專利名稱：用于制備抗癌藥物靛玉紅的2-萘酸單加氧酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種2-萘酸單加氧酶在生物催化制備抗癌藥物靛玉 紅中的應(yīng)用，及其經(jīng)過分子改良的2-萘酸單加氧酶突變體在生物催化制備靛玉紅中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
最近研究證實很多疾病，包括癌癥、糖尿病、炎癥是由于細(xì)胞信號傳導(dǎo)中蛋白激酶紊 亂引起的，臨床藥物治療中，藥物作用定位于信號傳導(dǎo)的各個靶位點癌癥抑制蛋白pRb的C
DK介導(dǎo)的磷酸化是有絲分裂周期G1期中必須的，很多人類癌癥就是因為癌癥抑制蛋白pRb及 其調(diào)節(jié)出現(xiàn)了紊亂。因此，環(huán)化激酶CDK促進因子成為癌癥治療的有效藥物。靛玉紅是傳統(tǒng) 中藥中治療白血病"龍回丸"中藥配方中當(dāng)歸所含的小分子成分，體外實驗中對CDK有很明 顯的促進作用，在中醫(yī)中用于治療急性白血病，對核質(zhì)變化紊亂引起疾病治療效果很好，近 年來在美國和日本的臨床治療中發(fā)現(xiàn)靛玉紅對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療和幾種人類腫瘤細(xì)胞的 生長抑制有明顯的作用。
美國食品與藥品監(jiān)督局要求制藥公司在新藥的兩種異構(gòu)體有明顯的藥效和毒理作用差異 時，必須以光學(xué)純的藥品形式上市。目前，靛玉紅主要從板藍(lán)根，大青葉等一些植物中藥中 提取獲得的，但是中藥中靛玉紅的含量為《mg/g，制品含量低于90%，并且化學(xué)提取的步驟 繁瑣，成本比較高，藥品純度難以滿足市場需求。
近年來，有機化學(xué)品的生物催化方法因其對環(huán)境友好，在制藥和化學(xué)工業(yè)中需求越來越 大。生物催化化學(xué)物質(zhì)轉(zhuǎn)換已經(jīng)受到廣泛重視，它是替代傳統(tǒng)的化學(xué)合成有效方法，同時有 利于解決合成過程中出現(xiàn)的難題。有機合成中，生物催化專一性強，反應(yīng)條件溫和。酶的手 性催化有立體和結(jié)構(gòu)域的特異性，其反應(yīng)速度快、酶的底物范圍廣；同時，通過酶基因工程，
可以進一步改善酶的穩(wěn)定性、提高反應(yīng)底物特異性、甚至改變其映像專一性。采用生物技術(shù) 手段，改變酶分子結(jié)構(gòu)，給傳統(tǒng)生物催化帶來了機遇和挑戰(zhàn)。采用生物催化，可以合成復(fù)雜
的大分子，同時生產(chǎn)過程對環(huán)境友好，天然的酶和改造的酶都可以通過DNA重組技術(shù)在適當(dāng) 的宿主內(nèi)大量生產(chǎn)，因此，化學(xué)合成中酶的應(yīng)用給化學(xué)和制藥工業(yè)的進步帶來了巨大的機會。 本發(fā)明申請人在生物基因工程研究中，提出一種制備降解2-萘酸活性的DNA片段的方法 從2-萘酸降解菌伯克霍爾德氏菌(5w狄oWen'a sp. JT1500)菌株中提取總DNA，經(jīng)限制性內(nèi) 切酶部分水解，得到DNA片段，將其連接到pUC18載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101獲得含有一段8 050bp長度的，上有2-萘酸單加氧酶基因簇和輔酶A連接酶基因的DNA片段，上述序列已經(jīng)在CN1618971A公開，并且該專利文件的序列表中的序列l(wèi)中的第2793-3951位的1158bp的核苷酸 序列為2-萘酸單加氧酶基因，編碼的2-萘酸單加氧酶如該份專利文件的序列表的序列2所示。 本發(fā)明申請人(2-萘酸單加氧酶基因(nmo)的克隆及表達，方向平，丘曉穎，岑英華， 孫國萍，微生物學(xué)報，第43巻第5期，第599 605頁，2003年10月)通過酶切連接將Sw/^2o/A rz'。 sp. JT1500的一段DNA片段(4802bp)亞克隆到載體pUC18上，得到了重組子pEK123， 測序后的pEK123重組子4802bp插入片段的序列已經(jīng)登陸公開于歐洲EMBL基因庫，序列號 為AJ566333，該片段是上述專利文件公開的8050bp中的最前面的4802序列，該序列含有編碼 黃素還原酶NmoB和2-萘酸單加氧酶NmoA的堿基序列，其中從重組子pEK123中PCR擴增出的 上述專利公開的I158bp的2-萘酸單加氧酶基因(在EMBL基因庫接受號為AJ566333的序列的2 793-3951位)編碼的酶是含黃素還原酶的單加氧酶家族(FMO)中的一個新成員，與其他已 登錄的單加氧酶基因序列同源性較低，是一個新的單加氧酶，該基因編碼的酶能對2-萘酸發(fā) 生加氧轉(zhuǎn)化。李小波和岑英華(2 —萘酸單加氧酶基因及NADH:黃素還原酶基因的克隆分析， 李小波，岑英華，孫國萍，微生物學(xué)報，第45巻第4期，第557 560頁，2005年8月)研究發(fā)現(xiàn) 該2-萘酸單加氧酶能夠催化吲哚產(chǎn)生靛藍(lán)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人通過對重組子pEK123的DNA片段進一步的研究，發(fā)現(xiàn)了另外一個開放閱讀框， 該開放閱讀框位于pEK123的重組DNA片段上，EMBL基因庫中AJ566333序列的2579-3892 位，共1314bp，編碼437個氨基酸，并且發(fā)現(xiàn)該開放閱讀框編碼的酶能夠催化吲哚產(chǎn)生靛玉 紅，證明其是一個具有功能的基因，該開放閱讀框與本發(fā)明人團隊以前發(fā)現(xiàn)2-萘酸單加氧酶 基因具有部分重疊序列。
因此本發(fā)明的目的是提供了一種能夠催化噴哚產(chǎn)生靛玉紅的2-萘酸單加氧酶及其編碼基 因，還提供了以該2-萘酸單加氧酶為基礎(chǔ)衍生的，經(jīng)過分子改良的、氨基酸序列發(fā)生功能性 突變的2—萘酸單加氧酶突變體及其在生物催化制備抗癌藥物靛玉紅中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的能夠催化吲哚產(chǎn)生靛玉紅的2-萘酸單加氧酶的基因序列如SEQ1所示，其 氨基酸如SEQ2所示。
本發(fā)明通過以下方案證明2-萘酸單加氧酶能夠生物催化吲哚制備抗癌藥物靛玉紅
(a) 從來自5wr狄oWeha sp.JT1500的2—萘酸單加氧酶基因簇(長度為4802bp序列號 為AJ566333)的pUC18克隆重組子pEK123上克隆出2—萘酸單加氧酶基因片段。
(b) 將2—萘酸單加氧酶基因片段與表達載體pET22b(+)連接。
(c) 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)， IPTG誘導(dǎo)表達。
