專利名稱：：用rna干涉降低楊樹木質(zhì)素含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的降低楊樹Klason木質(zhì)素含量的方法，尤其涉及一種用RNA干涉降低楊樹Klason木質(zhì)素含量的方法。
背景技術(shù)：
：紙是人們生活的必需品。目前，世界制漿造紙工業(yè)主要以木材為造紙纖維原料，其制漿造紙過程的基本原理是用化學(xué)、機械或兼用化學(xué)及機械的方法將植物原料中的纖維分離出來，再在漿、水混合的懸浮體中使纖維重新交織成均勻而致密的紙張，而纖維的分離實質(zhì)上是使纖維中所含木質(zhì)素取得塑化或溶解的過程。隨著經(jīng)濟快速發(fā)展和人們生活水平提高，不僅對紙的種類和數(shù)量需求越來越大，而且對紙的質(zhì)量要求越來越高，由于楊樹具有速生豐產(chǎn)，適應(yīng)性強，繁殖容易，纖維長，材質(zhì)好等特性，成為了我國主要的紙漿用材林樹種。近年來，隨著產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整和造紙業(yè)的需要，楊樹紙漿林栽植面積逐年擴大。然而，在制漿和造紙中除去木質(zhì)素是一個極大的障礙，原因是木質(zhì)素很結(jié)實，而纖維素很有韌勁，二者很難分開，必須通過劇烈的化學(xué)處理工藝將木質(zhì)素從纖維素中除去。由于林木種內(nèi)木質(zhì)素含量變異小，并且變異受環(huán)境條件的影響大，利用常規(guī)育種方法很難對這一性狀進(jìn)行有效地定向改良，因此，對于林木育種者來說，目標(biāo)是創(chuàng)造出更有利于制漿工業(yè)脫木質(zhì)素的工程植株，并且其木質(zhì)素含量降低和或木質(zhì)素結(jié)構(gòu)改變而植物發(fā)育和抗性不受影響。故木質(zhì)素的遺傳改良具有潛在的重要商業(yè)價值，降低木材木質(zhì)素含量或改變木質(zhì)素結(jié)構(gòu)組成，使得木質(zhì)素在制漿過程中更易被去除，無論是從提高紙漿得率和質(zhì)量、降低造紙經(jīng)濟成本還是環(huán)境保護(hù)方面，都具有重要意義。尤其我國造紙工業(yè)污染嚴(yán)重，從源頭上治理與減少污染，既可減少能源消耗，又能達(dá)到環(huán)境保護(hù)的目標(biāo)。經(jīng)過多年的研究，人們對木質(zhì)素單體的生物合成途徑已有了基本框架性認(rèn)識，普遍認(rèn)為可分為3個主要途徑(1)由植物光合作用初級產(chǎn)物葡萄糖生成苯丙氨酸，酪氨酸(禾本科植物)和色氨酸等的莽草酸途徑；(2)從苯丙氨酸到肉桂酸及其?；o酶A酯的苯丙垸類代謝途徑；(3)從肉桂酰輔酶A酯還原為木質(zhì)素單體以及聚合生成木質(zhì)素的過程稱為木質(zhì)素合成特異途徑?；蚬こ谈淖兡举|(zhì)素含量主要是在木質(zhì)素生物合成途徑過程中的關(guān)鍵酶上，主要使用技術(shù)1、正義和反義RNA轉(zhuǎn)基因技術(shù)，即是通過導(dǎo)入某個酶基因的正義結(jié)構(gòu)或反義結(jié)構(gòu)，影響細(xì)胞內(nèi)酶的含量或活性，引起目的基因的過量表達(dá)或使其表達(dá)受抑制，從而達(dá)到對木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的控制。劉國道等人利用反義RNA技術(shù)，向煙草中導(dǎo)入反向連接的CCoA0MT基因，導(dǎo)致CCoACMT基因含量和活性下降，進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因煙草中木質(zhì)素平均含量降低。同樣地利用反義RNA技術(shù)，在擬南芥，楊樹等植物中也獲得了低木質(zhì)素的轉(zhuǎn)化體。然而反義技術(shù)的應(yīng)用存在一定的局限性，其對內(nèi)源性基因表達(dá)的抑制較弱，往往產(chǎn)生過渡性的表型，會妨礙對目的基因功能的準(zhǔn)確判斷。其抑制效應(yīng)遺傳穩(wěn)定性較差，不能穩(wěn)定可靠地降低目的基因的表達(dá)。2、基因敲除技術(shù)和DNA/RNA嵌合分子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)變技術(shù)，但該方法一次只能研究一個基因，不能有效地對多基因家族進(jìn)行敲除。