專利名稱：乙肝L基因和結(jié)核Ag85B融合基因及其表達載體的構(gòu)建與應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物工程技術(shù)領域，特別涉及一種乙肝病毒全包膜L基 因與結(jié)核桿菌Ag85B的融合抗原基因及其載體的構(gòu)建和表達方法。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(H印atitis B virus ， HBV)和結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis ， MTB)感染所致傳染性疾病是嚴重危害我 國乃至全人類健康和生命安全的重大公共衛(wèi)生問題。疫苗接種是預防和控制 乙肝與結(jié)核發(fā)生和流行的重要手段。目前，乙肝基因工程零組疫苗和卡介苗 在預防乙肝和結(jié)核方面取得了巨大的成就，但各自還存在一些不足。如基因 工程重組乙肝疫苗需多次接種，且部分人群接種后出現(xiàn)免疫不應答或低應 答，且該疫苗僅有預防目的，無治療作用。卡介苗在不同地區(qū)不同人群中存 在著差異，免疫保護效果不穩(wěn)定(保護率為0_80%之間)，，由于MTB耐藥菌
株的出現(xiàn)以及艾滋病的合并感染以及世界人口流動的增加等等問題，使得 MTB近年來有死灰復燃的趨勢。因而，研究效果更好的乙肝疫苗和結(jié)核疫苗 勢在必行。
DNA疫苗是近年興起的新型疫苗，具有亞單位疫苗或滅活疫苗的安全性， 同時具有減毒疫苗或重組疫苗才具有的誘導保護性細胞免疫應答的特點。 DNA疫苗構(gòu)建方便、制備工藝簡單、化學性質(zhì)穩(wěn)定、保存運輸方便、價格低 廉、可用于構(gòu)建多價疫苗及預防不同亞型的病毒感染。
疫苗種類和數(shù)量的增多，在預防多種傳染病的同時，也伴隨著一系列問 題的產(chǎn)生，如兒童預防接種次數(shù)增加、疫苗管理難度加大、預防接種工作成 本增高等。因此，當前聯(lián)合疫苗已經(jīng)成為疫苗研發(fā)、生產(chǎn)和使用的一大趨勢。 因為聯(lián)合疫苗可以減少頻繁的注射次數(shù)和漏種的機會，提高及時接種率和接 種者的依從性，節(jié)省接種管理成本和受種者的時間成本。因此，在實施計劃 免疫時，采用多價疫苗進行聯(lián)合免疫受到了世界各國的重視。目前世界各國 的科學工作者都在致力研制新型的乙肝與結(jié)核聯(lián)合疫苗。但是，各種聯(lián)合疫苗在穩(wěn)定性、劑型、處方的設計和生產(chǎn)成本上都還存在一些問題，有待改進， 致使乙肝與結(jié)核聯(lián)合疫苗至今仍未在全世界廣泛應用。生物工程技術(shù)的進展 為重組疫苗提供了新的途徑，以DNA疫苗為基礎的聯(lián)合疫苗被寄予厚望。
HBV基因組是一部分雙鏈DNA分子，由約3200個堿基對組成，HBV基因組 的全部順序均為蛋白編碼區(qū)，由相互重疊的4個基因S、 C、 P和X基因組成， 分別編碼外膜蛋白(HBsAg)、核心蛋白(HBcAg)、聚合酶和X蛋白。本研究中 選擇的乙肝抗原基因為可以表達乙肝包膜大蛋白(L蛋白)的s區(qū)全基因，即 可表達PreSl、 PreS2和S抗原三種抗原成分。目前市售的HBsAg啤酒酵母疫 苗是僅由S蛋白組成的疫苗，雖然已顯示了較好的免疫保護作用，但是許多 實驗結(jié)果表明preSl、 preS2區(qū)所擁有的B和T細胞表位具有很高的免疫原性， 可以增強對S蛋白的免疫反應，克服對S蛋白的無反應性在疫苗中加入PreSl 和PreS2后，可降低人群對乙肝疫苗的不反應和低反應性。因此，選擇了乙 肝包膜大蛋白L基因，作為乙肝的優(yōu)勢抗原基因與結(jié)核基因聯(lián)合。Ag85B是結(jié) 核分支桿菌和BCG的分泌性蛋白，是結(jié)核菌主要的保護性抗原，含有9個免疫 優(yōu)勢表位，具有體外激活T細胞并能刺激記憶T細胞產(chǎn)生的能力。因此選擇將 乙肝包膜大蛋白基因和結(jié)核優(yōu)勢抗原Ag85基因融合構(gòu)建新型的DNA疫苗，將 有利于乙肝和結(jié)核的防治。本研究所選用的pVAXl真核表達載體是由 pcDNA3. l改造而來的，全長3.0 kb，是美國FDA認可的安全性較高并且可以 用于人體研究的基因疫苗表達載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目在于克服現(xiàn)有疫苗的缺點，提供一種乙肝病毒全包膜L (HBVL)基因和結(jié)核桿菌Ag85B (鵬T-Ag85B)基因的融合基因。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種包含上述融合基因的真核表達載體的 構(gòu)建和表達方法。
本發(fā)明的再一目的在于提供一種上述融合基因的真核表達載體的應用。 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn) 一種乙肝病毒全包膜L基因和結(jié)
核桿菌Ag85B基因的融合基因，其序列如SEQ ID NO. l所述。