(d) 細(xì)菌超聲波破碎后，提取2—萘酸單加氧酶，純化目標(biāo)蛋白，純化后的酶經(jīng)過驗證具有催化B引哚生成抗癌藥物靛玉紅的能力。
本發(fā)明還證明含有2 —萘酸單加氧酶的編碼基因，能表達該酶的全細(xì)胞具有催化吲哚產(chǎn) 生抗癌藥物靛玉紅的能力。
本發(fā)明以2 —萘酸單加氧酶為基礎(chǔ)衍生的，經(jīng)過分子修飾的，引起氨基酸序列發(fā)生功能 性突變的2 —萘酸單加氧酶突變體具有生物催化制備抗癌藥物靛玉紅的能力。
其修飾步驟如下
(a) 從來自Bw狄oWm'flsp.JT1500的2—萘酸單加氧酶基因簇(長度為4802bp序列號 為AJ566333)的pUC18克隆重組子pEK123上克隆出2—萘酸單加氧酶基因片段。
(b) 通過易錯PCR(error-prone PCR)介導(dǎo)的隨機突變和DNA重組技術(shù)(DNA shuffling) 等分子改良、篩選獲得突變體基因。
(c) 表達2-萘酸單加氧酶突變體基因，該基因編碼的2-萘酸單加氧酶突變體能夠催化吲 哚產(chǎn)生抗癌藥物靛玉紅。
所述的修飾的2—萘酸單加氧酶突變體是在第118， 201， 245三個位點中任意和組合位 點的氨基酸序列有功能性突變。
本發(fā)明證實以2—萘酸單加氧酶為基礎(chǔ)，在201位由Phe突變?yōu)镮le，而衍生的經(jīng)過修 飾的2—萘酸單加氧酶突變體具有生物催化制備抗癌藥物靛玉紅中的能力，命名為2—萘酸 單加氧酶突變體-Phe201Ile，其序列如SEQ3所示。
本發(fā)明還證實以2—萘酸單加氧酶為基礎(chǔ)，在201位由Phe突變?yōu)閘ie, 245位由Trp 突變?yōu)镾er，而衍生的經(jīng)過修飾的2—萘酸單加氧酶突變體具有生物催化制備抗癌藥物靛玉 紅中的能力，命名為2—萘酸單加氧酶突變體-Phe201Ile/Trp245Ser，其序列如SEQ4所示。
本發(fā)明還證實以2—萘酸單加氧酶為基礎(chǔ)，在201位由Phe突變?yōu)镮le， 245位由Trp 突變?yōu)镾en 118位由Leu突變?yōu)锳la，而衍生的經(jīng)過修飾的2—萘酸單加氧酶突變體具有 生物催化制備抗癌藥物靛玉紅中的能力，命名為2 —萘酸單加氧酶突變體-Phe201Ile/Trp245Ser/Leull8Ala，其序列如SEQ5所示。
本發(fā)明還證實含有上述含有酶突變體的編碼基因，表達酶突變體的全細(xì)胞也能生物催 化制備抗癌藥物靛玉紅。
本發(fā)明是通過反相高效液相色譜和光譜掃描測定驗證靛玉紅的產(chǎn)生。
本發(fā)明的2—萘酸單加氧酶能夠催化吲哚產(chǎn)生靛玉紅，從而為利用2-萘酸單加氧酶進
行靛玉紅生物轉(zhuǎn)化，通過2萘酸單加氧酶基因重組大腸桿菌生物催化抗癌藥物靛玉紅的手
性合成，實現(xiàn)酶法全細(xì)胞轉(zhuǎn)化，生產(chǎn)品質(zhì)優(yōu)良，純度高，手性合成效率高抗癌藥物靛玉紅
提供了途徑，生物催化制備具有反應(yīng)條件溫和，轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點，大大降低了靛玉紅的生產(chǎn)成本。該2 —萘酸單加氧酶催化效率(Kcat/Km值)為238M"S—1，本發(fā)明還通過易錯PCR 和DNAshuffling技術(shù)制備了 2-萘酸單加氧酶突變體基因，該突變體基閔編碼的2-萘酸單加 氧酶突變體能夠催化噴哚產(chǎn)生靛玉紅所述的2 —萘酸單加氧酶突變體-Phe201Ile，酶催化 效率(Kcat/Km值)為777M"S";所述的2 —萘酸單加氧酶突變體-Phe201Ile/Trp245Ser， 酶催化效率(Kcat/Km值)為819 (M"S—";所述的2 —萘酸單加氧酶突變體-Phe201Ile/Trp245Ser /Leull8Ala，酶催化效率(Kcat/Km值)為909M"S"，由此可見本發(fā) 明構(gòu)建的2—萘酸單加氧酶突變體不但具有催化吲哚產(chǎn)生靛玉紅的能力，而且其產(chǎn)率也比野 生型的提高了2-4倍。
表12 —萘酸單加氧酶催化(1引哚產(chǎn)生靛玉紅反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)
蛋白酶《cat/《m(M-'S-1)
2-萘酸單加氧酶238
2—萘酸單加氧酶突變體-Phe201 lie777
2—萘酸單加氧酶突變體-Phe201Ile/Trp245Ser819
2—萘酸單加氧酶突變體-Phe201Ile/Trp245Ser/Leull8Ala909


圖1是蛋白的SDS-PAGE圖譜，其中CK:轉(zhuǎn)入空載體p ET22b(+)的大腸桿菌￡ BL21 (DE3)， T:重組pET22b(+)-nmoA大腸桿菌五co/!'TOP10， B:重組p ET22b(+)-nmoA大腸 桿菌五co/ZBL21(DE3)，其中1 ， 2， 3代表不同的克隆子，M: Marker蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)KDa， Nmo:純化的2-萘酸單加氧酶；
圖2是靛玉紅標(biāo)樣的反相高效液相色譜RP-HPLC圖譜；
圖3是靛玉紅標(biāo)樣的光譜掃描圖4是靛藍(lán)標(biāo)樣的反相高效液相色譜RP-HPLC圖譜；
圖5是靛藍(lán)標(biāo)樣的光譜掃描圖6是提純的2-萘酸單加氧酶催化吲哚后的氯仿提取物的反相高效液相色譜RP-HPLC圖譜； 圖7是提純的2-萘酸單加氧酶催化B引哚后的氯仿提取物的光譜掃描圖8是2-萘酸單加氧酶重組大腸桿菌克隆催化吲哚后的氯仿提取物的反相高效液相色譜 RP-HPLC圖譜；
圖9是2-萘酸單加氧酶重組大腸桿菌克隆催化吲哚后的氯仿提取物的光譜掃描圖； 圖10是PCR產(chǎn)物的電泳圖，其中1, 2: 2-萘酸單加氧酶基因簇重組子pEK123; 3， 4: PCR1 (error-prone PCR)的產(chǎn)物；5， 6， 7， 8: PCR1 (error-prone PCR)產(chǎn)物經(jīng)DNAaseI酶切后 的產(chǎn)物；9-14: PCR2 (自身引物PCR)的產(chǎn)物；M: DNAMarker (DL3000);
6圖11是PCR產(chǎn)物的電泳圖，其中1-3: p ET22b(+)-nmoA*， 4-9: PCR3產(chǎn)物nmoA、 M: DNA Marker (DL3000);
圖12是野生型pET22b(+)-nmoA重組大腸桿菌的2-萘酸單加氧酶催化吲哚的上清液提取物光 譜掃描圖13是突變型pET22b(+)-nmoA-重組大腸桿菌的2-萘酸單加氧酶突變體催化吲哚的上清液提 取物光譜掃描圖14是可見光分光光度光譜分析圖，其中1:色氨酸(底物)，2:吲哚(底物)，3:吲哚
滿二酮(中間體)；4:野生型pET22b(+)-nmoA重組的大腸桿菌催化吲哚后的發(fā)酵液萃取產(chǎn) 物；5:靛玉紅標(biāo)樣(2， 3'-羥基吲哚)；6:突變型pET22b(+)-nmoA+重組的大腸桿菌催化吲 哚后的發(fā)酵液萃取產(chǎn)物；7:靛藍(lán)標(biāo)樣(2， 2'-羥基吲哚)；