一些在動植物發(fā)育過程中有關(guān)鍵作用的基因，如果在DNA水平采用基因敲除或突變進(jìn)行可遺傳的修飾，則會過早地基因沉默，產(chǎn)生致死表型，因而無法深入研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供一種用RNA干涉的方法降低楊樹木質(zhì)素的含量，使其用RNA干涉方法抑制楊樹木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶CCR基因在楊樹中的表達(dá)，從而降低楊樹木質(zhì)素含本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種用RNA干涉降低楊樹木質(zhì)素含量的方法，從楊樹中克隆CCR基因片段作為RNA干擾片段，以組成型啟動子CaMV35S啟動表達(dá)，構(gòu)建含CCR基因正反片段的表達(dá)載體，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將CCR基因的正反結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)入楊樹中，通過抗性植株P(guān)CR檢測和對轉(zhuǎn)基因楊樹進(jìn)行Klason木質(zhì)素和綜纖維素含量檢測，植株纖維長寬比及細(xì)胞壁厚度和組織化學(xué)染色測定，檢驗?zāi)康幕虻恼锨闆r和表達(dá)情況，獲得了Klason木質(zhì)素含量降低和綜纖維素含量提高的轉(zhuǎn)基因楊樹植株。用RNA干涉降低楊樹Klason木質(zhì)素含量的方法，主要包括以下步驟(1)根據(jù)楊樹木質(zhì)素合成途徑中關(guān)鍵酶CCR基因的序列，通過序列比對，確定楊樹木質(zhì)素合成酶基因的特異性RNA干擾序列，根據(jù)干涉序列設(shè)計引物，進(jìn)行楊樹木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶CCR基因的干涉片段的特異性擴增；(2)以組成型啟動子CaMV35S啟動表達(dá)，構(gòu)建含CCR基因正反片段的植物表達(dá)載體；(3)轉(zhuǎn)化含有目的干涉片段的載體，并將目的干涉片段整合到楊樹基因組中；(4)對抗性植株P(guān)CR檢測和對轉(zhuǎn)基因楊樹進(jìn)行Klason木質(zhì)素含量和綜纖維素測定以及植株纖維長寬比及細(xì)胞壁厚度和組織化學(xué)染色測定。在所述步驟(1)中，通過同源性搜索和序列比對，確定目的基因片段序列為楊樹CCR基因的第4個外顯子部分序列，即全長CCR基因(GenebankAccessionNumber:AJ295838)的第20662405片段，共340bp。在所述步驟(2)中，以組成型啟動子CaMV35S啟動表達(dá)，把CCR基因正反片段置于啟動子之后，抑制楊樹CCR基因的表達(dá)。在所述步驟(4)中，所述的抗性植株P(guān)CR檢測是通過設(shè)計的CaMV35S特異性引物，進(jìn)行PCR擴增驗證。與已有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點體現(xiàn)在1、本發(fā)明是利用RNA干涉技術(shù)進(jìn)行楊樹品質(zhì)改良。這是RNA干涉技術(shù)首次在該領(lǐng)域進(jìn)行研究與運用，也是本發(fā)明的獨創(chuàng)之處。RNA干涉技術(shù)具有高效性、特異性、可遺傳性、操作簡單等特點，這是傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)和反義RNA技術(shù)所無法比擬的。2、在受體選擇上，傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)和反義RNA技術(shù)所要研究的受體一般是完整的基因序列，對于基因序列不明確的受體，具有明顯的局限性。而利用RNA干涉技術(shù)，只需要知道與受體同源的基因片段，就可對受體進(jìn)行研究，因此，研究范圍較為廣泛。3、在操作方法上，反義RNA技術(shù)一般要構(gòu)建的是含數(shù)千個堿基對的大片段，操作起來較為困難，而RNA干涉技術(shù)中所要構(gòu)建的載體僅僅是含有幾十到幾百個堿基對的小片段，操作簡單、方便，易于運用。