利用的有機(jī)和無(wú)機(jī)磷化物狀態(tài)。其中， 有機(jī)磷化物是土壤磷的重要組成部分，約占土壤總磷量的1/3 1/2，主要有核酸、植素和磷 脂三大類，它們一般必須經(jīng)過(guò)降解、礦化才能被植物吸收利用。土壤有機(jī)磷的礦化和積累 是以土壤解有機(jī)磷微生物為中介，在磷酸酶的作用下進(jìn)行的。土壤解磷微生物分泌的酸性 或堿性磷酸酶，將核酸、植酸鹽、磷脂等有機(jī)磷化物水解，轉(zhuǎn)化為簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)磷化物被植 物吸收利用。研究表明，土壤解有機(jī)磷微生物一般約占土壤微生物總數(shù)的30%~60%。與 真菌、放線菌相比，植物根際細(xì)菌被認(rèn)為是最有效的解有機(jī)磷微生物。
解有機(jī)磷細(xì)菌的研究可以追溯到20世紀(jì)初，1935年前蘇聯(lián)學(xué)者蒙金娜從土壤中分離 到一種解磷巨大芽孢桿菌(5"c77/^ var. phosphaticum)分解核酸和卵磷脂的能
力很強(qiáng)，并于1947年大量生產(chǎn)使用。結(jié)果表明，接種土壤后使得P205含量提高了 15%以 上。我國(guó)對(duì)解磷細(xì)菌的研究起步于上世紀(jì)50年代。1950年，前東北農(nóng)科所從東北黑土中 分離出能分解有機(jī)磷的巨大芽孢桿菌。同年，中國(guó)科學(xué)院前林業(yè)土壤研究所從東北黑土中 分離出一種假單胞菌(i^e"cfowo"^sp.)也具有分解核酸和卵磷脂的能力。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)， 目前報(bào)道的具有降解有機(jī)磷化物的細(xì)菌種類主要有芽孢桿菌屬的一些種，如巨大芽孢桿 菌(5flc!7/wswegfl//2m'ww)、蠟狀芽孢桿菌(5flcz7/wwew)等；變形菌屬的一些種(尸ra/e^ spp.);沙雷氏菌屬的一些種(&AT"Z/fl spp.)。 20世紀(jì)80年代以后，國(guó)內(nèi)許多單位相繼開 發(fā)出了有多種芽孢桿菌組成的復(fù)合解磷菌制劑，微生物肥料的研究及開發(fā)得到了高度重 視。目前，國(guó)內(nèi)外有不少文獻(xiàn)指出，向土壤或作物根系接種解磷菌，能夠促進(jìn)小麥、青菜、 玉米、莜麥、甘藍(lán)、花生、油菜、柱花草等農(nóng)作物的生長(zhǎng)，但至今未見向多年生作物接種 解磷微生物的研究報(bào)道。
楊樹是我國(guó)中緯度平原地區(qū)栽培面積最大、木材產(chǎn)量最高的速生用材樹種之一。目前， 我國(guó)楊樹人工林面積居世界首位，對(duì)緩解我國(guó)的工業(yè)用材不足和改善我國(guó)生態(tài)環(huán)境起到了 不可替代的作用。但楊樹因生長(zhǎng)快，輪伐期短且頻，大量消耗了土壤養(yǎng)分，我國(guó)部分地區(qū) 楊樹人工林出現(xiàn)了地力衰退現(xiàn)象，嚴(yán)重影響了楊樹人工林的健康發(fā)展。其中，磷素供應(yīng)不
足是突出而具普遍性的問(wèn)題。解決這一問(wèn)題有兩條途徑增加磷源投入和提高土壤難溶性磷利用率。但對(duì)于林業(yè)生產(chǎn)，大面積施用磷肥不僅受到資金限制，且耗竭有限磷礦資源， 引發(fā)能源危機(jī)、環(huán)境污染等問(wèn)題。因此，如何提高土壤磷的利用率已經(jīng)越來(lái)越受到人們的 重視。其中，從土壤中篩選高效解磷微生物，研制解磷菌劑施入土壤，活化土壤中難溶性 磷以供植物吸收利用是低投入高產(chǎn)出的可持續(xù)發(fā)展途徑。由于微生物具有強(qiáng)烈的根際效 應(yīng)，不同土壤、不同作物根際及不同環(huán)境條件下，解有機(jī)磷細(xì)菌的種類和數(shù)量均有所不同。 因此，為了獲得與楊樹親和性好，易于根際定殖的高效解有機(jī)磷細(xì)菌，本發(fā)明從我國(guó)山東 臨沂楊樹人工林根際土壤中分離、篩選獲得了一株高效解有機(jī)磷蠟狀芽孢桿菌(5a"7/w ce^M) JYZ-SD1，通過(guò)接種試驗(yàn)表明其對(duì)楊樹具有明顯促生作用。目前，國(guó)內(nèi)外未見有關(guān) 楊樹解有機(jī)磷細(xì)菌的篩選及應(yīng)用方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種楊樹根際高效降解有機(jī)磷化物的蠟狀芽孢桿菌； 本發(fā)明還要解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供上述蠟狀芽孢桿菌在促進(jìn)楊樹生長(zhǎng)中的應(yīng)用。 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
