專(zhuān)利名稱：耐輻射微桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種能耐受紫外輻射的新的細(xì)菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自從1956年美國(guó)科學(xué)家Anderson從輻射滅菌后變質(zhì)的肉類(lèi)罐頭中分離出耐輻射球菌 (De/"ococcw ra&o^ra""后，倍受微生物學(xué)家、放射生物學(xué)家和腫瘤研究人員的重視。開(kāi)發(fā) 和研究這類(lèi)微生物菌株資源以及研究其DNA損傷的修復(fù)能力，不僅對(duì)探索DNA修復(fù)分子機(jī)理 的基礎(chǔ)學(xué)科有著十分重要意義，而且對(duì)促進(jìn)新的DNA技術(shù)發(fā)展以及在環(huán)境保護(hù)和生物修復(fù)、 人類(lèi)健康、生物技術(shù)，乃至地外空間的開(kāi)發(fā)和利用等方面都具有極大的應(yīng)用前景。我國(guó)對(duì)微 生物資源的研究和開(kāi)發(fā)已有20多年，但尚未有極端耐輻射微生物新種或新屬的報(bào)道，相關(guān)抗 輻射微生物的研究起步較晚。因此，加強(qiáng)耐輻射的微生物菌種資源的篩選和挖掘成為新的研 究熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠耐受紫外輻射的新種微生物——耐輻射微桿菌。 本發(fā)明所述的耐輻射微桿菌命名為耐輻射微桿菌iW/'croZw"en'wm ra力o^rara
GIMN1.002，保藏編號(hào)為CCTCCNo.M208212。
本發(fā)明所述的耐輻射微桿菌是從新疆的核輻射地區(qū)土壤中采集，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)獲得。
該菌培養(yǎng)條件為-
(1) 培養(yǎng)基采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)。
具體配方為蛋白胨10.0g，酵母膏5g，氯化鈉(NaCl) 5g，瓊脂20.0g,水1000ml; pH6.8 7.0;
(2) 培養(yǎng)溫度28°C。
本發(fā)明耐輻射微桿菌(MicTOha"eriwm ra&odwrara GIMN1.002)的分子分類(lèi)地位的確定。 該菌株的16SrDNA序列如SEQ ID NO: 1所示。
本發(fā)明所述的耐輻射微桿菌其形態(tài)特征與其他的微桿菌有差異。與基因序列同源性98% 的菌株相比，也明顯不同。纖維化纖維菌(Ce〃w/oWmicraZ^w "http://"/""^與本發(fā)明所述的耐輻射
3微桿菌16SrDNA序列同源性達(dá)98.9M，但生理生化特征不同，纖維化纖維菌是好氧和兼性厭 氧，本發(fā)明的耐輻射微桿菌在厭氧情況下不生長(zhǎng)；纖維化纖維菌的甲基萘醌類(lèi)型為MK-9(H4)， MK-9(H2)， MK-8(H4)， MK-7(H4)，本發(fā)明的耐輻射微桿菌甲基萘醌主要類(lèi)型為MK-7;脂 肪酸含量測(cè)定顯示本發(fā)明的耐輻射微桿菌屬于微桿菌屬，不屬于纖維化菌屬；樹(shù)狀微桿菌 (M/cra&o"er/ww aWomyce"力與本發(fā)明的耐輻射微桿菌的16SrDNA序列同源性最高是98.8%， 但樹(shù)狀微桿菌產(chǎn)生H2S，菌落顏色暗橙色，而本發(fā)明的耐輻射微桿菌不能產(chǎn)生H2S，菌落顏 色淡黃色，樹(shù)狀微桿菌和本發(fā)明的耐輻射微桿菌的DNA-DNA序列雜交同源性僅為17.1°/。； 蛾微桿菌(M/crak "ehww /w^en'tf/e)與本發(fā)明的耐輻射微桿菌的16SrDNA序列同源性最高是 98.7%，但蛾微桿菌能利用L-阿拉伯糖、D-木糖和蔗糖產(chǎn)酸，而本發(fā)明的耐輻射微桿菌不能 利用這些糖產(chǎn)酸；蛾微桿菌的菌落為紅橙色，而本發(fā)明的耐輻射微桿菌菌落為淡黃色；蛾微 桿菌和本發(fā)明的耐輻射微桿菌的DNA-DNA序列雜交同源性僅為12.89%; Mr'cro6""en'w/w w^/w'm'co/a與本發(fā)明的耐輻射微桿菌的16SrDNA序列同源性最高是98.15%，但 M'CTO6a"eWMw 5e^/m'm^to的甲基萘醌主要類(lèi)型為MK-10和MK-4，本發(fā)明的耐輻射微桿菌 甲基萘醌主要類(lèi)型為MK-7。
