專利名稱：一種富鉻酵母培養(yǎng)物及其發(fā)酵工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物及其微生物發(fā)酵工藝，具體地說是一種富鉻酵母培養(yǎng)物 及其發(fā)酵工藝。
背景技術(shù)：
4各是葡萄糖耐量因子(Glucose Tolerance Factor， GTF)的活性組成部分, 主要通過增強胰島素的作用發(fā)揮生物學功效。鉻(三價)是動物必需的微量元 素。普通飼料原料中鉻含量低；額外添加無機鉻利用率低于1%;腎臟不能對其 進行重吸收，流失迅速，特別在應(yīng)激狀態(tài)下消耗更大。因此，在飼料中提倡使 用有機鉻，有機鉻吸收利用率在10-40%之間。目前使用的有機鉻主要有吡咬羧 酸鉻、甲酸鉻、氨基酸鉻和酵母鉻，其中對肉豬飼養(yǎng)來講酵母鉻的效果最好， 曰糧中的推薦添加量為0.2-0,4卯m (Lindemann et al. ， 2008 )。酵母鉻是將 酵母細胞培養(yǎng)在含三價鉻的培養(yǎng)基中，通過生物轉(zhuǎn)化將無機鉻轉(zhuǎn)變成有機鉻，其 中80%以上鉻結(jié)合入原生質(zhì)，主要結(jié)合形式為鉻-吡啶羧酸-谷胱甘肽
(Cr-dinicotinic acid - glutathione), 也有低分子肽鉻聚合物
(Chromodulin ),肽含有甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、天門冬氨酸。
酵母鉻同胰島素協(xié)同降低血糖，對糖尿病具有緩解作用(Guan et al., 2000 );酵母鉻可抗應(yīng)激，增強動物免疫功能，提高接種疫苗的效價
(Moonise-Shageer andMowat, 1993; Kegley and Spears, 1995; Gatta et al.， 2001);應(yīng)用結(jié)果表明，酵母鉻能夠改善肉豬(Grelaetal.,1997 )、肉雞(咼 于明等1998 )、母豬(Leethongdee et al. , 2000 )、肉鴨(李麗立等2001 )、 奶牛(A1-Saiady et a1.2004 )等動物生產(chǎn)性能。
目前國際上酵母鉻產(chǎn)品工藝，多通過液體發(fā)酵，固體吸附工藝進行生產(chǎn)。 該類工藝存在以下不足①酵母發(fā)酵生成的益生成分有限；②投資額度大；③ 生產(chǎn)成本高，有必要加以進一步改進。
國內(nèi)祠料相關(guān)酵母鉻專利可搜到一例，名稱為奶牛熱應(yīng)激緩解劑及其制 備方法和應(yīng)用(CN1618316),特征在于如何使用酵母^^各，并未涉及發(fā)酵工藝。 目前國內(nèi)還沒有將酵母培養(yǎng)物與鉻轉(zhuǎn)化結(jié)合在一起的專利技術(shù)。
酵母培養(yǎng)物(Yeast culture)工藝不同于常見的活細胞酵母，要在菌體達 到一定數(shù)量后進行破壁，它不含許多活酵母菌，是復雜的發(fā)酵產(chǎn)品，包括酵母 發(fā)酵的代謝產(chǎn)物、變性培養(yǎng)基、酵母細胞壁和酵母內(nèi)容物。人們早就知道利用 酵母細胞的自溶作用來瓦解細胞作為獲取細胞內(nèi)組分的有效手段(Nolf ， 1991), 細胞自溶是由于在一定條件下觸發(fā)了細胞能消化自身結(jié)構(gòu)的自溶酶的分解作用 所致(Chiu等1997 )。在適當溫度下，發(fā)酵一定時間的酵母細胞破壁可以自溶