圖15是蛋白SDS-PAGE電泳圖，其中B是沒有轉(zhuǎn)入載體的大腸桿菌BL21 (DE3)， B-22是 帶有空載體pET (22b+)的大腸桿菌BL21 (DE3)， Bm是轉(zhuǎn)入載體pET22b(+)-nmoA* (突變 體)的大腸桿菌BL21 (DE3), Bw是轉(zhuǎn)入載體pET22b(+)-nmoA (野生型)的大腸桿菌BL21 (DE3); M:蛋白Marker;
具體實施例方式
實施例l
(1)克隆2—萘酸單加氧酶基因。
以從來自Sw狄oWen'a sp.JT1500的2—萘酸單加氧酶基因簇(長度為4802bp序列號為 AJ566333)的pUC18克隆重組子pEK123為模板，PCR擴增2—萘酸單加氧酶基因簇中2— 萘酸單加氧酶nmoA片段。
根據(jù)EMBL基因庫中接受號為AJ566333的序列，設(shè)計引物擴增該序列的2579-3892位 的堿基，共1314bp，由于本發(fā)明需要利用His-tag標(biāo)記的表達載體pET22b(+)，融合表達目的 蛋白，因此去掉了該基因的TAA終止子，即擴增了該序列的2579-3889位的堿基，共1311bp。
其引物序列為
引物上游引物AF5>TTATCATATGATGCGGCGGCATTCG<3引入酶切位點NdeI
下游引物AR5>CTCTGAAG CTTCTGCGGCTTGTG〈3弓|入酶切位點HindIII 反應(yīng)體系
10xbuffer 10^1;
10nMdNTP 2^1;
PfUTaq 2^1;
10nMAF 2^1;10nMAR 2^1; 模板DNA 2^1;
超純水 80pl;
反應(yīng)的酶為上海生工Pfu DNA Polymerase ( B0093) PCR擴增條件95。C變性5分鐘(min)后；在95。Clmin， 57。Clmin， 72。C2min;經(jīng)過 30個循環(huán)，然后72。C延伸10min， 12。C終止反應(yīng)。
(2) 2—萘酸單加氧酶基因nmoA與pET22b(+)連接 擴增的PCR產(chǎn)物2—萘酸單加氧酶基因nmoA，用上海生工UN1Q-10柱式DNA膠回收
試劑盒(SK1131)回收1311bp大小片段(經(jīng)克隆、測序分析，其序列位于AJ566333序列的 2579-3889位即SEQ1中的1-1311位，由于需要利用His-tag標(biāo)記的表達載體pET22b(+)，融 合表達目的蛋白，因此去掉了該基因的TAA終止子)，然后采用NdeI和HindIII雙酶切后， 與經(jīng)過同樣酶切后的線性質(zhì)粒p ET22b(+)連接酶切體系5(^1:載體pET22b(+)或目標(biāo)基因 證oA各10n1(0.1——l嗎)，分別加NdeI和Hindin(10U4il)lp1,， 10xbuffer 5^1,超純水補足 至50^1, 37°C 2—8小時雙酶切。連接體系20^1:酶切產(chǎn)物pET22b(+)/Ndel+Hind111, nmoA/Ndel+HindlII各5nl等摩爾混合，T4DNA連接酶(lswiss/pl) l-2pl， 10x連接buffer2^1， 超純水補充至20pl。 16°C，連接1…12小時。
(3) 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌￡ >//81^1 (DE3) 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌￡ //8!^1 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞(如果效率低可以采用大腸桿菌
TOP10預(yù)先轉(zhuǎn)化，陽性克隆連接載體再轉(zhuǎn)化E co/z' BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞)，涂布到涂有 IPTG與X-gal的的氨芐(lOOpgAml) LB瓊脂平板上，37。C過夜培養(yǎng)。
(4) 陽性克隆篩選
從上述過夜培養(yǎng)的平板上挑取白色的克隆，并轉(zhuǎn)接到lml含100pg/ml氨芐LB液體培 養(yǎng)液的96微孔板中培養(yǎng)24小時，離心取蘭色菌體細(xì)胞，用DMF (二甲基甲酰胺)萃取蘭色 物質(zhì)，在610nm與540nm處測定其光吸收值，篩選出540nm處光吸收值高的重組大腸桿菌 克隆。
(5) 2—萘酸單加氧酶純化
挑取540nm光吸收值高的重組大腸桿菌單克隆接種到5ml含100pg/ml氨芐LB液體培養(yǎng) 液，37'C過夜培養(yǎng)；然后擴大接種到100ml含100ng/ml氨芐LB液體培養(yǎng)液中，接種量 0.5%~5%，培養(yǎng)基pH6.0 8.5，搖床轉(zhuǎn)速為80-200轉(zhuǎn)/分鐘(卬m)， 37°C，當(dāng)0060()達到0.5~0.7 時加入IPTG (終濃度0.5 1.0pM) 28-C低溫誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)24~48小時，培養(yǎng)液以 3000 12000rpm， 4。C離心，去除上清夜，收集離心后的細(xì)胞，懸浮于5ml的pH7.5的磷酸鹽緩沖液(PBS)，在冰浴條件下超聲波破菌(或高壓)5分鐘，再用8000 12000rpm， 4。C離心 5~15分鐘，得到含有2-萘酸單加氧酶的細(xì)胞破碎液。
經(jīng)過大腸桿菌誘導(dǎo)表達的2-萘酸單加氧酶的細(xì)胞破碎液，采用TOYOBO公司的NPK7 蛋白純化試劑盒純化NPK7蛋白純化試劑盒MagExtractor-His-tag是主要用于純化大腸桿菌 中進行表達的His-tag融合蛋白質(zhì)的試劑盒。添附的磁珠是與鎳螯合的瓊脂糖磁珠，與His-tag 的選擇性結(jié)合能力非常出色，能夠從菌體破碎液中直接純化His-tag融合蛋白質(zhì)。
使用組氨酸t(yī)ag (His-tag)進行純化的方法，是利用了在組氨酸側(cè)鏈位置處的唑環(huán)和金屬 離子(Ni2+等)相螯合的性質(zhì)，可以使由基因重組技術(shù)制備的His-tag蛋白質(zhì)的純化效率大大 提高。研究中，我們采用pET22b(+)為載體誘導(dǎo)表達2-萘酸單加氧酶，經(jīng)過表達的2-萘酸單 加氧酶與載體pET22b(+)中組氨酸t(yī)ag (His-tag)融合，融合蛋白純化步驟參照TOYOBO公 司的NPK7蛋白純化試劑盒說明書。
經(jīng)過誘導(dǎo)表達的pET22b(+)-nmoA，其體內(nèi)蛋白及體外純化蛋白SDS-PAGE的圖譜見圖1 ， 由圖l可以看出CK即為轉(zhuǎn)入空載體pET22b(+)的大腸桿菌未表達2-萘酸單加氧酶，而轉(zhuǎn)入 pET22b(+)-nmoA的大腸桿菌表達了2-萘酸單加氧酶，經(jīng)過提純得到蛋白經(jīng)過SDS-PAGE驗證其 大小合適，可以推斷純化的蛋白為2-萘酸單加氧酶。 (6) 2-萘酸單加氧酶催化吲哚產(chǎn)生靛玉紅。
