專利名稱：高效轉(zhuǎn)化谷氨酰胺合成l-茶氨酸的大腸桿菌菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高效生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)茶氨酸的大腸桿菌菌株以及在工業(yè)化制備茶 氨酸中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
L-茶氨酸是綠茶中特有的一種氨基酸，50年代日本學(xué)者首次從茶葉中提 取、精制出茶氨酸，并確定了它的化學(xué)結(jié)構(gòu)，此后許多學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了大量的 研究工作一般說來，茶氨酸的制備方法主要有植物細(xì)胞組培、化學(xué)合成、微生
物發(fā)酵和離子交換樹脂分離等四種。大量的研究表明茶氨酸具有多種營養(yǎng)保
健功能，安神放松、促進(jìn)大腦功能、降血壓、抗腫瘤和抗疲勞作用。茶氨酸作 用一種新興的食品添加劑，具有安全無毒的特性，已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于醫(yī)藥保健 和食品工業(yè)中。
L-茶氨酸(L-theanine)是茶葉游離氨基酸的主體，是構(gòu)成茶葉自然品質(zhì) 的主要成分之一，約占整個(gè)游離氨基酸的50%以上，春茶中含量可達(dá)1.5%—2 %，嫩莖中可高達(dá)3%。 L-茶氨酸作為茶葉中的一種特有氨基酸，是構(gòu)成綠茶風(fēng) 味的物質(zhì)。L-茶氨酸在茶樹根部合成，通過枝干轉(zhuǎn)移到葉并在葉中蓄積，但一 遇陽光照射就會(huì)轉(zhuǎn)化為兒茶酸。因此，L-茶氨酸在覆蓋栽培的高級(jí)綠茶葉中含 量多，在粗茶葉中含量較少。1950年酒戶彌二郎博士在研究玉露茶鮮爽滋味成 分時(shí)，從新梢中分離鑒定出L-茶氨酸，1964年日本將L-茶氨酸定為食品添加劑 使用，其用途是作為綠茶風(fēng)味增強(qiáng)劑，但由于當(dāng)時(shí)提取的L-茶氨酸價(jià)格非常昂 貴，在食品中幾乎無法使用推廣。1992年日本太陽化學(xué)公司研制成功的L-茶氨
3酸，價(jià)格低廉、純度高且能大規(guī)模工廠化生產(chǎn)，使之作為商品可以在食品中添 加應(yīng)用。
由于L-茶氨酸(L-theanine)通過化學(xué)合成存在手性分離的難點(diǎn)，制約了 該方法在大規(guī)模工廠化生產(chǎn)中的應(yīng)用，因此，利用微生物生物發(fā)酵成為大規(guī)模 工廠化生產(chǎn)的必然方向，但篩選高效轉(zhuǎn)化茶氨酸大腸桿菌菌株十分困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一株高效轉(zhuǎn)化谷氨酰胺和乙胺的大腸桿菌，以及 該菌株在制備L-茶氨酸中的應(yīng)用。
本發(fā)明所說的菌株，是大腸桿菌(fsc力e^'c力iaco7j')南師一號(hào)CCTCC No. M 209166。
本發(fā)明還公開了上述菌株在制備L-茶氨酸中的應(yīng)用。具體是(1)培養(yǎng)南 師一號(hào)至OD600大于2.0，收集菌體，高壓破碎菌體，得酶液；
(2)將酶液加入到谷氨酰胺和乙胺溶液中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后， 得富含L-茶氨酸的發(fā)酵液。
上述步驟(1)中培養(yǎng)得到酶活單位在12000-23000/升的菌體。
上述步驟(2)中，谷氨酰胺優(yōu)選為0.2-0.8M，在每升反應(yīng)液中乙胺溶液 40-100ml，加入酶活單位為4000-8000/升，轉(zhuǎn)化溫度控制在20-37°C。
南師一號(hào)的培養(yǎng)條件:將篩選到的大腸桿菌南師一號(hào)接種于LB固體培養(yǎng)基， 每升培養(yǎng)基含蛋白胨10g，酵母提取物5g， NaCl 10g，瓊脂15g， 37'C培養(yǎng)12h， 挑單菌落接種于10mL LB液體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含蛋白胨10g，酵母提取物5g， NaCl 10g，用去離子水定容至l升
采用該大腸桿菌菌株在搖床-50升發(fā)酵罐-500升發(fā)酵罐-10噸發(fā)酵罐培養(yǎng)后 獲得大量酶活單位在23000/升的菌體，在5噸反應(yīng)釜中對(duì)0. 6M/L谷氨酰胺進(jìn)行 生物轉(zhuǎn)化，經(jīng)40 48h的25'C酶反應(yīng)后得到0.49M/L的L-茶氨酸，對(duì)谷氨酰胺 的轉(zhuǎn)化率超過80%，該菌株成功地在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中獲得應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在通過高濃度的乙胺(0.45M)進(jìn)行培育篩選，獲 得的一株高效生物轉(zhuǎn)化谷氨酰胺為茶氨酸的大腸桿菌菌株，該菌株不僅能有效 通過利用谷氨酰胺和乙胺合成L-茶氨酸，而且該菌株能高效對(duì)谷氨酰胺和乙胺 轉(zhuǎn)化為L-茶氨酸，其對(duì)谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化率超過了 80%;且其特性經(jīng)數(shù)代的培養(yǎng) 后保持不變，合成茶氨酸的能力與開始的親代相同，是今后工業(yè)化生產(chǎn)茶氨酸 的有效的生產(chǎn)菌株。