從山東省臨沂市楊樹根際土壤中，篩選獲得了一株高效降解卵磷脂的蠟狀芽孢桿菌 (5tfc///w ce^M) JYZ-SD1，己保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號(hào)M 209096，保藏日期2009年5月4日。 菌株JYZ-SD1鑒定程序如下
JYZ-SD1菌株主要生物學(xué)特征在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，菌落較大，顏色乳白， 圓形、邊緣整齊；菌體長(zhǎng)桿狀，革蘭氏染色陽(yáng)性，大小約0.98xl.47pm 2.70x3.48nm，中 生芽孢，周生鞭毛；好氧，氧化酶反應(yīng)陰性，接觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性，淀粉水解試驗(yàn)陽(yáng)性，發(fā)酵 葡萄糖，明膠水解試驗(yàn)陽(yáng)性，硝酸還原試驗(yàn)陽(yáng)性，檸檬酸鹽生長(zhǎng)試驗(yàn)陰性；經(jīng)伴胞晶體染 色，未見伴胞晶體出現(xiàn)。
通過(guò)Biolog系統(tǒng)對(duì)JYZ-SD1進(jìn)行鑒定，該菌株在GP2鑒定板上培養(yǎng)4~6h和16~24h 時(shí)的讀數(shù)相似值(SIM值)均為0.930，符合Biolog系統(tǒng)關(guān)于理想結(jié)果的要求且鑒定結(jié)果的相 似性(PROB)均為99%。因此，采用Biolog系統(tǒng)鑒定菌株JYZ-SD1為蠟狀芽孢桿菌和蘇云 金桿菌(5a"7/ws cereus / Aw/wgfera/s)。
JYZ-SDl菌株16SrDNA基因序列，見SEQ ID No.l所示。
將所測(cè)16SrDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)。結(jié)果表明， JYZ-SDl菌株與芽孢桿菌(5ac///tw)同源性都很高，其中與S"c///^ 的相似度為 100%。結(jié)合形態(tài)、Biolog、生理生化及16SrDNA序列分析，JYZ-SD1菌株鑒定為蠟狀芽 孢桿菌(5ad〃ws c"grew51)0
JYZ-SD1菌劑盆栽接種試驗(yàn)表明，該菌劑明顯促進(jìn)了楊樹的生長(zhǎng)發(fā)育。
有益效果JYZ-SD1菌株在蛋黃平板培養(yǎng)條件下，在菌落周圍可產(chǎn)生明顯溶磷圈；
4JYZ-SD1菌株在液體振蕩培養(yǎng)條件下，對(duì)卵磷脂具有較好降解效果，與對(duì)照(CK)相比， 差異顯著；JYZ-SD1制成菌劑接種NL-895楊扦插苗和美洲黑楊實(shí)生苗，結(jié)果表明，該菌 劑明顯促進(jìn)楊樹苗的生長(zhǎng)發(fā)育。因此，本發(fā)明為開發(fā)楊樹磷細(xì)菌肥料提供了'優(yōu)良的菌株資 源。


蠟狀芽孢桿菌(5ac說(shuō)船"wi/5) JYZ-SD1，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC， 保藏編號(hào)M209096，保藏日期2009年5月4曰。
圖1為液體培養(yǎng)條件下JYZ-SD1菌株對(duì)卵磷脂的降解能力； 圖2為蛋黃平板上JYZ-SD1菌株產(chǎn)生的溶磷圈； 圖3為JYZ-SD1菌劑對(duì)美洲黑楊實(shí)生苗促生效果。
具體實(shí)施例方式
根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施 例所描述具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán) 利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
實(shí)施例l:菌株JYZ-SD1平板解磷能力測(cè)定
卵黃培養(yǎng)基牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉5.0g,蒸餾水1000mL，瓊脂15.0-18.0 g， pH7.0，滅菌，待溫度降至50'C左右時(shí)，每50mL中加入3 4mL新鮮蛋黃液(蛋黃與 無(wú)菌生理鹽水等體積混合)，混勻，倒平板。
將活化2次的JYZ-SD1菌株用滅菌牙簽點(diǎn)接于卵黃平板上，3(TC培養(yǎng)3天后，測(cè)量溶 磷圈與菌落直徑，并計(jì)算溶磷圈與菌落直徑之比(圖2)。
從圖2中看出，JYZ-SD1菌株在卵黃平板上培養(yǎng)后，可產(chǎn)生明顯不透明的溶磷圈。經(jīng) 測(cè)量與計(jì)算，溶磷圈直徑為25.81mm，菌落直徑為4.28 mm,溶磷圈與菌落直徑比高達(dá)6.03。
實(shí)施例2:菌株JYZ-SD1液體解磷能力測(cè)定
蒙金娜解有機(jī)磷培養(yǎng)基葡萄糖10.0g，硫酸銨0.5g，氯化鈉0.3g，氯化鉀0.3g， 七水硫酸鎂0,3g，七水硫酸亞鐵0.03g，四水硫酸錳0.03g，卵磷脂0,2g，碳酸鈣5.0g， 蒸餾水1000mL， pH7.0