純化后2—萘酸單加氧酶(濃度2mg/ml) lml，加入25(^1的濃度為100nM吲哚溶液， 37'C溫浴6小時，10ml氯仿提取色素，熱浴蒸干溶劑，得到紫紅色的粉狀物，將提取物經(jīng)過 反相高效液相色譜和光譜掃描分析測定。
本次測定的標(biāo)樣靛藍(lán)與靛玉紅由中國生物藥品制品研究所提供，檢測方法是反相高效液 相色譜和光譜掃描分析。
光譜掃描分析測定是參照中國藥典2005年版的測定方法。
反相高效液相色譜(RP-HPLC)的條件及參考文獻如下
RP國HPLC采用Hyperclone C18柱，以0.1%H3PO4 :甲醇(30 : 70)為流動相，流速0.9 ml/min，檢測波長292nm，檢測溫度為30。C，儀器島津LC-20A型高效液相色譜儀。 參考文獻
(劉曉芳，程弘.板藍(lán)根質(zhì)量檢測應(yīng)增加靛玉紅、靛藍(lán)檢驗項目[J ].中國藥品標(biāo)
準(zhǔn),2002年3月第二巻32-33:
王燕桓，劉國瑞等.RP-HPLC法測定板藍(lán)根浸膏中靛藍(lán)、靛玉紅的含量.河北大學(xué)學(xué)報
(自然科學(xué)版)2005年9月第25巻第5期507—509;
李莉，曹賀.反相高效液相色譜法測定錫類散中靛藍(lán)及靛玉紅的含量.時珍國醫(yī)國
9藥.2006年第17巻第5期 725—726。)
本次測定的圖2是靛玉紅標(biāo)樣RP-HPLC的圖譜，圖3是靛玉紅標(biāo)樣的光譜掃描圖譜，圖 4是靛藍(lán)標(biāo)樣的RP-HPLC的圖譜，圖5是靛藍(lán)標(biāo)樣的光譜掃描圖譜，圖6是提純的2-萘酸單 加氧酶催化吲哚后的氯仿提取物的反相高效液相色譜RP-HPLC圖譜；圖7是提純的2-萘酸 單加氧酶催化吲哚后的氯仿提取物的光譜掃描圖；由圖6與圖2， 4，圖7與圖3， 5比較可 知，圖6和圖7存在靛玉紅的保留時間一致，在同一個位置出現(xiàn)的吸收峰，因此可以證明純 化的2-萘酸單加氧酶催化吲哚后的氯仿提取物含有靛玉紅，從而證明2 —萘酸單加氧酶能催 化產(chǎn)生靛玉紅。
以標(biāo)樣靛玉紅(中國藥品生物制品檢定所提供)做濃度和光吸收的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定 OD54onm處吸收，計算野生型的pET22b(+)-nmoA重組大腸桿菌的2-萘酸單加氧酶，該2-萘 酸單加氧酶催化效率(Kcat/Km值)為238M"S—1
(7)含有2—萘酸單加氧酶的全細(xì)胞催化吲哚產(chǎn)生靛玉紅。
挑取540nm光吸收值高的重組pET22b(+)-nmoA大腸桿菌E coli BL21 DE3單克隆接種 到5ml含100pg/ml氨芐LB液體培養(yǎng)液，37。C過夜培養(yǎng)；而后接種到100ml含lOO^ig/ml氨芐 LB液體培養(yǎng)液中，接種量0.5%~5%，培養(yǎng)基pH6.0 8.5，搖床轉(zhuǎn)速為80~200轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)， 37。C培養(yǎng)當(dāng)OD600達到0.5~0.7時加入IPTG (終濃度0.5~1.0pM) 28。C低溫誘導(dǎo)，繼續(xù)培 養(yǎng)24 48小時，培養(yǎng)液以3000 12000卬m， 4。C離心，去除上清夜，收集離心后的細(xì)胞，懸浮 于5ml的pH7.5的磷酸鹽緩沖液(PBS)，以3000-12000rpm， 4。C離心，去除上清夜，菌體 細(xì)胞加入1000^1的濃度為100nM吲哚溶液，37'C溫浴6小時，用8000 12000rpm， 4'C離心 5~15分鐘，得到含有2-萘酸單加氧酶的細(xì)胞，10ml氯仿萃取色素，真空旋轉(zhuǎn)，蒸干溶劑， 得到紫紅色的粉狀物，經(jīng)過反相高效液相色譜分析測定和光譜掃描測定。以未轉(zhuǎn)入載體的大 腸桿菌￡<;0//81^1 (DE3)和轉(zhuǎn)入空載體pET22b(+)的大腸桿菌EcoliBL21DE3作為對照。 圖8是2-萘酸單加氧酶重組大腸桿菌克隆催化吲哚后的氯仿提取物的反相高效液相色譜 RP-HPLC圖譜；圖9是2-萘酸單加氧酶重組大腸桿菌克隆催化吲哚后的氯仿提取物的光譜掃 描圖；圖8與圖2， 4，圖9與圖3， 5比較可知，圖8，圖9存在與標(biāo)樣靛藍(lán)、靛玉紅的保留 時間一致，在同一個位置出現(xiàn)的吸收峰，因此可以證明2-萘酸單加氧酶重組大腸桿菌克隆催 化吲哚后的氯仿提取物含有靛玉紅，未轉(zhuǎn)入載體的大腸桿菌￡ co//BL21 (DE3)和轉(zhuǎn)入空載 體pET22b(+)的大腸桿菌Eco"BL21DE3，都沒有紅色或者藍(lán)色色素的產(chǎn)生，沒有檢測到靛 玉紅及靛藍(lán)，而從而證明2-萘酸單加氧酶重組大腸桿菌克隆能催化吲哚產(chǎn)生靛玉紅。
實施例2
10(l) 2-萘酸單加氧酶基因分子體外定向進化技術(shù)和DNA shuffling過程 (Al)進行第一步易錯PCR1 (error-prone PCR)
以從來自Sw狄oWerZa sp.JT1500的2 —萘酸單加氧酶基因簇(長度為4802bp序列號為 AJ566333)的pUC18克隆重組子pEK123為模板，在長度為4802bp的2—萘酸單加氧酶基因 簇(AJ566333)上2579—-3982bp位置處設(shè)計特異性引物。
引物上游引物AF5>TTATCATATGATGCGGCGGCATTCG<3引入酶切位點NdeI 下游弓I物AR5〉CTCTGAAG CTTCTGCGGCTTGTG<3弓I入酶切位點HindIII PCR反應(yīng)體系(100W體系)上海生工Pfti DNA Polymerase ( B0093): lOxbuffer 10^1, 5mM MnC12 2pl lOnmdNTP 2(^1, PfU DNA Polymerase 2^1， lOnmPrimersAF 2pl, 1 OnmPrimer s AR 2 pi
模板(5w狄oWw/asp.JT1500的總DNA) 2^1 超純水 78^1 PCR擴增條件95。C變性5分鐘(min)后；在95。Clmin， 57。Clmin， 72。C2min經(jīng)過30 個循環(huán)；然后72。C延伸10min， 12。C終止反應(yīng)。
經(jīng)過瓊脂糖電泳鑒定(圖IO)，擴增獲得PCR產(chǎn)物2-萘酸單加氧酶基因片段nmoA，用 上海生工UN1Q-10柱式DNA膠回收試劑盒(SK1131)回收1311bp大小片段的PCR1產(chǎn)物。 然后用DNAaseI不完全酶切(降解)PCR1產(chǎn)物，DNAaseI酶切條件3~4嗎模板片段，0.01U DNaseI， 15 。C 8min，回收10-50 bp碎片段，90°C滅活，冰乙醇+醋酸鈉回收，70%乙醇洗 滌，晾干，TE溶解保存。 (A2)無引物(自身引物)進行第二步PCR2