另外，一個基因可選擇一到多個干涉片段，可對這些片段或組合進(jìn)行干涉效果的分析、優(yōu)化，以獲得最有效的片段。4、在遺傳穩(wěn)定性上，利用傳統(tǒng)的反義RNA技術(shù)，因全基因轉(zhuǎn)化對受體影響大，會導(dǎo)致受體產(chǎn)生較大變異，且遺傳穩(wěn)定性較差，難以得到優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因作物，但采用該技術(shù)轉(zhuǎn)化的RNA干涉片段小，對受體其它農(nóng)藝性狀影響小，遺傳穩(wěn)定性高，便于獲得對目的基因干涉而其它農(nóng)藝性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因植株。具體實施例方式1.CCR基因特異性RNAi片段的獲得1.1利用改良的CTAB法進(jìn)行楊樹基因組DNA的提取(1)葉片洗凈，去葉脈，稱取lg加石英砂、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、液氮，磨碎分裝入2個5mLdorf管中。(2)力B195^e-巰基乙醇。(3)加1950叱1.5%CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)搖勻。(4)65。C水浴20min，每隔5min輕輕搖勻1次。(5)加1500叱氯仿/異戊醇(24:l)混合液，輕輕搖勻，10000rpm離心10min。(6)取上清液，力n60。C水浴10%CTAB195^L，氯仿/異戊醇(24:1)1950叱，10000rpm離心10min。重復(fù)第5歩兩次。(8)取上清液，加NaAc195ML、無水乙醇2600ML,輕輕搖勻，10000rpm離心5min。(9)棄上清，用3mL75%乙醇洗3次，倒置晾干。(10)加50PL高壓滅菌雙蒸水溶解。(11)取60叱DNA提取液稀釋50倍于UV754紫外可見分光光度計上測定波長260nm、280nm處的吸光度，根據(jù)^6。/^28。值判斷DNA純度，純度在1.8—2.0范圍內(nèi)表明楊樹基因組DNA提取成功。1.2CCR基因片段的PCR擴增根據(jù)CCR基因的全長DNA序列，利用引物設(shè)計軟件設(shè)計了兩對引物(引物1和2，弓|物1和3)，在兩對引物的5'端上分別加入了石a/zHI、SWI、&cI和I酶切位點序列，其中引物1含及^HI酶切位點，引物2含有I和5"scI酶切位點，引物3含有I和I,酶切位點5'端至3'端的序列如下-引物l:5'-ACGGGATCCGGTATTGCTATGGAAAGGC-3'引物2:5'-AAAGTCGACGAGCTCATGGGGTACTCAGGGAAG-3'引物3:5'-ACGTCGACTCTAGAATGGGGTACTCAGGGAAG-3'以提得的基因組DNA為模板，用引物1、2和引物1、3分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性5min，94。C30s,63。C30s，72'C30s，35個循環(huán)，72。C延伸5min。反應(yīng)體系如下ddH2039ML10XPCRbuffer5PLd證(10mM)1PL上游引物(10uM)2禮下游引物(10uM)2MLDNA模板0.6叱Taq酶0.4叱50PL擴增后的產(chǎn)物在含有0.5[ig/mL溴化乙錠(EthidiumBromide)的1.0%瓊脂糖凝膠上電泳。1.3PCR擴增片段的純化(1)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分離要純化的片段；(2)用干凈的無菌手術(shù)刀切下目的DNA條帶放入預(yù)稱重的1.5ml印pendorf管；(3)每O.1g瓊脂糖凝膠需加入200ulSl溶液；(4)于50'C溫育，直至瓊脂糖完全融解；(5)每5ug(不足5ug,以5ug計)DNA需加入5ulDNA結(jié)合液(玻璃粉懸液)，輕輕顛倒混勻，冰上放置IOmin;(6)室溫6000rpm離心20s;(7)棄上清，加700ul乙醇洗液，輕輕抽吸，使玻璃粉懸浮，冰上放置5min;(8)重復(fù)(6)、(7)歩，6000rpm,離心20s;棄上清，小心去除全部殘液；(9)加3050ulTE，輕輕吹打懸浮玻璃粉，50。