本發(fā)明的耐輻射微桿菌和部分相關(guān)菌株依據(jù)16SrDNA序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。 AfcTO6""m'ww g/"w"g&o//與本發(fā)明的耐輻射微桿菌的16SrDNA序列同源性最高是97.67%, 但在系統(tǒng)樹(shù)上和本發(fā)明的耐輻射微桿菌聚在一類(lèi)，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，Mcra^c佗n'Mm gke唯fTO// 的甲基萘醌的主要類(lèi)型是MK-ll和MK-12，而本發(fā)明的耐輻射微桿菌甲基萘醌主要類(lèi)型為 MK-7; Af/cra6""en'ww g/w犯"g&o//的細(xì)胞壁脂肪酸的主要成份是anteiso-C17:0、 anteiso-C15:0 和iso-C16: o，而本發(fā)明的耐輻射微桿菌細(xì)胞壁脂肪酸主要類(lèi)型是iso- C15:0、anteiSO-C15:0、iso-C16: o禾口 anteiso -Cn: o。
綜合16SrDNA序列分析和DNA-DNA雜交結(jié)果(1987年國(guó)際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)委員會(huì)ICSB規(guī) 定，DNA同源性小于70%或雜交分子的熱解鏈溫度差小于或等于21:為細(xì)菌種的界線，Wayne et al，1987)，本發(fā)明的耐輻射微桿菌是一種新的細(xì)菌，命名為耐輻射微桿菌M/cra6a"er/"m rat/zWMrans GIMN1.002。
本發(fā)明耐輻射微桿菌具有以下有益效果
本發(fā)明耐輻射微桿菌具有很強(qiáng)的耐受紫外輻射的能力，在對(duì)研究其DNA損傷的修復(fù)分 子機(jī)理，促進(jìn)新的DNA技術(shù)在環(huán)境保護(hù)、生物修復(fù)、人類(lèi)健康等的發(fā)展有著重要意義。
本發(fā)明菌株耐輻射微桿菌M,'cro6a"m'ww ra^oc/wrara GIMN1.002已于2008年11月10 日保藏于國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為No.M208212。


圖1是本發(fā)明所述耐輻射微桿菌的透射電子顯微鏡照片(2nm);
圖2是本發(fā)明所述耐輻射微桿菌及部分相關(guān)菌株依據(jù)16SrDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)； 圖3是本發(fā)明所述耐輻射微桿菌和大腸桿菌在不同劑量紫外照射下的存活率。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)具體實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例1:
從新疆核輻射地區(qū)土壤中挖取土樣，取10g土壤放入裝有90mL無(wú)菌水的三角瓶中(帶 玻珠)，在180rpm轉(zhuǎn)速下振蕩30分鐘，靜置10分鐘后取上層液稀釋10倍后取O.lmL均勻 涂布在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基板上，翻轉(zhuǎn)平板置于28'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，即可獲得本發(fā)明所述的 耐輻射微桿菌GIMN1.002.