以第一步PCR1酶切得到的10 50bp碎片段的自身為模板，進行無引物PCR2
反應(yīng)體系
10xbuffer 10(xl
lOnmdNTP 2^1
Pfu DNA Polymerase 2jxl
易錯PCR的酶切回收產(chǎn)物
超純水 76^1反應(yīng)參數(shù)
94 。C變性5min, 94 °C 45s; 45-56 °C 45s;
72。C卯s;進行50個循環(huán) 72 。C延伸10min。 得到無引物PCR產(chǎn)物，其電泳圖參見圖IO。 (A3)采用帶酶切位點的特異性引物進行第三步PCR3得到目標(biāo)大小產(chǎn)物，
引物上游弓i物AF5>TTATCATATGATGCGGCGGCATTCG<3弓I入酶切位點Ndel 下游弓i物AR5〉CTCTGAAG CTTCTGCGGCTTGTG〈3弓i入酶切位點HindIII
PCR的反應(yīng)體系
10xbuffer 10|il,
5mM MnC12 2pl，
10nmdNTP 2^1，
PfU DNA Polymerase 2/al,
10nmPrimersAF/AR 2nl,/2pl 模板(無引物PCR產(chǎn)物)2^1
超純水 78 ^
PCR擴增條件95。C變性5mm后，在95°C lmin,57。C lmin,72。C 2min，經(jīng)過30 個循環(huán)，然后72'C延伸10min， 12'C終止反應(yīng)，獲得PCR產(chǎn)物，其電泳圖參見圖11。 (2) pET22b(+)-nmoA^^重組大腸桿菌的構(gòu)建
步驟(1) A3步驟獲得的PCR3產(chǎn)物用上海生工UN1Q-10柱式DNA膠回收試劑盒 (SK1131)回收1311bp大小的2—萘酸單加氧酶突變體nmoA^片段的產(chǎn)物，采用Ndel和 HindIII雙酶切后，與經(jīng)過同樣酶切后的線性質(zhì)粒載體pET22b(+)連接，構(gòu)建片段 pET22b(+)-nmoA*。
酶切體系50^1:載體pET22b(+)或PCR產(chǎn)物nmoA* 各10^1 (0.1~1嗎)，分別加Ndel 和HindlII(10U/n1)1^, 10xbuffer 5nl,超純水補足至50^1， 37°C 2~8小時雙切。
連接體系20^1:酶切產(chǎn)物pET22b(+)/Ndel+Hindl11以及nmoA*/NdeI+Hindin各5pl等摩 爾混合，T4DNA連接酶(lswiss/nl) 1~2^1， 10x連接buffer2pl，超純水補充至20^1。 16°C， 連接1~12小時。
連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌￡ co/z'BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞(如果效率低可以采用大腸桿菌TOP10預(yù)先轉(zhuǎn)化，陽性克隆連接載體再轉(zhuǎn)化E coli BL21 DE3感受態(tài)細(xì)胞)，涂布到涂IPTG 與X-gal的的氨芐(100嗎/.ml) LB瓊脂平板上，37。C過夜培養(yǎng)。
從上述過夜培養(yǎng)的平板上挑取白色的克隆，并轉(zhuǎn)接到lml含100pg/ml氨芐LB液體培養(yǎng) 液的96微孔板中培養(yǎng)24小時，離心取蘭紫色菌體細(xì)胞，用DMF (二甲基甲酰胺)提取蘭紫 色物質(zhì)，在630nm與540nm處測定其光吸收值，篩選出540nm處光吸收值高的重組大腸桿 菌。
每經(jīng)過一輪易錯PCR1 (Al步驟)、無引物PCR2 (A2步驟)、特異性引物擴增PCR3 (A3 步驟)等三步PCR，連接載體pET22b，篩選陽性克隆，為一輪DNA shuffling;提取篩選得 到陽性克隆的重組質(zhì)粒，以重組質(zhì)粒為模版進行下一輪DNAshuffling。經(jīng)過若干輪的易錯PCR 及DNA shuffling篩選，篩選得到540nm處光吸收值高的重組大腸桿菌，命名為突變型 ￡丁2215(+)-謡0八*重組大腸桿菌。
(4) 2 —萘酸單加氧酶進化后的突變型pET22b(+)-nmoA+重組大腸桿菌與其野生型 pET22b(+)-nmoA重組大腸桿菌表達蛋白催化吲哚產(chǎn)生靛玉紅的催化效率比較
所述的野生型pET22b(+)-nmoA重組大腸桿菌是將2 —萘酸單加氧酶(nmoA)基因與 pET22b(+)連接，構(gòu)建形成pET22b(+)-nmoA片段，然后將此片段轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌感受態(tài)細(xì) 胞中，經(jīng)過藍(lán)白斑篩選，挑取白色克隆，然后將克隆轉(zhuǎn)接到lml含10(Hig/ml氨芐LB液體培 養(yǎng)液的96微孔板中培養(yǎng)24小時，離心取蘭色菌體細(xì)胞，用DMF (二甲基甲酰胺)提取蘭色 物質(zhì)，在610nm與540nm處測定其光吸收值，篩選獲得540nm處光吸收值高的重組大腸桿 菌，此重組的大腸桿菌即為野生型pET22b(+)-nmoA重組大腸桿菌。
野生型pET22b(+)-nmoA重組大腸桿菌及進化后突變型pET22b(+)-nmoA"^重組大腸桿菌 單克隆分別接種到5ml含lOOpg/ml氨芐LB液體培養(yǎng)液，37'C過夜培養(yǎng)；而后接種到100ml 含lOOpg/ml氨芐LB液體培養(yǎng)液中，接種量0.5%~5%，培養(yǎng)基pH6.0~8.5，搖床轉(zhuǎn)速為80 200 轉(zhuǎn)/分鐘(卬m)， 37。C培養(yǎng)當(dāng)OD6oo達到0.5-0.7時加入IPTG (終濃度0.5-1.0nM)， 28。C低 溫誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，培養(yǎng)液以3000 12000rpm， 4'C離心，去除上清夜，收集離心后 的細(xì)胞，懸浮于5ml的pH7.5的磷酸鹽緩沖液(PBS)，以3000 12000rpm， 4'C離心，去除 上清夜，菌體細(xì)胞懸浮于5ml的pH7.5的磷酸鹽緩沖液(PBS)，在冰浴條件下超聲破菌(或 高壓)5分鐘，再用8000——12000rpm， 4。C離心5—15分鐘，分別得到含有2-萘酸單加氧酶 或2-萘酸單加氧酶突變體的細(xì)胞破碎液。
經(jīng)過大腸桿菌誘導(dǎo)表達的的細(xì)胞破碎液，采用TOYOBO公司的NPK7蛋白純化試劑盒 純化。蛋白純化步驟參照TOYOBO公司的NPK7蛋白純化試劑盒說明書。分別在純化后2 一萘酸單加氧酶(濃度約2mg/ml) lml， 2—萘酸單加氧酶突變體(濃度約2mg/ml) lml中加入250ul的濃度為100nM吲哚溶液，37。C溫浴6小時，12000rpm， 4'C離心，取上清產(chǎn)物， 10ml氯仿提取紅色色素，熱浴蒸干溶劑，得到紫紅色的粉狀物，對其進行光譜掃描分析。