C溫育10min;(10)室溫6000rpm離心20s，吸上清至新的印pendorf管，于4。C或-20。C保存?zhèn)溆胦(11)將純化的PCR擴增片段送到上海生物工程有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果符合預(yù)期效果。2.C1Q基因siRNA表達(dá)載體的建立2.1RNAi(2CCRi)中間載體構(gòu)建將pUCCRNAi質(zhì)粒(由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物質(zhì)材料與能源實驗室惠贈)和純化的PCR擴增片段(正向和反向)分別用^s/zHI、&7I雙酶切，酶切反應(yīng)體系為20PL，如下所示<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>點動混勻，30'C保溫3h，60。C滅活15min。再加入:ddH207叱10XbufferH2叱&7I1PL10ML點動混勻，37'C保溫3h，60'C滅活15min，于4。C冰箱保存?zhèn)溆谩⒚盖泻蟮膒UCCRNAi質(zhì)粒載體與純化的PCR擴增片段(正向和反向)產(chǎn)物在1.4%瓊脂糖凝膠上電泳，切膠純化回收片段，按下表所示加入各成分，點動混勻，于16'C過夜連接。豐示艦—工對照pUCC腿i11PL酶切純化后的PCR(正向)片段(1F)7ddH207叱10Xligasebuffer1PL1PLT廁ligase1PL1叱然后轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，在含Amp的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行重組子的篩選，根據(jù)載體的酶切位點分析，用尸WI進(jìn)行酶切驗證；酶切反應(yīng)體系如下ddH202PLpUCCRNAi+lF6PL10XbufferH1PL_尸WI_1PL10A點動混勻，37'C保溫3h，60'C滅活15min，1.2%瓊脂糖凝膠電泳觀察，于Kodak凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。接著對重組子進(jìn)行y^"7II、J力oI雙酶切，電泳切膠回收，利用5a/dlI、《WH和6^I、Z/wI兩對同尾酶特性，再與經(jīng)萬柳#1、5"WI雙酶切、純化后的PCR(反向〉目的片段進(jìn)行反向連接，然后轉(zhuǎn)化、篩選重組子[命名為RNAi+2F(fragment)]、酶切驗證，步驟同上。2.2PBI121+2F干涉表達(dá)載體的構(gòu)建pUCCRNAi+2F載體進(jìn)行J6aI、SacI雙酶切，回收2F片段，然后與經(jīng)過Z力aI、I雙酶切的pBI121載體進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化、篩選重組子(J力aI、SacI雙酶切驗證)，構(gòu)建成pBI121+2F干涉表達(dá)載體。ddH206.0uLpUCCR懇+2F(orpBI121)10.0nL質(zhì)粒10XbufferM2.0iiL5"acI1.0nL勘I1.0uL20.0本實施例利用載體構(gòu)建常用的基因工程方法，將(X/基因片段正反向連接于馬鈴薯GA20-氧化酶"^tw7片段兩側(cè)，構(gòu)建的PBI121(2CCRi)表達(dá)載體，該表達(dá)載體可利用基因工程方法降低楊樹木質(zhì)素含量。3.根癌農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因楊樹3.1表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404挑取農(nóng)桿菌LBA4404單菌落接種5ml含利福平100ug/ml的YEB液體培養(yǎng)基中，28°C、200r/min震蕩培養(yǎng)48小時左右。取2ml菌液轉(zhuǎn)入50mlYEB液體培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至0D600至1.0左右。轉(zhuǎn)入無菌離心管，冰浴30min。5000r/min離心5min，去上清。加入2ml新配制的20mmol/L預(yù)冷CaCL2重懸菌體。