(潘軍等專利200610150964X)。目前在生產(chǎn)工藝上只有美國Diamond V(達農(nóng) 威)公司稱其酵母培養(yǎng)物產(chǎn)品益康"XP，，采取的是液體-固體兩相發(fā)酵工藝。
本發(fā)明采取的工藝是在液體發(fā)酵的基礎(chǔ)上，引入固體發(fā)酵，采用液體-固體 兩相發(fā)酵方法生產(chǎn)酵母4各。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種能夠?qū)崿F(xiàn)充分富鉻的液體-固體兩相發(fā)酵生產(chǎn)酵母培養(yǎng)物工藝。工藝過程如下(1 )菌種篩選用熱帶假絲酵母或釀酒酵母，經(jīng)過在高濃度三價無機鉻(O. 1%-0. 5%)培養(yǎng)基中的生長表現(xiàn)確定所用菌林； (2 )菌種逐級擴大培養(yǎng)經(jīng)過斜面，搖瓶和種子罐擴大培養(yǎng)； (3 )液體發(fā)酵轉(zhuǎn)化液體培養(yǎng)基中三價無機鉻含量為Q. 05%-0. 4%，優(yōu)選0. 1°/「0, 2%;液體發(fā)酵轉(zhuǎn)化時間為12-48小時，優(yōu)選18-26小時； (4 )液體發(fā)酵液與固體培養(yǎng)基混合液體發(fā)酵結(jié)束后，培養(yǎng)液予固體培養(yǎng)基 按1:3-1.5:1,優(yōu)選1: 1重量比例混合，進入固體發(fā)酵階段。這里所述的固體培 養(yǎng)基是指含有豆粕(餅)、棉粕(餅)、菜粕(餅)、花生粕(餅)、胡麻 粕(餅)、甜菜粕(餅)、麥*夫、稻糠、次粉、木薯粉、大豆皮、玉米酒精糟、 玉米、大米中的一種或多種混合物，優(yōu)選豆粕(餅)、棉粕(餅)、菜粕(餅)、 玉米、麥l夫中的一種或多種混合物；這里所述的固體發(fā)酵是指對固體培養(yǎng)基直接或滅菌處理后，利用堆放、容 器、袋或固體發(fā)酵反應(yīng)器進行的發(fā)酵生產(chǎn)過程，又分為有氧和厭氧發(fā)酵兩個階 段。(5 )固體有氧發(fā)酵有氧發(fā)酵16-36小時，優(yōu)選16-24小時；(6 )固體厭氧發(fā)酵固體有氧發(fā)酵結(jié)束后，對酵母進行破壁，條件是保持40—60°C，固體厭氧發(fā)酵6—24小時，優(yōu)選50。C發(fā)酵6-10小時； (7)成品對固體發(fā)酵產(chǎn)物進行干燥得到成品；這里所述的干燥是指流化床、氣流、滾筒干燥。成品水分低于15%，優(yōu)選低于13%,有機4各0. 05%-G. 3%,氣味芳香。通過固體發(fā)酵微生物在固體培養(yǎng)基繼續(xù)增殖，擴大產(chǎn)品變性培養(yǎng)基、代謝 產(chǎn)物、酵母細胞壁、內(nèi)容物等益生成分比例，鉻得以進一步隨著酵母裂殖均勻 分散，提升產(chǎn)品生物學價值。
具體實施例方式以下通過實施例對本發(fā)明進一步進行說明，但本發(fā)明并不限于這些實施例。 實施例1:1、 菌種選用從廣州市微生物研究所購入的熱帶假絲酵母AS2. 6372、 培養(yǎng)基葡萄糖2 %、蛋白胨1%、酵母膏0.5%、 pH=6. 8、無機4各(來源 于三氯化鉻)0. 2%，培養(yǎng)24h，確認菌種能在上述培養(yǎng)液中保持生長良好。實施例2:1、 菌種同實施例1 。2、 斜面培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件葡萄糖2 %、蛋白胨1%、酵母膏0.5%、瓊脂2%。 pH=6. 8、 105。C滅菌18 分鐘。將試管菌種擴繁至培養(yǎng)皿，放入30。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。實施例3 :1、 菌種同實施例1 。