圖3是靛玉紅標(biāo)樣的光譜掃描圖，圖5是靛藍(lán)標(biāo)樣的光譜掃描圖，圖12是野生型 pET22b(+)-nmoA重組大腸桿菌的2 —萘酸單加氧酶催化吲哚的上清液提取物，圖13是突變 型pET22b(+)-nmoA+重組大腸桿菌的2—萘酸單加氧酶突變體催化吲哚的上清液提取物。圖 12，圖13中含有與標(biāo)樣靛玉紅的保留時間一致，在同一個位置出現(xiàn)的吸收峰，因此可以證明 兩者的上清液提取物中含有靛玉紅。
從圖15中可以看出轉(zhuǎn)入野生型的2-萘酸單加氧酶基因的大腸桿菌和轉(zhuǎn)入經(jīng)過篩選得到 的2-萘酸單加氧酶突變體基因的大腸桿菌在40kDa的位置都有蛋白，而轉(zhuǎn)入空載體和未轉(zhuǎn)入 載體的大腸桿菌在相應(yīng)位置沒有出現(xiàn)蛋白條帶，因此2個基因重組的大腸桿菌獲得了 2-萘酸 單加氧酶或突變體的表達。由于采用了蛋白His-tag特異性親和吸附的提取方法，因此可以證 明我們提純的蛋白是轉(zhuǎn)入基因編碼的蛋白，即2-萘酸單加氧酶或2-萘酸單加氧酶突變體。
野生型的pET22b(+)-nmoA重組大腸桿菌表達的2-萘酸單加氧酶和突變型 pET22b(+)-nmoA+重組大腸桿菌表達的2-萘酸單加氧酶突變體都能催化U引哚產(chǎn)生靛玉紅。以 標(biāo)樣靛玉紅(中國藥品生物制品檢定所提供)做濃度和光吸收的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定ODs4onm處 吸收，計算野生型的pET22b(+)-nmoA重組大腸桿菌的2-萘酸單加氧酶和突變型 pET22b(+)-nmoA+大腸桿菌的2-萘酸單加氧酶突變體產(chǎn)率。
突變型pET22b(+)-nmoA+重組大腸桿菌的2-萘酸單加氧酶突變體催化效率(Kcat/Km值) 為777M"S"。對？￡丁221)(+)-腦0八*重組大腸桿菌￡0 //81^1 (DE3)的2-萘酸單加氧酶突變 體基因nmoA+測序分析發(fā)現(xiàn)，該突變體基因在2-萘酸單加氧酶基因的601位的T突變?yōu)锳， 從而造成了2-萘酸單加氧酶氨基酸序列的201位苯丙氨酸(Phe)突變?yōu)楫惲涟彼?Ile)。 (5) 2—萘酸單加氧酶進化后的突變型？￡12215(+)-111110六*重組大腸桿菌的全細(xì)胞催化吲哚產(chǎn) 生靛玉紅。
挑取540nm光吸收值高的重組pET22b(+)-nmoA大腸桿菌及其突變型PET22b(+)-nmoA* 重組大腸桿菌單克隆分別接種到5ml含100pg/ml氨芐LB液體培養(yǎng)液，37'C過夜培養(yǎng)；而后 接種到100ml含100ng/ml氨芐LB液體培養(yǎng)液中，接種量0.5%~5%，培養(yǎng)基pH6.0~8.5，搖 床轉(zhuǎn)速為80~200轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)， 37。C培養(yǎng)當(dāng)OD600達到0.5-0.7時加入IPTG (終濃度 0.5~1解)28。C低溫誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)24 48小時，培養(yǎng)液以3000 12000rpm， 4'C離心，去 除上清夜，收集離心后的細(xì)胞，懸浮于5ml的pH7.5的磷酸鹽緩沖液(PBS)，以3000 12000rpm， 4'C離心，去除上清夜，菌體細(xì)胞加入1000pl的濃度為lOOnM吲哚溶液，37。C溫浴6小時， 用8000-12000rpm， 4'C離心5~15分鐘，得到含有2-萘酸單加氧酶的細(xì)胞，10ml氯仿萃取色素，真空旋轉(zhuǎn)，蒸干溶劑，得到紫紅色的粉狀物。光譜掃描(分析方法參照中國藥典)，見 圖14，從圖14中可以看出突變型pET22b(+)-nmoA承重組大腸桿菌和野生型pET22b(+)-nmoA 重組大腸桿菌細(xì)胞破碎液的萃取的紫紅色產(chǎn)物，存在與標(biāo)樣靛玉紅保留時間一致，在特征吸 收波長540nm處峰型一致的吸收峰，證明紅色粉狀物為靛玉紅。將未轉(zhuǎn)化該基因的大腸桿 菌￡ >//81^1 (DE3)和轉(zhuǎn)入空載體pET22b(+)的大腸桿菌五co/ZBL21 (DE3)未能提取到紅 色物質(zhì)，即沒有產(chǎn)生靛玉紅。
實施例3
本實施例與實施例2相同，只是篩選得到的突變體不同，本實施例篩選到的突變型 pET22b(+)-nmoA一重組大腸桿菌的2-萘酸單加氧酶突變體催化效率(Kcat/Km值)為819M"S—、
對pET22b(+)-nmoA+重組大腸桿菌￡ co// BL21 (DE3)的2-萘酸單加氧酶突變體基因 nmoA^-測序分析發(fā)現(xiàn)，該突變體基因在2-萘酸單加氧酶基因的601位的T突變?yōu)锳， 733位 的T突變?yōu)锳及735位的G突變?yōu)镃，從而造成了 2-萘酸單加氧酶氨基酸序列的201位苯丙 氨酸(Phe)突變?yōu)楫惲涟彼?Ile)， 245位色氨酸(Trp)突變?yōu)榻z氨酸(Ser)。
實施例4
本實施例與實施例2相同，只是篩選得到的突變體不同，本實施例篩選到的突變型 pET22b(+)-nmoAt重組大腸桿菌的2-萘酸單加氧酶突變體催化效率(Kcat/Km值)為909M—S—1。
對pET22b(+)-nmoA+重組大腸桿菌￡ co// BL21 (DE3)的2-萘酸單加氧酶突變體基因 nmoA^-測序分析發(fā)現(xiàn)，該突變體基因在2-萘酸單加氧酶基因的352-354位的CTC突變?yōu)?GCA， 601位的T突變?yōu)锳, 733位的T突變?yōu)锳及735位的G突變?yōu)镃，從而造成了 2-萘 酸單加氧酶氨基酸序列的118位的亮氨酸(Leu)突變?yōu)楸彼?Ala)， 201位苯丙氨酸(Phe) 突變?yōu)楫惲涟彼?Ile)， 245位色氨酸(Trp)突變?yōu)榻z氨酸(Ser)。
15序列表
<110>廣東省微生物研究所
<120>用于制備抗癌藥物靛玉紅的2-萘酸單加氧酶
<160>5
<210> 1
<211> 1314
<212> DNA
<213>伯克霍爾德氏菌(5z^狄oWe〃'asp. JT1500) <220> <221> CDS <400> 1
ATGCGGCGGCATTCGACGCCGAAGTGCGCGCTTTCCTCGCAACACTCTAGAACCCTCCAG60
GAGACTACCGTGGCCTATCAGCCCCCTTCGATCGTCGGCGAGCATTACCCGCTCACGGAC120
AAGCAGCGGCGCTTGCTGGCGCTGGCCGAGCAGGTGGGGCGCGAGTCGCTCGCGCCACGC180