圖1是實(shí)施例二菌生長曲線附圖
圖2是實(shí)施例二酶活單位曲線附圖
圖3是實(shí)施例三菌生長曲線附圖
圖4實(shí)施例三菌生長曲線附圖 圖5實(shí)施例四菌生長曲線附圖 圖6是實(shí)施例四酶活單位曲線附圖
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一 菌株篩選
將茶葉樹土壤中分離出23株大腸桿菌菌株分別接種到含乙胺(0.45M)的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行過夜培養(yǎng)。
培養(yǎng)24小時(shí)后用顯微鏡對(duì)培養(yǎng)的大腸桿菌菌株進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)其中3株大 腸桿菌菌株的細(xì)胞形態(tài)正常且有較多的細(xì)胞數(shù)，而其它20株的細(xì)胞形態(tài)為不規(guī) 則形，且細(xì)胞數(shù)非常少。
將對(duì)數(shù)生長期的大腸桿菌細(xì)胞中加入400rnM的谷氨酰胺和1M乙氨進(jìn)行生物 轉(zhuǎn)化，經(jīng)12小時(shí)的進(jìn)一步發(fā)酵，大部分谷氨酰胺將被大腸桿菌菌株中的L-茶氨
酸合成酶轉(zhuǎn)化為茶氨酸。
對(duì)以上3株大腸桿菌的發(fā)酵轉(zhuǎn)化茶氨酸結(jié)果經(jīng)HPLC分析發(fā)現(xiàn)，其中有一株 大腸桿菌能對(duì)谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化率超過了 80%，我們將其命名為大腸桿菌南師一 號(hào)，進(jìn)一步在1升反應(yīng)體系中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌株合成茶氨酸的濃 度高達(dá)51.2克，經(jīng)過數(shù)代的培養(yǎng)，該菌株的合成茶氨酸的能力保持不變。
于2009年7月28日將南師一號(hào)送交中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏 單位地址武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；保藏菌株分類命名為大腸桿菌 (^sc力en'c/ j'a 南師一號(hào)，保藏編號(hào)CCTCC No. M 209166 。
實(shí)施例二
(1)將篩選到的大腸桿菌南師一號(hào)接種于LB固體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含蛋 白胨10g，酵母提取物5g， NaCl 10g，瓊脂15g， 37*€培養(yǎng)12h，挑單菌落接 種于10mL LB液體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含蛋白胨10g，酵母提取物5g， NaCl 10g， 用去離子水定容至1升，37"C震蕩培養(yǎng)12h，然后取lmL接種到100mL LB液體 培養(yǎng)基，37。C震蕩培養(yǎng)6 8h, 0D,達(dá)到2.0 2.2 (圖1)，酶活單位(南京建 成生物試劑盒檢測(cè))0D53。達(dá)到12000 14000 (圖2)，離心15min收集菌體，經(jīng) 高壓破碎，獲得茶氨酸合成酶。(2)按每0. 6M/L谷氨酰胺和70% (質(zhì)量)乙胺水溶液加4000單位的茶氨 酸合成酶，經(jīng)40 48h的25'C酶反應(yīng)后，經(jīng)HPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其對(duì)谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化 率高達(dá)70%。
用0.2、 0. 8M/L谷氨酰胺重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，結(jié)果基本相同。 實(shí)施例三
(1)將篩選到的大腸桿菌南師一號(hào)接種于LB固體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含蛋 白胨10g，酵母提取物5g， NaCl 10g，瓊脂15g， 37'C培養(yǎng)12h，挑單菌落接 種于10mL自主MB培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含Na2HPCU5g， KH2P04 5g， NaCl lg， NH4C1 2g，甘油3ral，蛋白胨10g; 37。C震蕩培養(yǎng)12h，然后取lmL接種到100mL自主 MB液體培養(yǎng)基，37。C震蕩培養(yǎng)6 8h， 0D,達(dá)到2. 1 2.3(圖3)，酶活單位(南 京建成生物試劑盒檢測(cè))OD咖達(dá)到15000 16000 (圖4)，離心15min收集菌體， 經(jīng)高壓破碎，獲得茶氨酸合成的gamma-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶
(2)按每0.6M/L谷氨酰胺和乙胺水溶液加5000單位的茶氨酸合成酶，經(jīng) 40 48h的25"C酶反應(yīng)后，經(jīng)HPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其對(duì)谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化率達(dá)到80%。
實(shí)施例四
(1)將篩選到的大腸桿菌南師一號(hào)接種于LB固體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含蛋 白胨10g，酵母提取物5g， NaCl 10g，瓊脂15g， 37'C培養(yǎng)12h，挑單菌落接 種于lOmLLB液體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含蛋白胨10g，酵母提取物5g， NaCl 10g, 用去離子水定容至1升，37'C震蕩培養(yǎng)12h，然后取lmL接種到100mL LB液體 培養(yǎng)基，37'C震蕩培養(yǎng)4h后，補(bǔ)加60mLLB液體培養(yǎng)基，37"C震蕩培養(yǎng)6 8h， ODe。。達(dá)到2.8 3.0 (圖5)，酶活單位(南京建成生物試劑盒檢測(cè))0053。達(dá)到18000 22000 (圖6)，離心15min收集菌體，經(jīng)高壓破碎，獲得茶氨酸合成酶。 (2)按每0.6M/L谷氨酰胺和乙胺水溶液加6000單位的茶氨酸合成酶，經(jīng) 40 48h的20-37。C酶反應(yīng)后，經(jīng)HPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其對(duì)谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化率超過800/。。
實(shí)施例五
將在10噸發(fā)酵罐培養(yǎng)后獲得大量酶活單位在23000/升的菌體經(jīng)高壓破碎后 取100升酶液，加入到含4噸底物(0. 6M/L L-谷氨酰胺以及2M乙胺的溶液中， 經(jīng)48 h的25。C酶反應(yīng)后得到0. 49M/L的L-茶氨酸，對(duì)谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化率超過 80%。
實(shí)驗(yàn)儀器與材料
搖床；三角燒瓶；微生物超凈工作臺(tái)；LB培養(yǎng)基；HPLC;高壓破碎儀；發(fā)酵 罐，反應(yīng)釜。
權(quán)利要求
1、一種高效轉(zhuǎn)化L-谷氨酰胺和乙胺產(chǎn)生L-茶氨酸大腸桿菌的菌株，是大腸桿菌(Escherichia coli)南師一號(hào)CCTCC No.M 209166。
2、 權(quán)利要求1所說的高效轉(zhuǎn)化合成L-茶氨酸大腸桿菌的菌株在制備L-茶氨酸中的應(yīng)用。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所說的應(yīng)用，其特征在于，具體是(1) 培養(yǎng)菌株至0D600在2.0以上，收集菌體，高壓破碎菌體，得酶液；(2) 將酶液加入到谷氨酰胺和乙胺溶液中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，得富含L-茶氨酸的發(fā)酵液。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所說的應(yīng)用，其特征在于，步驟(1)中培養(yǎng)得到酶活單位在12000-23000/升的菌體。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所說的應(yīng)用，其特征在于，步驟(2)其中所加入的谷氨酰胺為0. 2-0. 8M,乙胺溶液為40-100ml/升，加入酶活單位在4000_8000/升，轉(zhuǎn)化溫度控制在20-37°C。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種生物轉(zhuǎn)化合成茶氨酸的大腸桿菌菌株及其應(yīng)用。所說的高效轉(zhuǎn)化L-谷氨酰胺和乙胺的大腸桿菌，是大腸桿菌(Escherichia coli)南師一號(hào)CCTCC No.M 209166。該菌株高產(chǎn)茶氨酸合成酶，高效轉(zhuǎn)化谷氨酰胺和乙胺為L-茶氨酸并在工業(yè)化生產(chǎn)過程中獲得成功；對(duì)谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化超過80％。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101643712SQ20091003509
公開日2010年2月10日 申請(qǐng)日期2009年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月15日
發(fā)明者珒 傅, 呂志祥, 張正平, 殷志敏, 沈青紅, 王正才 申請(qǐng)人:南京師范大學(xué);常州阿格羅生物科技有限公司