取滅菌后的離心管，每管在冰上分裝200ul。取2ug的pBI121+2F質(zhì)粒，加入到200ul的農(nóng)桿菌感受態(tài)中。)冰浴5min，轉(zhuǎn)入液氮中冷凍lmin，然后37'C水浴5min。加入800ul的YEB液體培養(yǎng)，28°C、200r/min震蕩培養(yǎng)5小時左右。吸取菌液300ul涂布在YEB固體培養(yǎng)基上(含100ug/ml的利福平和卡那霉素)。用無菌牙簽挑取單菌落，接種于適量的液體YEP培養(yǎng)基(含Kan100yg/mL、Rif100ug/mL)中，振蕩培養(yǎng)過夜。對LBA4404的質(zhì)粒進(jìn)行提取及PCR鑒定，擴增條件為94'C預(yù)變性5min;94。C變性30s、53。C退火30s、72。C延伸30s，共35個循環(huán)；最后72。C延伸10min。經(jīng)PCR驗證，表達(dá)載體已導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中，凍存于一70'C待用。3.2農(nóng)桿菌介導(dǎo)的楊樹遺傳轉(zhuǎn)化3.2.1工程菌制備從_70'C凍存的農(nóng)桿菌刮取少量菌體，接種于含50rag/L卡那霉素和50mg/L利福平的YEP平板上，于28'C遮光培養(yǎng)3d后，從活化平板上挑取單菌落接種于含抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，28°C，230rpm培養(yǎng)約16h，視菌液濃度用不含抗生素的YEP液體培養(yǎng)基按1:50或1:100的比例進(jìn)行稀釋，28°C230rpm振蕩培養(yǎng)46h，至相應(yīng)(XU值時，4°C,5000rpm離心5min收集菌體，用相同體積的MS液體培養(yǎng)基(含相應(yīng)乙酰丁香酮濃度)懸浮備用。3.2.2侵染與共培養(yǎng)于超凈工作臺上，將工程菌液倒入無菌培養(yǎng)皿中，將預(yù)培養(yǎng)過7d的葉片浸入工程菌液中，不時輕搖，侵染20min后，用無菌濾紙吸干后接種到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25t左右遮光進(jìn)行共培養(yǎng)。3.2.3菌的清洗待平皿中長出可見菌落即可進(jìn)行清洗，用無菌水洗葉片57次，水澄清即可。再用含400mg/L頭孢霉素水浸泡，放入恒溫?fù)u床中振蕩半個小時，用裝有濾紙的平皿吸干，接種到含頭孢霉素的恢復(fù)培養(yǎng)基上，25'C左右遮光進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)7d。3.2.4抗性愈傷組織的篩選與分化將恢復(fù)培養(yǎng)7d后的材料轉(zhuǎn)入篩選分化培養(yǎng)基中25'C左右遮光培養(yǎng)6d后，轉(zhuǎn)入光照時間為16h/d,光照強度為20003000Lux條件下培養(yǎng)，每20d轉(zhuǎn)入新配制的篩選分化培養(yǎng)基，進(jìn)行3輪篩選培養(yǎng)。4.轉(zhuǎn)基因楊樹的鑒定4.l轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測，檢測使用的引物為pBI121+2F表達(dá)載體中CaMV35S啟動子的一段核苷酸，其序列分別為35上游引物:5，-CCACAGATGGTTAGAGAGG-3，，35S下游引物:5，-GTCTTGCGAAGGATAGTGG-3，。擴增條件為94。C預(yù)變性5min;94'C變性30s、53。C退火30s、72。C延伸30s，共35個循環(huán)；最后72。C延伸IOmin。經(jīng)檢測篩選后，獲得了所需要的轉(zhuǎn)基因植株并將其進(jìn)行移栽管理。5.轉(zhuǎn)化植株木質(zhì)素含量的檢測5.1南林95楊Klason木質(zhì)素及綜纖維素含量的測定測定Klason木質(zhì)素及全纖維素含量時，取移栽后生長3個月、生長狀態(tài)一致的轉(zhuǎn)基因和對照植株。剝?nèi)淦?，取莖干。測定Klason木質(zhì)素與綜纖維素含量。每個株系各做一個平行樣。