GCCGCGCGCTGGGACCGCGAAGCGTCGTTCCCGTTCGAGAACTACGACGACATGCGCGCC240
GCCGGCTTGCTCAAGCTGTGCATTCCCGAAGCGGACGGCGGTCTGGGCGCCGACTTCGCC300
ACGTACATGA.TGGTTTCCGC360
AACATGCACACGTGCTCGATGATGTGGACAGGGATTCTCGCCGACGATCTCGACATGACG420
CCCGAGCAACGCGCCGAGCATGCGCGTTATCGCGAGCACCACTTCGCCCGGGTGATCCAG■
GACGGTGCGATTTACGCACAGCCGTTCTCCGAGGGCAGCGCCGCGGCGGCGGGCAAGGCA540
CCGTTCGGCACCACGGCCACCAAGGTCGAGGGCGGCTGGAAGATCAATGGCCGCAAGATT600
TTCGCGTCGCTCTCGGGGGCCGCCAACTACTACGGCGTGCTGTGTACCGAAGACAAGCCC660
GAGCTGTCGATGAAGGACACGTTCTACATCGCGGTGCCGGGCGACGCGCCGGGCGTGACC720
GTCACAGGTGACTGGGATCCGCTGGGCATGCGCGGTACGGTCTCGCGCACGTTGCTTTTC780
AAGGACGTGTTCGTGCCCGACGAGCTGCAATTGATGCCGCGCGGCATCTACCATCAGGCC840
GCGAGCCGCTGGCCGCACATGGTCATGACGCTCTCGCCGACATACATGGGTATCGCCCAG■
GCTGCCTATGATTTCACCATCCAGTACCTGCGGGGCGAAGCGCCCGGCATGGGCGCGCCG960
GTCAAGCGCCGCATGTATCCGACCAAGCAGATCGCCGTCGCGCAAATGCACATCCTGCTC1020
GAGCAAACGCGCGCGCTGTTCCTGCGTGCATTGCAGGACGGCCGCGCCGATCCGGGCAAG1080
GAAGCGCGCCTGCGTGCCTATGCGGCGCAGTACACGATCATGGAGAATGCCAACGAGCTG1140
TGCCGGCTGGCCATTCGCACCTGCGGCGGACAGTCGATGCTCAAGACGCTGCCGCTCGAG1200
16CGCATGTACC GCGATTCGCG CTGCGGCGCC CTGATGCTGC CCTGGACGGC CGAGCTGTGT 1260 CTCGATCGCA TCGGCCGCGA AGCGCTCTAC GAACCGGGCG AGCGCGACGA GTAA 1314
<210>2 <211>437 <212> PRT
<213>伯克霍爾德氏菌(5w狄oWen'a sp. <400> 2
Arg His Ser Thr Pro Lys Cys
JT1500)
Met Arg 1
Ser Arg lie Val Leu Ala Ala Ala Asp Asp Ala Asp Ser Ala Asn Met Asp Leu Arg Glu Ala Gin Pro Phe Asn Gly Tyr Gly Asp Thr Val Thr Arg Thr
Thr Gly Leu Arg Met Gly Glu His Asp His Pro Gly Arg Val Phe Gly Leu
Leu Glu Ala Trp Arg Gly Leu Thr Met His Phe Thr Lys Leu Tyr Asp Leu
Ser
5 Gin
20 His
35 Glu
50 Asp
65 Ala
80 Leu
95 Gly 110 Cys 125 Thr 140 Phe 155 Ser 170 Thr 185 lie 200 Cys 215 lie 230 Trp 245 Phe
Glu Tyr Gin Arg Ala Gly Arg Ser Pro Ala Glu Ala Phe Thr Ala Asp Lys
Thr Pro Val Glu Gly Ala His Met Glu Arg Gly Thr Ala Glu Val Pro Asp
Thr Leu Gly Ala Leu Asp Cys Met Gin Val Ser Lys Ser Asp Pro Leu Val
Val Thr Arg Ser Leu Phe Gly Trp Arg lie Ala Val Leu Lys Gly Gly Phe
Ala
10
Ala
25
Asp
40
Glu
55
Phe
70
Lys
85
Ala
100
Ala
115
Thr
130
Ala
145
Gin
160
Ala
175
Glu
190
Ser
205
Pro
220
Asp
235
Met
250
Val
Leu Ser
Tyr Gin
Lys Gin
Ser Leu
Pro Phe
Leu Cys
Thr Tyr
Thr Als
Gly lie
Glu His
Asp Gly
Ala Alei
Gly Gly
Gly Ala
Glu Leu
Ala Pro
Arg Gly
Pro Asp 17
Ser Pro Arg Ala Glu lie Met Leu Leu Ala Ala Gly Trp Ala Ser Gly Thr Glu
Gin Pro Arg Pro Asn Pro Met Thr Ala Arg lie Lys Lys Asn Met Val Val Leu
His
15 Ser
30 Leu
45 Arg
60 Tyr
75 Glu
90 Val 105 Phe 120 Asp 135 Tyr 150 Tyr 165 Ala 180 lie 195 Tyr 210 Lys 225 Thr 240 Ser 255 GiLeu Met
His Met
Ala Ala
Gly Met
lie Ala
Leu Phe
Glu Ala
Asn Ala
Gin Ser
Ser Arg
Leu Asp
Asp Glu 437
Pro Val Tyr Gly Val Leu Arg Asn Met Cys Arg
260 Arg Gly
275 Met Thr
290 Asp Phe
305 Ala Pro
320 Ala Gin
335 Arg Ala
350 Leu Arg
365 Glu Leu
380 Leu Lys
395 Gly Ala
410 lie Gly
425
lie Leu Thr Val Met Leu Ala Cys Thr Leu Arg
Tyr Ser lie Lys His Gin Tyr Arg Leu Met Glu
His Pro Gin Arg lie Asp Ala Leu Pro Leu Ala
Gin Thr Tyr Arg Leu Gly Ala Ala Leu Pro Leu
265 Ala 280 Tyr 295 Leu 310 Met 325 Leu 340 Arg 355 Gin 370 lie 385 Glu 400 Trp 415 Tyr 430