培養(yǎng)基采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。具體配方為蛋白胨10.0g，酵母膏5g，氯化鈉(NaCl)5g， 瓊脂20.0g，水1000ml， pH6.8 7.0;
培養(yǎng)溫度28°C。
本發(fā)明的耐輻射微桿菌M;cra6flc/e, 'ww ra&o^ra"; GIMN1.002具有下述微生物特征
1、 形態(tài)特征
菌株GIMN1.002在平板上菌落小，表面光滑半透明，邊緣整齊，有光澤。在液體中呈沉 淀性混濁。革蘭氏染色為陽(yáng)性，菌體短桿狀。
2、 生理生化特征
菌株GIMN1.002的接觸酶試驗(yàn)為弱陽(yáng)性，氧化酶陰性；運(yùn)動(dòng)弱；不能水解淀粉；吲哚和 V-P反應(yīng)為陰性；不利用檸檬酸鹽和丙二酸鹽，不能水解酪氨酸、酪蛋白、尿素；硝酸鹽還 原陽(yáng)性，不產(chǎn)生H2S。在2%-7%NaCl中能生長(zhǎng)。厭氧環(huán)境下不能生長(zhǎng)。Biolog測(cè)定菌株 GIMN1.002的碳源利用情況如表1所示。
表1耐輻射微桿菌的碳源利用情況
碳源利用情況碳源利用情況碳源利用情況
糊精-山梨醇+"Z-氨基丁酸-
5淀粉-木糖醇-苦杏仁苷+
吐溫40-己六醇+肌苷-
吐溫80-肌醇-尿苷+
L-阿拉伯糖-氨基乙醇-水楊苷+
D-阿拉伯糖-赤藻糖醇-甘油-
蔗糖-半乳糖醇+尿素-
D-葡萄糖+山梨糖醇+羥甲基纖維素-
麥芽糖+側(cè)金盞花醇-D-葡萄糖醛酸鹽-
D-甘露糖+甲酸鈉-半乳糖醒酸鹽-
D-乳糖-乙酸鈉-丁二胺+
D-半乳糖-丙酸鈣-N-乙酰葡萄糖胺-
山梨糖-丙二酸鈣-L-谷胺酰氨-
L-果糖-a-酮戊二酸+L-谷氨酸-
D國(guó)果糖+丙酮酸鈉+L-丙氨酸-
密—糖-草酸鈉-D-丙氨酸-
龍膽二糖+香草酸-甘氨酸-
D-纖維二糖+葵二酸-鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽-
棉子糖-羥基苯乙酸-蘇氨酸-
L-鼠李糖-苯甲酸鈉-賴氨酸-
D-木糖+葡萄糖酸鈉+脯氨酸-
木糖+檸檬酸鈉-組氨酸-
菊糖-馬尿酸鈉-色氨酸-
松三糖-琥珀酸鈉+纈氨酸-
松二糖-脫氧膽酸鈉+L-白氨酸-
D-核糖-水楊酸鈉絲氨酸-
塔格糖-乳酸鈉+精氨酸-
海藻糖+酒石酸鉀鈉-胱氨酸-
甘露醇+衣康酸-L-羥脯氨酸-
L-阿糖醇-烏頭酸-天冬氨酸D-阿糖醇 - 蘋(píng)果酸 - 酪氨酸
甲硫氨酸 - 苯丙氨酸 -
+ :利用；-:不利用
3、其他性質(zhì)
甲基萘醌主要類(lèi)型為MK-7。細(xì)胞壁脂肪酸種類(lèi)和含量如表2。
表2細(xì)胞壁脂肪酸種類(lèi)和含量
脂肪酸含量(％)脂肪酸含量(％)
10:0 30H0.3516:1 w7c alcohol0.52
12:00.1516:0 iso18.16
13:0 iso0.3116:1 wile0.75
12:0 20H0.47Sum In Feature 32.32
12:0 30H0.2616:02.09
14:0 iso5.1617:1 iso wlOc0.15
14:00.8617:0 iso1.35
13:0 iso 30H0.3417:0 anteiso7.53
15:1 isoF0.3617:00.54
15:1 anteiso A0.4618:0 iso0.13
15:0 iso17.4618:00.18
15:0 anteiso38.6717:0 30H0.10
15:0_—
實(shí)施例2: 16SrRNA基因序列分析 1 、 PCR模板DNA的快速制備
將實(shí)施例1所得菌株劃線接種在NA培養(yǎng)基的平板上，3(TC培養(yǎng)過(guò)夜。取單一菌落懸浮 于lO)il無(wú)菌蒸餾水中，于沸水中加熱5min，離心，取上清作為PCR模板DNA. 2、 16SrRNA基因序列的PCR擴(kuò)增
PCR引物由上海英駿公司合成。
Primer A: 5， -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
PrimerB: 5 ， -AAGGAGGTGATCCACCCCCA-3'PCR反應(yīng)體系(總體積50(il): 10倍緩沖液5W， dNTP(2mmol/l)4pI， PrimerA (10pmol/l) lpl， PrimerB (10pmol/l) lpl， Taq酶(2U/l)0.4pl， DNA模板lnl，滅菌ddH20 37.4jxl。
PCR擴(kuò)增條件:94。C5min; 94。Clmin， 58。Clmin， 72。C2min， 30個(gè)循環(huán);72。C7min。 3、序列測(cè)定
PCR產(chǎn)物純化后，送上海英駿公司用3730全自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序。