2、 斜面培養(yǎng)同實施例2 。
3、 搖瓶種子培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件
葡萄糖2 % 、蛋白胨1 % 、酵母膏0. 5 % 。起始pH=6. 8、 105。C滅菌18分鐘。。 將培i皿菌種接入搖瓶，放入30。C恒溫搖床中，200r/min振蕩培養(yǎng)24h。
實施例4 :
1、 菌種同實施例1 。
2、 斜面培養(yǎng)同實施例2 。
3、 搖瓶種子培養(yǎng)同實施例3。
4、 一級種子罐擴繁培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件
豆粕1%、玉米O. 5%、葡萄糖3%、蛋白胨1.5%、酵母膏0.5%、磷酸二氫 鉀0. 1%、硫酸銨0. 2%、氯化鈉0. 05%、消泡劑0. 05%。起始pH=6. 8、 105。C滅菌 18分鐘。搖瓶擴繁菌液按5°/ 接種入罐，培養(yǎng)24h。
實施例5 :
1、 菌種同實施例1 。
2、 斜面培養(yǎng)同實施例2 。
3、 搖瓶種子培養(yǎng)同實施例3。
4、 一級種子罐擴繁培養(yǎng)同實施例4。
5、 二級種子罐加鉻培養(yǎng)
培養(yǎng)基為豆粕1%、玉米O. 5%、葡萄糖3%、蛋白胨l. 5%、酵母膏O. 5%、 磷酸二氫鉀0. 1%、硫酸銨0. 2%、氯化鈉0. 05%、消泡劑0. 05%，無機鉻(來源 于三氯化鉻)O. 1%。起始pH-5. 0、 12rC滅菌30分鐘。再按5°/。接種量接入一級 種子罐，培養(yǎng)35h。
實施例6 :
1、 菌種同實施例1 。
2、 斜面培養(yǎng)同實施例2 。
3、 搖并瓦種子培養(yǎng)同實施例3 。
4、 一級種子罐擴繁培養(yǎng)同實施例4。
5、 二級種子罐加鉻培養(yǎng)同實施例5 。
6、 固體發(fā)酵
對豆粕加熱至85~ 100°C,保持5分鐘滅菌，冷卻至40°C;將二級種子罐 加鉻培養(yǎng)液與滅菌豆粕混合，調(diào)整固體含水量達到43%開始發(fā)酵。對發(fā)酵物料溫 度進行監(jiān)控，使溫度不超45。C;有氧發(fā)酵24h后進入?yún)捬醢l(fā)酵，溫度達到50°C 以上，發(fā)酵6-IO小時破壁，鏡檢破壁情況決定何時結(jié)束進行干燥。
實施例7 :
1、 菌種同實施例1 。
2、 斜面培養(yǎng)同實施例2 。
3、 搖瓶種子培養(yǎng)同實施例3 。
4、 一級種子罐擴繁培養(yǎng)同實施例4 。
5、 二級種子碌加鉻培沐同實施例5 。