Met Arg 1
Ser Arg lie Val Leu Ala Ala Ala Asp Asp Ala Asp
Thr Gly Leu Arg Met Gly
Leu Glu Ala Trp Arg Gly
5 Gin
20 His
35 Glu
50 Asp
65 Ala
80 Leu
Glu Tyr Gin Arg Ala Gly
Thr Pro Val Glu Gly Ala
Thr Leu Gly Ala Leu Asp
Val Thr Arg Ser Leu Phe
Ala Met Arg Tyr Glu Ala Tyr Arg Arg Thr Glu
<210>3 <211>437 <212> PRT
<213>伯克霍爾德氏菌(5w^wWen'fl sp. <400> 3
His Ser Thr Pro Lys Cys
Ala 10 Ala 25 Asp 40 Glu 55 Phe 70 Lys 85 Ala 18
Ser Arg Gly lie Gly Glu Pro Thr Gin Thr Asp Pro Thr lie Thr Cys Met Tyr Ala Glu Pro Gly
270 Trp Pro
285 Ala Gin
300 Ala Pro
315 Lys Gin
330 Arg Ala
345 Gly Lys
360 Met Glu
375 Gly Gly
390 Arg Asp
405 Leu Cys
420 Glu Arg
435
JT1500)
Leu Tyr Lys Ser Pro Leu Thr
Ser Ser Gin Pro Gin Arg Leu Ala Phe Glu Cys lie Tyr Met
Gin His 15
Pro Ser 30
Arg Leu 45
Pro Arg 60
Asn Tyr 75
Pro Glu 90
Met ValSer Ala Glu Leu
Asn Met His Thr
Asp Leu Asp Met
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95 Gly 110 Cys 125 Thr 140 Phe 155 Ser 170 Thr 185 lie 200 Cys 215 lie 230 Trp 245 Phe 260 Gly 2了5 Thr 290 Phe 305 Pro 320 Gin 335 Ala 350 Arg 365 Leu 380 Lys 395 Ala 410 Gly 425
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100 Ala 115 Thr 130 Ala 145 Gin 160 Ala 175 Glu 190 Ser 205 Pro 220 Asp 235 Met 250 Val 265 Ala 280 Tyr 295 Leu 310 Met 325 Leu 340 Arg 355 Gin 370 lie 385 Glu 400 Trp 415 Tyr 430
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435
19437
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<213>伯克霍爾《恵氏菌(5wA^/zoWen'"sp. <400〉 4
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Ala 10 Ala 25 Asp 40 Glu 55 Phe 70 Lys 85 Ala 100 Ala 115 Thr 130 Ala 145 Gin 160 Ala 175 Glu 190 Ser 205 Pro 220 Asp 235 Met 250 Val 265 Ala 20
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Ser Gin His 15
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Arg Arg Leu 45
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Glu Asn Tyr 75
lie Pro Glu 90
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Leu Thr Phe 120
Leu Ala Asp 135
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Ala lie Tyr 165
Gly Lys Ala 180
Trp Lys lie 195
Ala Asn Tyr 210
Ser Met Lys 225
Gly Val Thr 240
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Ala Ala Tyr
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Gly Glu Arg 43權(quán)利要求
1.一種2-萘酸單加氧酶，其特征在于所述的2-萘酸單加氧酶的氨基酸序列如SEQ2所示，其基因的核苷酸序列如SEQ1所示。
2. —種權(quán)利要求1所述的2 —萘酸單加氧酶在生物催化制備抗癌藥物靛玉紅中的應(yīng)用。
3. —種含有權(quán)利要求1所述的基因，能夠表達權(quán)利要求1所述的酶的全細(xì)胞在生物催化制備靛玉紅中的應(yīng)用。
4. 以權(quán)利要求1所述的2 —萘酸單加氧酶為基礎(chǔ)衍生出的，經(jīng)過分子修飾的，引起氨基酸序列發(fā)生功能性突變的2 —萘酸單加氧酶突變體在生物催化制備抗癌藥物靛玉紅中的應(yīng)用。
5. —種含有權(quán)利要求4所述酶突變體的編碼基因，能夠表達權(quán)利要求4所述的酶突變體的全細(xì)胞在生物催化制備靛玉紅中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種2-萘酸單加氧酶及其突變體，以及其在生物催化制備抗癌藥物靛玉紅中的應(yīng)用。本發(fā)明通過實驗證明2-萘酸單加氧酶能夠催化吲哚產(chǎn)生靛玉紅，本發(fā)明還通過實驗證明經(jīng)過分子改良的2-萘酸單加氧酶突變體也能生物催化制備靛玉紅，且其催化效率比野生型2-萘酸單加氧酶高，突變體的催化效率比野生型高2-4倍。本發(fā)明主要用于生物制備抗癌藥物靛玉紅。
文檔編號C12R1/01GK101580821SQ200910036718
公開日2009年11月18日 申請日期2009年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月19日
發(fā)明者孫國萍, 岑英華, 許玫英, 俊 郭, 韓木蘭 申請人:廣東省微生物研究所