Klason木質(zhì)素的測定按照國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T2677.8-1994)，綜纖維素的測定按照國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T2677.10-1995)進(jìn)行。Klason木質(zhì)素的測定步驟為取烘干的樣品研磨成均勻粉末，過篩(4060um)，精確稱取lg(稱準(zhǔn)至0.0001g)試樣，用定性濾紙包好，并用線扎住，放入索氏抽提器中，加入苯醇混合液，置水浴中抽提6h。將試樣取出風(fēng)千，解開紙包，用潔凈的毛筆仔細(xì)將其刷入容量250mL具有磨口玻塞的錐形瓶中，加入預(yù)先冷至1215'C的72%的硫酸15mL，塞緊瓶塞，搖蕩1min,使試樣完全被酸所浸漬。然后將錐形瓶置于盂縣調(diào)節(jié)溫度為18~20。C的恒溫水浴槽中，并在此溫度下保溫2.5h，每隔10min搖蕩一次瓶內(nèi)含物，達(dá)到規(guī)定時間后，將錐形瓶內(nèi)容物全部移入容量為1000mL錐形瓶中，用蒸餾水漂洗錐形瓶，將所有殘渣和洗液全部傾入該錐形瓶中，然后加水稀釋至酸的濃度為3%，使總體積達(dá)到560mL。加熱煮沸4h，并加水保持一定的體積。用己經(jīng)在稱量瓶內(nèi)恒重的定量濾紙，過濾上述酸不溶木素，并用人蒸餾水洗滌至洗液加數(shù)滴10%的氯化鋇不再渾濁，用PH試紙檢査邊緣不再為酸性為止。然后，將濾紙移入原恒重的稱量瓶中，置于105士2'C烘箱至恒重。木質(zhì)素含量=，><100附o綜纖維素的測定步驟為取烘干的樣品研磨成均勻粉末，過篩(4060um)，精確稱取1g(稱準(zhǔn)至0.0001g)試樣，用定性濾紙包好，并用線扎住，放入索氏抽提器中，加入苯醇混合液，置水浴中抽提6h。將試樣取出風(fēng)干，解開紙包，用潔凈的毛筆仔細(xì)將其刷入容量250mL的錐形瓶中，加入65mL的蒸餾水，加入0.5mL的冰醋酸，0.75g的亞氯酸鈉(純度80%計)，在錐形瓶口倒扣一個容量為25mL的小錐形瓶，放在75'C水浴中加熱1h，在加熱過程中，經(jīng)常旋轉(zhuǎn)并搖動錐形瓶，一小時后在加0.5mL的冰醋酸和0.75g的亞氯酸鈉，搖勻，繼續(xù)在75t:水浴加熱lh，如此反復(fù)，直至試樣變白為止，最后將錐形瓶自水浴鍋取出，冷卻。用已經(jīng)恒重的&濾器過濾，再用蒸餾水洗滌至不呈酸性為止，最后用丙酮洗滌3次，抽干洗液，取出濾器，用蒸餾水洗漆濾器外部，移入烘箱，，置于105士2'C烘箱至恒重。綜纖維素含量=^><100圖1顯示了植株的Klason木質(zhì)素及綜纖維素的平均測定結(jié)果，對照植株的Klason木質(zhì)素含量為20.48%，轉(zhuǎn)基因株系中木質(zhì)素含量分別為19.52%，18.13%和17.73%,平均比對照降低了9.7%，對照植株的綜纖維素含量為74.18%，轉(zhuǎn)基因植株中的綜纖維素含量分別為75.03%，76.67%和77.89%，比對照增加了3.17%。5.2轉(zhuǎn)基因植株纖維長寬比及細(xì)胞壁厚度的測定用冰醋酸和30。/。的雙氧水以1:1的比例混合后對同時移栽的轉(zhuǎn)基因植株及對照植株分別進(jìn)行離析，沖洗千凈之后，再用解剖針挑少許置于載玻片上，然后放在100倍的纖維投影儀下測量長度。每一株系測定纖維為200根，精確到O.Olram。將植株橫截面切片在有目鏡測微尺的顯微鏡下測定纖維細(xì)胞寬度及雙細(xì)胞壁厚度，每一株系測定100個。'纖維長寬比是影響紙張質(zhì)量的一個重要的指標(biāo)，一般認(rèn)為纖維長寬比越大越有利于造紙，而纖維素含量與細(xì)胞壁厚度呈正相關(guān)，由下表可知，轉(zhuǎn)基因植株的纖維長寬比明顯高于非轉(zhuǎn)基因植株，這說明轉(zhuǎn)基因植株更適合于造紙，而轉(zhuǎn)基因植株細(xì)胞壁的增厚也側(cè)面的反映出纖維素含量的增加。植株的纖維形態(tài)平均纖維長度平均纖維寬度/長寬比平均細(xì)胞壁厚類型TypesAspectratio度/umTheaverageTheaverageTheaveragelengthofthewidthofthethicknessoffiberfiberthewall轉(zhuǎn)基因植株1734.1015.476347.43371.2974Transgenicplants1轉(zhuǎn)基因植株2742.2715.885546.72641.3273Transgenicplants2轉(zhuǎn)基因植株3745.0216.218145.93761.4944Transgenicplants3非轉(zhuǎn)基因植685.8315.397344.54211.1967株controlplant5.3轉(zhuǎn)基因植株組織化學(xué)染色對轉(zhuǎn)基因植株和對照植株進(jìn)行Wiesner反應(yīng)。