實(shí)施例3:本發(fā)明耐輻射微桿菌耐紫外輻射能力測(cè)定
將本發(fā)明所述的耐輔射微桿菌菌株接種一環(huán)于液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(NA培養(yǎng)基不加瓊脂)中， 搖床培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期后，4'C， 5000rpm離心10min收集菌體；將菌體重懸于等體積0.1M 磷酸鉀Buffer(pH 7.0)(K2HPO4 27.816g， KH2P04 10.608g，溶解于1L蒸餾水中，121。C滅菌 20min)，之后4'C， 5000rpm離心10min收集菌體，將菌體再次重懸于等體積O.IM磷酸鉀 Buffer(pH7.0)中。
將菌液置于培養(yǎng)皿中，用滅菌的鐵絲攪拌，使菌體均勻。將培養(yǎng)皿分別置于0 500J/m2 不同劑量下紫外照射；取照射后的菌液稀釋涂布TGY瓊脂培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)后計(jì)數(shù)。 以培養(yǎng)基上菌落數(shù)30-300為有效平板，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。同時(shí)以大腸桿菌(￡. ^//)]^-12菌株為陰性 對(duì)照。試驗(yàn)菌和對(duì)照菌各進(jìn)行了 3組平行試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3和表4。
根據(jù)表3和表4作出圖3，結(jié)果表明，在不同劑量下，本發(fā)明所述的耐輻射微桿菌的存 活率均顯著高于對(duì)照的大腸桿菌。
表3 ￡. CO//K-12紫外照射下的存活情況
處理劑量
(J/m2)0175186
存活率1.000E+002.941E-016.809E-046.640E-06
標(biāo)準(zhǔn)差5.336E-022.740E-022.459E-051.476E-06
表4本發(fā)明耐輻射微桿菌紫外照射下的存活情況
8343 429 514
(J/m2)
存活率1.000E+00 2.315E-01 5.289E-03 9.798E-04 1.232E-03 1.235E-03 1.602E-04
標(biāo)準(zhǔn)差1.200E-02 1.200E-02 4.555E-04 1.684E-04 4.014E-05 1.361E-05 2.518E-05序列表
<110>廣東省微生物研究所 <120>耐輻射微桿菌
<160> 1
<170> Patentln version 3.1
<210> 1 <211> 1430bp <212>rDNA
<213> M/cra6""e由附raWodwrara <400> 1
gggatcgtgc cggcgtgctt accatgcagt cgaacggtga agcccagctt 50 gctgggtgga tcagtggcga acgggtgagt a濃cgtgag caatctgccc 100 ctgactctgg gataagcgct ggaaacggcg tctaataccg gatatgagct 150 gcggccgcat ggtcggcagt tggaaagatt tttcggtcag ggatgagctc 200 gcggcctatc agcttgttgg tgaggtaatg gctcaccaag gcgtcgacgg 250 gtagccggcc tgagagggtg accggccaca ctgggactga gacacggccc 300 agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcggaagc 350 ctgatgcagc aacgccgcgt gagggatgac ggccttcggg ttgtaaacct 400 cttttagcag ggaagaagcg aaagtgacgg tacctgcaga aaaagcgccg 450 gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggcgc aagcgttatc 500 cggaattatt gggcgtaaag agctcgtagg cggtctgtcg cgtctgctgt 550 gaaatcccga ggctcaacct cgggtctgca gtgggtacgg gcagactaga 600 gtgcggtagg ggagattgga attcctggtg tagcggtgga atgcgcagat 650 atcaggagga acaccgatgg cgaaggcaga tctctgggcc gtaactgacg 700 ctgaggagcg adagggtggg gagcaaacag gcttagatac cctggtagtc 750 caccccgtaa