一種包含了上述乙肝病毒全包膜L基因和結(jié)核桿菌Ag85B基因的融合基
因的真核表達載體的構(gòu)建和表達方法，包括以下步驟 (1)引物設計
根據(jù)乙肝病毒全包膜L基因的編碼序列，設計擴增乙肝病毒全包膜L基
5因的l對引物
上游引物序列為PI 5' -CAGCTAGCATAATGGGAGGTTGGTCT -3'含Nhel 酶切位點和起始密碼子ATG;
下游引物序列為P2 5' -GGCGGAAGCTTAATGTATACCCAAAGAC -3';含 Hind in酶切位點，并刪除終止密碼子；
根據(jù)人結(jié)核分支桿菌H37Rv株Ag85B基因的編碼序列，設計擴增結(jié)核桿 菌Ag85B基因的l對引物
上游引物序列為P3 5' - TTATAAGCTTGGATCCGGAGGTTCATTCTCCCGGCCG GGGCTG -3';含HindIII(AAGCTT)酶切位點和含GGATCCGGAGGTTCA的Linker 序列；
下游引物序列為P4 5, -AATGGTACCTCAGCCGGCGCCTAACGAAC -3';含 Kpn I酶切位點和終止密碼子；
(2) 重組質(zhì)粒pVL的構(gòu)建 將乙肝表面抗原陽性患者血清采用苯酚/氯仿抽提法獲得DNA提取液，作
為L基因擴增模板，用歩驟(1)設計的引物P1和P2進行常規(guī)鏈式聚合酶反應， 擴增出乙肝病毒全包膜L基因片段，將純化后的乙肝病毒全包膜L基因片段和 質(zhì)粒pVAXl分別用Nhel和HindlII進行雙酶切，純化、連接、轉(zhuǎn)化獲得重組質(zhì) 粒pVAX-L;
(3) 重組質(zhì)粒pVLA的構(gòu)建
提取人結(jié)核分支桿菌H37Rv基因組DNA作為模板，用步驟(1)設計的 引物P3和P4進行常規(guī)鏈式聚合酶反應，擴增獲得結(jié)核桿菌Ag85B基因；將 純化的結(jié)核桿菌Ag85B基因與步驟(2)所得重組質(zhì)粒pVL分別用HindIII 和Kpn I雙酶切，純化、連接、轉(zhuǎn)化獲得重組質(zhì)粒pVLA;
(4) 重組質(zhì)粒pVLA轉(zhuǎn)染真核細胞及體外表達鑒定 將酶切和測序鑒定正確的步驟(3)所得重組質(zhì)粒pVLA轉(zhuǎn)染HEK293細
胞，并通過免疫組織化學法和免疫印記法檢測融合基因的表達蛋白質(zhì)。
步驟(2)所述常規(guī)鏈式聚合酶反應具體步驟如下將混合液在94"C預 變性5min，然后進入下列循環(huán)94°C、 45s，55。C、 45s， 72°C、 lmin，共進 行30個循環(huán)，最后72。C延伸10min，擴增完畢后置4'C終止反應；所述混合 液組成如下
濃度為1Oumo1/1的上游引物Pl 1 lU
濃度為10umol/l的下游引物P2 1 P 1dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP的濃度
各為2. 5 mM的dNTP混合物 4 u 1
DNA提取液 5 " 1
含Mf的Ex耐熱性DNA聚合酶反應緩沖液 5 u 1
Ex耐熱性DNA聚合酶 0. 25 u 1 滅菌水 33.75ul
步驟(3)所述常規(guī)鏈式聚合酶反應具體步驟如下將混合液在94'C預 變性5min，然后進入下列循環(huán)94°C、 45s，52。C、 45s， 72°C、 1 min,共進 行30個循環(huán)，最后72。C延伸10min，擴增完畢后置4。C終止反應；所述混合
液組成如下
濃度為1Oumo1/1的上游引物P3 1 u 1
濃度為1Oumo1/1的下游引物P4 1 u 1 dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP的濃度
各為2. 5 mM的dNTP混合物 4 u 1
H37Rv基因組DNA 4ul
含Mg2+的Ex耐熱性DNA聚合酶反應緩沖液 5 p 1
Ex耐熱性DNA聚合酶 0. 25 u 1
滅菌水 34. 75 u 1
上述方法構(gòu)建的真核表達載體作為制備乙肝和結(jié)核聯(lián)合疫苗的用途。
上述方法表達的融合基因的表達蛋白質(zhì)作為制備乙肝和結(jié)核聯(lián)合疫苗 的用途。
本發(fā)明的原理是本發(fā)明中將乙肝病毒全包膜L基因與結(jié)核桿菌Ag85B基 因聯(lián)合表達于pVAXl載體，重組質(zhì)粒pVLA轉(zhuǎn)染細胞并通過免疫組織化學法和 West blot檢測融合蛋白L-Ag85B的表達，從而為研究乙肝和結(jié)核的聯(lián)合DNA 疫苗奠定基礎。載體pVAXl是美國FDA認可的安全性較高并且可以用于人體研 究的基因疫苗表達載體，可以攜帶乙肝病毒L與結(jié)核桿菌Ag85B基因轉(zhuǎn)染到細 胞中，表達出含有乙肝病毒L與結(jié)核桿菌Ag85B基因的融合蛋白。