具體步驟為將新鮮的木材橫截面切片先在2%的間苯三酚溶液中孵育2min。再用20°/。HC1封片，在顯微鏡下觀察，拍照。對轉(zhuǎn)基因植株以及對照進(jìn)行Wiesner染色反應(yīng)。Wiesner反應(yīng)主要是對醛類物質(zhì)特異性染色，反應(yīng)中染色的深淺一般粗略的反映了木質(zhì)化部位的木質(zhì)素總含量，對木質(zhì)素降低幅度大的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株著色區(qū)域明顯少于非轉(zhuǎn)基因植株，且區(qū)域變窄，表明轉(zhuǎn)基因植株的木質(zhì)素含量低于對照，與Klason木質(zhì)素測定結(jié)果相一致。轉(zhuǎn)基因植株的生長狀態(tài)表明雖然木質(zhì)素含量明顯降低，但植株生長狀態(tài)良好。圖1為本發(fā)明中綜纖維素和Klason木質(zhì)素含量。序列表<110〉安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)〈120〉用RNA干涉降低楊樹木質(zhì)素含量的方法〈130〉20090609〈160〉1<170〉Patentlnversion3.3<210>1<211>879〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉所克隆的CCR基因片段正向序列〈222〉(1)..(340)〈220〉〈221〉PUCRNAi載體中的GA20內(nèi)含子<222〉(341)..(539)〈220〉〈221〉所克隆的CCR基因片段反向序列〈222>(540)..(879)<400>1ggtattgctatggaaaggctgtggcagaacaagctgcatgggatatggctaaggagaaag60gggtggacctagtggtggttaacccagtgctggtgcttggaccattgttgcagcccactg120tcaatgctagcatcactcacatcctcaagtacctcaccggctcagccaagacata/tgcta180actctgttcaagcttatgtgcatgttagggatgtggcactagcccacattttagtctttg240agacgccttccgcctccggccgttacctttgctctgagagcgttctccaccgtggagagg300tggtggaaatccttgcaaagttcttccctgagtaccccatgtacggaccgtactactcta兆Ottcgtttcaatatatttatttgtttcagctgactgcaagattcaaaaatttctttattat420tttaaattttgtgtcactcaaaaccagataaacaatttgatatagaggcactatatatat480acatattctcgattatatatgtaaatgagttaacctttttttccacttaaattatatagt540accccatgagtcccttcttgaaacgttcctaaaggtggtggagaggtgccacctcttgcg600agagtctcgtttccattgccggcctccgccttccgcagagtttctgattttacacccgat660cacggtgtagggattgtacgtgtattcgaacttgtctcaatcgtatacagaaccgactcg720gccactccatgaactcctacactcactacgatcgtaactgtcacccgacgttgttaccag780gttcgtggtcgtgetcccaattggtggtgatcc鄉(xiāng)tggggaa卿gg城cggtataggg,tacgtcgaacaagacggtgtcggaaaggtatcgttatgg879權(quán)利要求1、一種用RNA干涉降低楊樹木質(zhì)素含量的方法，其特征在于從楊樹中克隆CCR基因片段作為RNA干擾片段，以組成型啟動子CaMV35S啟