acgttgggaa ctagttgtgg ggtccattcc acggattccg 800 tgacgcagct aacgcattaa gttccccgcc tggggagtac ggccgcaagg 850 ctaaaactca aaggaattga cggggacccg cacaagcggc ggagcatgcg 900 gattaattcg atgcaacgcg aagaacctta ccaaggcttg acatatagag 950 gaaacgtctg gaaacagtcg ccccgcaagg tctctataca ggtggtgcat 1000 ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1050 cgcaaccctc gttctatgtt gccagcacgt aatggtggga actcatggga 1100 tactgccggg gtcaactcgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat 1150gccccUatg tcUgggctt cacgcatgct acaatggccg gtacaaaggg 1200
ctgcaatacc gtgaggtgga gcgaatccca aaaagccggt cccagttcgg 1250
attgaggtct gcaactcgac ctcatgaagt cggagtcgct agtaatcgca 1300
gatcagcaac gctgcggtga atacgttccc gggtcttgta cacaccgccc 1350
gtcaagtcat gaaagtcggt aacacctgaa gccggtggcc caacccttgt 1400
ggagggagcc gtcgaaggtg atcgtatgtc 1430
li
權(quán)利要求
1. 耐輻射微桿菌(Microbacterium radiodurans GIMN1.002)，其特征在于其保藏編號(hào)為CCTCC No.M208212。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐輻射微桿菌(A打cw&a"e〃'ww raWoc^rara GIMN1.002)，其特征在 于該耐輻射微桿菌的16SrDNA序列如SEQIDNO: 1所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的耐輻射微桿菌(M/cra6a"en'ww ra&o^raw GIMN1.002)，其特征在于具有以下的微生物學(xué)特征1) 形態(tài)特征-耐輻射微桿菌在平板上菌落小，表面光滑半透明，邊緣整齊，有光澤；在液體中呈沉 淀性混濁；革蘭氏染色為陽(yáng)性，菌體短桿狀；2) 生理生化特征耐輻射微桿菌的接觸酶試驗(yàn)為弱陽(yáng)性，氧化酶陰性；運(yùn)動(dòng)弱；不能水解淀粉；吲哚 和V-P反應(yīng)為陰性；不利用檸檬酸鹽和丙二酸鹽，不能水解酪氨酸、酪蛋白、尿素；硝 酸鹽還原陽(yáng)性，不產(chǎn)生H2S;在2。/。-7。/。NaCl中能生長(zhǎng)；厭氧環(huán)境下不能生長(zhǎng)；3) 其他特征耐輻射微桿菌甲基萘醌主要類(lèi)型為MK-7，細(xì)胞壁脂肪酸主要類(lèi)型是iso-C15:0、 anteiso-Ci5:o、 iso墨Ci6:o禾口 anteiso-C", o。
4. 權(quán)利要求1 -3任 一 項(xiàng)所述的耐輻射微桿菌(Mkro6a"en'wm ra&o血rara GIMN1.002)在耐紫外輻射中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種耐輻射微桿菌Microbacterium radiodurans GIMN1.002及其應(yīng)用，該菌已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏日期為2008年11月10日，保藏編號(hào)為CCTCC No.M208212。本發(fā)明耐輻射微桿菌耐受紫外輻射的能力，在對(duì)研究其DNA損傷的修復(fù)分子機(jī)理，促進(jìn)新的DNA技術(shù)在環(huán)境保護(hù)、生物修復(fù)、人類(lèi)健康等的發(fā)展有著重要意義。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101481672SQ20091003692
公開(kāi)日2009年7月15日 申請(qǐng)日期2009年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月22日
發(fā)明者青 姚, 維 張, 朱紅惠, 敏 林, 燕 王, 羊宋貞, 袁夢(mèng)龍, 明 陳, 黎志坤 申請(qǐng)人:廣東省微生物研究所