56、 固體發(fā)酵破壁同實施例6。7、 產(chǎn)品檢測與效果樣品在高氯酸-硝酸混合酸液中，高溫高壓條件下進行消解，消解液經(jīng)適當 稀釋后，用原子吸收光譜法測定4各含量。 (1 )測定總鉻取0. 2 - 0. 5 g本發(fā)明產(chǎn)品于消化瓶中，加8 ml HC104-HN03 (4 : 1)混合液 于電爐上消化。當溶液變?yōu)闊o色時即可停止消化。冷卻后用超聲振蕩器(150瓦 頻率，20KHZ)處理30min，之后將化液轉(zhuǎn)移到10 ml的容量瓶中，用5. 0%濃度 HN03溶液定容。采用原子吸收法進行測定，測試條件為燈電流1=12 mA,通帶 AA=1, 6 nm，波長入357. 8 nm，燃燒器高度=7. 5 mm,空氣流量=9. 4min,乙炔氣流量 =2.5 L/min。根據(jù)標準曲線即可得出待測樣中的總鉻含量。所測的總鉻含量中 包有機鉻和無機鉻。(2)產(chǎn)品有機鉻和無機鉻的分離測定將0. 2 - 0. 3 g本發(fā)明產(chǎn)品加入盛有9 ml蒸餾水的離心管中，攪拌，靜置12 h， 3500 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min，吸取上清液用原子吸法測定無機鉻含量。將下層 沉淀移出離心管，消化定容，采用原子吸收法測定出有機鉻含量。(3 )有機鉻含量與鉻的轉(zhuǎn)化率有機鉻含量=總鉻含量-無機鉻含量，鉻的轉(zhuǎn) 化率=有機鉻含量/總鉻含量。(4)本發(fā)明產(chǎn)品的主要營養(yǎng)價值指標按上述方法進行測定，有機鉻含量》0.1%;無積^各轉(zhuǎn)化成有機鉻的比例》 85%,六價鉻未檢出；粗蛋白含量10°/。-50%,依據(jù)國家大豆肽粉行業(yè)標準(QB/ T2653 - 2004 )測定的肽轉(zhuǎn)化率(粗蛋白中小肽含量)》8 %;黃曲霉毒素〈30 M g/kg。本發(fā)明的產(chǎn)品與工藝優(yōu)點(1 )本發(fā)明吸取有關(guān)微生物制劑生產(chǎn)方法的優(yōu)點，采用已知的熱帶假絲酵母菌和 釀酒酵母菌為菌種，以葡萄糖、豆粕(餅)、棉粕(餅)、菜粕(餅)、花生粕(餅)、胡麻粕(餅)等為原料，來源廣泛，工藝過程筒單，產(chǎn)品價格低廉。(2) 本發(fā)明采用微生物液體-固體兩相發(fā)酵新工藝，通過大劑量接種，能夠解決 固體發(fā)酵過程中，發(fā)酵周期長，容易污染等問題，生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。(3) 微生物在固體培養(yǎng)基繼續(xù)增殖，鉻進一步均勻*。(4) 本發(fā)明采用微生物液體-固體兩相發(fā)酵新工藝，不僅完成了無機鉻轉(zhuǎn)化為有 機鉻過程，還通過破壁工藝，產(chǎn)生大量酵母培養(yǎng)物成分，具有益生飼料的特點。(5) 本發(fā)明生產(chǎn)出的富鉻酵母培養(yǎng)物兼有有機鉻與益生飼料的雙重作用，用于畜 禽水產(chǎn)祠料，可以提高動物抗應(yīng)激能力，提高母畜繁殖性能，改善肉品質(zhì)。
權(quán)利要求
1、一種富鉻酵母培養(yǎng)物的發(fā)酵工藝，其特征在于一種酵母培養(yǎng)物，富含0.05％-0.3％的有機鉻。
2、 其制備方法，如權(quán)利要求l所述，其特征在于 一種富鉻酵母培養(yǎng)物的發(fā) 酵工藝，按照以下步驟進行(1 )菌種篩選用熱帶假絲酵母或釀酒酵母，在無機鉻(0.1%-0.5%)培養(yǎng) 基中培養(yǎng)、確定所用菌林，這里所述的無機鉻其特征為三價鉻；(2 )菌種逐級擴大培養(yǎng)經(jīng)過斜面，搖瓶種子和種子罐擴大培養(yǎng)；(3 )液體發(fā)酵液體培養(yǎng)基中無機鉻含量為0.05%-0.4%,液體發(fā)酵轉(zhuǎn)化時間 為12 - 48小時，這里所述的無機鉻其特征為三價鉻；(4 )固體發(fā)酵液體發(fā)酵結(jié)束后，培養(yǎng)液予固體培養(yǎng)基按1:3-1.5:1重量比 例混合，ii^固體發(fā)酵階段。