動表達(dá)，構(gòu)建含CCR基因正反片段的表達(dá)載體，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將CCR基因的正反結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)入楊樹中，通過抗性植株P(guān)CR檢測和對轉(zhuǎn)基因楊樹進(jìn)行Klason木質(zhì)素和綜纖維素含量檢測，植株纖維長寬比及細(xì)胞壁厚度和組織化學(xué)染色測定，檢驗?zāi)康幕虻恼锨闆r和表達(dá)情況，獲得了Klason木質(zhì)素含量降低和綜纖維素含量提高的轉(zhuǎn)基因楊樹植株。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用RNA干涉降低楊樹木質(zhì)素含量的方法，其特征在于主要包括以下步驟(1)根據(jù)楊樹木質(zhì)素合成途徑中關(guān)鍵酶CCR基因的序列，通過序列比對，確定楊樹木質(zhì)素合成酶基因的特異性RNA干擾序列，根據(jù)干涉序列設(shè)計引物，進(jìn)行楊樹木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶CCR基因的干涉片段的特異性擴增；(2)以組成型啟動子CaMV35S啟動表達(dá)，構(gòu)建含CCR基因正反片段的植物表達(dá)載體；(3)轉(zhuǎn)化含有目的干涉片段的載體，并將目的干涉片段整合到楊樹基因組中；(4)對抗性植株P(guān)CR檢測和對轉(zhuǎn)基因楊樹進(jìn)行Klason木質(zhì)素含量和綜纖維素測定以及植株纖維長寬比及細(xì)胞壁厚度和組織化學(xué)染色測定。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的用RNA干涉降低楊樹木質(zhì)素含量的方法，其特征在于在所述步驟(l)中，通過同源性搜索和序列比對，確定目的基因片段序列為楊樹CCR基因的第4個外顯子部分序列，即全長CCR基因(GenebankAccessionNumber:AJ295838)的第2066~2405片段，共340bp。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的用RNA干涉降低楊樹木質(zhì)素含量的方法，其特征在于在所述步驟(2)中，以組成型啟動子CaMV35S啟動表達(dá)，把CCR基因正反片段置于啟動子之后，抑制楊樹CCR基因的表達(dá)。5、根據(jù)權(quán)利要求2所述的用RNA干涉降低楊樹木質(zhì)素含量的方法，其特征在于在所述步驟(4)中，所述的抗性植株P(guān)CR檢測是通過設(shè)計的CaMV35S特異性引物，進(jìn)行PCR擴增驗證。全文摘要本發(fā)明公開了一種生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的利用RNA干涉降低楊樹中木質(zhì)素的含量的方法。本發(fā)明從楊樹中克隆CCR基因片段作為RNA干擾片段，以組成型啟動子CaMV35S啟動表達(dá)，構(gòu)建含CCR基因正反片段的表達(dá)載體，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將CCR基因的正反結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)入楊樹中，通過抗性植株P(guān)CR檢測和對轉(zhuǎn)基因楊樹進(jìn)行木質(zhì)素和綜纖維素含量檢測，轉(zhuǎn)基因植株木質(zhì)素含量較非轉(zhuǎn)基因株木質(zhì)素含量平均降低為9.7％，轉(zhuǎn)基因植株中的綜纖維素含量較非轉(zhuǎn)基因株綜纖維素含量平均提高3.17％，從而提供了一種降低楊樹中木質(zhì)素的含量的方法，為利用轉(zhuǎn)基因楊樹大規(guī)模提供造紙原料奠定了基礎(chǔ)。文檔編號C12N15/84GK101603052SQ20091003294公開日2009年12月16日申請日期2009年6月9日優(yōu)先權(quán)日2009年6月9日發(fā)明者宋恩慧,沈周高,誠蔡,艷項,國魏申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)