將活化2次的JYZ-SD1菌株接種NA培養(yǎng)基(牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉 5.0g，蒸餾水1000mL，瓊脂15.0~18.0g， pH7.2~7.4)中，3(TC培養(yǎng)2天后，無(wú)菌水沖洗 菌體制成菌懸液，取lmL菌懸液于含50 niL蒙金娜培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，以接lmL 滅菌菌懸液的蒙金娜培養(yǎng)基為對(duì)照(CK)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，30°C， 180r'min"振蕩培 養(yǎng)72h后，發(fā)酵液4'C, 10000 rmi"離心10 min，鉬銻抗比色法測(cè)定發(fā)酵液中可溶性磷含 量(圖1)。
從圖1中可看出，接種JYZ-SD1菌株發(fā)酵液中可溶性磷含量為1.94mg七"，是對(duì)照 (0.37mg七")的5.17倍。綜上表明，JYZ-SD1菌株對(duì)卵磷脂具有較強(qiáng)的降解能力。實(shí)施例3:菌株JYZ"SD1溫室盆栽試驗(yàn)
將菌株JYZ-SD1活化2 3次后，用接種環(huán)挑取少量菌體接種于含有50 mLNB培養(yǎng) 基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，蒸餾水1000mL, pH7.2 7.4) lOOmL三角瓶 中，30'C， 180r'min"振蕩培養(yǎng)72h。發(fā)酵液(4'C， 6000 rmin1)離心5 min，用無(wú)菌生理 鹽水潤(rùn)洗菌體2 3次后，用無(wú)菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌懸液(7~8X108cfu/mL)制成菌劑。分別 接種NL-895扦插苗和美洲黑楊實(shí)生苗(苗齡60天)，以等量無(wú)菌生理鹽水為對(duì)照，接種 量為扦插苗5mL/株、實(shí)生苗5mL/株。每處理6個(gè)重復(fù)，置于溫室統(tǒng)一管理，光照為12h/ 天，適時(shí)澆水。
NL-895楊扦插苗150天生長(zhǎng)情況(見表1)。從表1可看出，接種JYZ-SD1菌劑明 顯促進(jìn)了NL-895扦插苗的生長(zhǎng)。接種處理NL-895楊的苗高、莖粗、鮮重和干重與CK相 比均有不同程度的增長(zhǎng)。其中，苗高和莖粗比CK分別增長(zhǎng)了 38.14%和15.93%;鮮重和 干重比CK分別增長(zhǎng)了 83.89%和72.22%。
表1 JYZ-SD1對(duì)NL-895楊扦插苗的生長(zhǎng)及生物量
苗高增長(zhǎng)率莖粗增長(zhǎng)率鮮重增長(zhǎng)率干重增長(zhǎng)率
處理
(cm)(0/0)(mm)(%)(g)(%)(g)(%)
JYZ-SEM88.98 ± 18.67b38.148.04 ±1.44b15.9366.79 ± 3,27b83.8924.78 土 4.71b72.22
CK64.42 ± 4.09a—6.94 ± 0.28a—36.32 ± 1.02a—14.39 ± 0.69a一
注P<0.05,同列不同行小寫字母不相同代表差異顯著
美洲黑楊實(shí)生苗90天生長(zhǎng)情況(見表2及圖2)。從表2可看出，接種JYZ-SD1菌 劑明顯促進(jìn)了美洲黒楊實(shí)生苗的生長(zhǎng)。接種處理的美洲黒楊實(shí)生苗的苗高、地徑、鮮重和 干重與CK相比均有不同程度的增長(zhǎng)。其中，苗高和地徑比CK分別增長(zhǎng)了 55.32%和 24.06%;鮮重和干重比CK分別增長(zhǎng)了 121.72%和269.44%。
表2 JYZ-SD1對(duì)美洲黑楊實(shí)生苗的生長(zhǎng)及生物量
處理苗高增長(zhǎng)率 (%)地徑 (nm)增長(zhǎng)率 (%)鮮重 (g)增長(zhǎng)率 (%)干重 (g)增長(zhǎng)率 (%)
53.63 ± 5.20b55.325,84 ± 0,15b2楊20,38 土 2.6b147.47189,62
CK34.53 ± 0.76a—4.71 士 0.18a—8.23 ± 0.34a—2.92土0.22a—
注P<0.05，同列不同行小寫字母不相同代表差異顯著
6SEQUENCE LISTING
<uo>南京林業(yè)大學(xué)
<120> —種蠟狀芽孢桿菌及其在促進(jìn)楊樹生長(zhǎng)中的應(yīng)用 <130〉 FP090501 <160> 1
< 170> Patentln version 3.2
<210> 1
<211> 1323
<212> DNA
<213> Bacillus cereus
<400> 1
gcggcatgct gatccgcgat tactagcgat tccagcttca tgtaggcgag ttgcagccta 60
caatccgaac tgagaacggt tttatgagat tagctccacc tcgcggtctt gcagctcttt 120