這里所述的固體培養(yǎng)基其特征在于含有豆粕(餅)、 棉粕(餅)、菜粕(餅)、花生粕(餅)、胡麻粕(餅)、甜菜粕(餅)、麥 麩、稻糠、次粉、木薯粉、大豆皮、玉米酒精糟、玉米、大米中的一種或多種 混合物。這里所述的固體發(fā)酵是指利用堆放、容器、袋或固體發(fā)酵反應(yīng)器進行 的生產(chǎn)過程，又分為有氧和厭氧發(fā)酵兩個階段；(5 )固體中的有氧發(fā)酵階段有氧發(fā)酵16-36小時；(6 )固體中的厭氧發(fā)酵階段固體有氧發(fā)酵結(jié)束后，對酵母進行破壁，條件 是保持40—6(TC，固體厭氧發(fā)酵6—24小時；(7)干燥將破壁后的固體發(fā)酵產(chǎn)物干燥到水分15%以下，得到成品。
3、 權(quán)利要求2所述的富鉻酵母培養(yǎng)物的發(fā)酵工藝其特征在于培養(yǎng)基中無 機鉻含量為0. 1%;液體發(fā)酵轉(zhuǎn)化時間為18小時；培養(yǎng)液按1: 1重量比例同固體 培養(yǎng)基混合；固體培養(yǎng)基其特征在于含有豆粕(餅)、棉粕(餅)、菜粕(餅)、 玉米、麥麩中的一種或多種混合物；固體有氧發(fā)酵24小時；固體厭氧發(fā)酵50 。C， IO小時；成品干燥到水分13%以下。
4、 權(quán)利要求1所述的富鉻酵母培養(yǎng)物，兼有有機鉻與益生銅料的雙重作用， 可用于畜禽水產(chǎn)飼料。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物及其微生物發(fā)酵工藝，具體地說是一種富鉻酵母培養(yǎng)物及其發(fā)酵工藝。其特征在于選用并篩選耐受高鉻的熱帶假絲酵母菌和釀酒酵母菌，通過液體-固體兩相發(fā)酵工藝進行生產(chǎn)。工藝流程包括耐受高鉻(三價)菌種篩選；菌種逐級擴大培養(yǎng)；液體發(fā)酵轉(zhuǎn)化無機鉻，其中培養(yǎng)基中無機鉻含量為0.05％-0.4％，優(yōu)選0.1％-0.2％，發(fā)酵轉(zhuǎn)化時間為12-48小時，優(yōu)選18-26小時；液體發(fā)酵結(jié)束后，培養(yǎng)液予固體培養(yǎng)基按1∶3-1.5∶1，優(yōu)選1∶1重量比例混合，進行固體有氧發(fā)酵16-36小時，優(yōu)選16-24小時；固體有氧發(fā)酵結(jié)束后，進入固體厭氧發(fā)酵，對酵母進行破壁，條件是保持40-60℃，發(fā)酵6-24小時，優(yōu)選50℃發(fā)酵6-10小時。干燥后的成品含有有機鉻0.05％-0.3％。利用本發(fā)明技術(shù)無機鉻轉(zhuǎn)化成有機鉻的比例在85％以上，六價鉻未檢出。本發(fā)明具有工藝簡單、生產(chǎn)成本低、產(chǎn)品質(zhì)量好等特點，生產(chǎn)出的富鉻酵母培養(yǎng)物兼有有機鉻與益生飼料的雙重作用，可用于畜禽水產(chǎn)飼料。
文檔編號C12N1/16GK101575617SQ20091003761
公開日2009年11月11日 申請日期2009年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月6日
發(fā)明者娜 劉, 張偉強, 軍 潘, 薛德林 申請人:廣州市博善生物飼料有限公司