gtaccgtcca ttgtagcacg tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc 180
atccccacct tcctccggtt tgtcaccggc agtcacctta gagtgcccaa cttaatgatg 240
gcaactaaga tcaagggttg cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag 300
ctgacgacaa ccatgcacca cctgtcactc tgctcccgaa ggagaagccc tatctctagg 360
gttttcagag gatgtcaaga cctggtaagg ttcttcgcgt tgcttcgaat taaaccacat 420
gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat tcctttgagt ttcagccttg cggccgtact 480
ccccaggcgg agtgcttaat gcgttaactt cagcactaaa gggcggaaac cctctaacac 540
ttagcactca tcgtttacgg cgtggactac cagggtatct aatcctgttt gctccccacg 600
ctttcgcgcc tcagtgtcag ttacagacca gaaagtcgcc ttcgccactg gtgttcctcc 660
atatctctac gcatttcacc gctacacatg gaattccact ttcctcttct gcactcaagt 720
ctcccagttt ccaatgaccc tccacggttg agccgtgggc tttcacatca gacttaagaa 780accacctgcg cgcgctttac gcccaataat tccggataac gcttgccacc tacgtattac 840
cgcggctgct ggcacgtagt tagccgtggc tttctggtta ggtaccgtca aggtgccagc 900
ttattcaact agcacttgtt cttccctaac aacagagttt tacgacccga aagccttcat 960
cactcacgcg gcgttgctcc gtcagacttt cgtccattgc ggaagattcc ctactgctgc 1020
ctcccgtagg agtctgggcc gtgtctcagt cccagtgtgg ccgatcaccc tctcaggtcg 1080
gctacgcatc gttgccttgg tgagccgtta cctcaccaac tagctaatgc gacgcgggtc 1140
catccataag tgacagccga agccgccttt caatttcgaa ccatgcagtt caaaatgtta 1200
tccggtatta gccccggtU cccggagtta tcccagtctt atgggcaggt tacccacgtg 1260
ttactcaccc gtccgccgct aacttcttga gagcaagctc tcaatccatt cgctcgactt 1320 gca
權(quán)利要求
1、一種分離自楊樹根際，能降解卵磷脂的蠟狀芽孢桿菌JYZ-SD1，其分類命名為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號(hào)M 209096，保藏日期2009年5月4日。
2、 權(quán)利要求1所述的蠟狀芽孢桿菌在促進(jìn)楊樹生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分離自楊樹根際、能降解卵磷脂的蠟狀芽孢桿菌JYZ-SD1，其分類命名為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號(hào)M 209096，保藏日期2009年5月4日。本發(fā)明還公開了上述蠟狀芽孢桿菌在促進(jìn)楊樹生長(zhǎng)中的應(yīng)用。JYZ-SD1菌株對(duì)卵磷脂具有較強(qiáng)降解能力；JYZ-SD1菌劑接種NL-895楊扦插苗和美洲黑楊實(shí)生苗，結(jié)果表明，該菌劑能明顯促進(jìn)楊樹苗的生長(zhǎng)。因此，本發(fā)明為開發(fā)楊樹磷細(xì)菌肥料提供了優(yōu)良的菌株資源。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101629147SQ20091003268
公開日2010年1月20日 申請(qǐng)日期2009年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月30日
發(fā)明者輝 劉, 葉建仁, 吳小芹, 王進(jìn)杰 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)