基因L禾口 Ag85B在NCBI中的登陸號為GI: 157091234和GI :6469794。 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及有益效果(l)本發(fā)明將乙 肝病毒L與結(jié)核桿菌Ag85B兩種抗原同時克隆到同一載體上，構(gòu)建乙肝病毒L 與結(jié)核桿菌Ag85B的融合質(zhì)粒，以期為制備乙肝和結(jié)核的聯(lián)合疫苗奠定基礎，有利于乙肝和結(jié)核的聯(lián)合防治；(2)本發(fā)明利用的pVAXl載體是美國FDA認 可的安全性較高并且可以用于人體研究的基因疫苗表達載體，為后續(xù)的動物 實驗及臨床實驗奠定基礎。


圖1為重組質(zhì)粒pVL構(gòu)建示意圖。 圖2為重組質(zhì)粒pVLA構(gòu)建示意圖。 圖3為重組質(zhì)粒pVLA蛋白表達鑒定圖。 圖4為重組質(zhì)粒pVL示意圖。 圖5為重組質(zhì)粒pVLA示意圖。
圖6為PCR擴增HBV-L基因片段瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為1KbDNA Ladder Maker; Linel、 2為麗-L片段，1. 2Kb。
圖7為菌落PCR鑒定重組質(zhì)粒pVL圖，其中1為以DNA提取液為模板 的PCR結(jié)果；2-6為以轉(zhuǎn)化的單菌落為模板的PCR結(jié)果。
圖8為pVL重組質(zhì)粒雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為1Kb DNA Ladder Maker; 1、 2為pVL的Nhel和Hindi 11雙酶切產(chǎn)物；3為pVL的 HindIII單酶切產(chǎn)物4: pVAXl的HindIII單酶切產(chǎn)物。
圖9為PCR擴增MBT-Ag85B基因片段瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為150bp DNA Ladder Maker; 1、 2為Ag85B， 860bp。
圖10為菌落PCR鑒定重組質(zhì)粒pVLA基因片段圖，其中1為以 pcDNA3-Ag85B為模板的PCR擴增的Ag85B; 2-6:菌落PCR。
圖11為pVLA重組質(zhì)粒雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為1KB DNA Ladder Maker; 1、 2為pVLA的HindIII和Kpnl雙酶切產(chǎn)物。
圖12為pVLA重組質(zhì)粒三酶切瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為1KB DNA Ladder Maker; 1: pVLA的Nhel、 HindIII和Kpnl的三酶切產(chǎn)物。
圖13為重組質(zhì)粒大小比較鑒定圖，其中M為1KB DNA Ladder Maker; l為pVAXl; 2為PVAX-L; 3為pVLA。
圖14為免疫組織化學檢測融合蛋白在HEK293細胞中的表達圖，其中 圖a為轉(zhuǎn)染pVLA質(zhì)粒的HEK293細胞呈染色棕黃色陽性(200X);圖b為轉(zhuǎn) 染pVAXl質(zhì)粒的HEK293細胞呈染色呈陰性(200X )。圖15為重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細胞后的蛋白印跡分析圖，其中M為蛋白
markers; 1、 2為樣品為轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pVLA的293細胞的裂解液上清；3、 4為樣品為293細胞的裂解液上清。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施 方式不限于此。
首先對實驗材料的說明如下
質(zhì)粒pVAXl:美國FDA批準可用于人體的DNA疫苗載體，購自Invitrogen 公司；MTB H37Rv購自中科院微生物菌種保藏中心；乙肝表面抗原陽性患者
血清由廣州華僑醫(yī)院提供。
大腸桿菌E. coli T0P10購自天津天有利科技有限公司。
細胞株HEK293細胞((人胚腎上皮細胞)購自上海桑戈生物科技有限公司。
試劑酶類(大連寶生物公司)；試劑盒(質(zhì)粒DNA小提試劑盒，細菌 基因組DNA抽提試劑盒，Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒，凝膠DNA 純化回收試劑盒，OMEGA去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒)(OMEGA); PCR引物合成 (上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司)；重組質(zhì)粒上目的基因的序列測定 (上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司)；鼠源性抗HBsAg單克隆抗體(北 京博奧森生物技術(shù)有限公司)即用型SABC試劑盒和DAB顯色試劑盒(武漢 博士德生物工程有限公司)
酵母提取物、胰蛋白胨、瓊脂糖粉(上海生物工程有限公司)；瓊脂糖(美 國Sigma公司)；DMS0、青霉素鈉、硫酸鏈霉素、胰蛋白酶、H印es堿(廣州 博理生物科技有限公司)；氨芐青霉素(北京鼎國生物技術(shù)有限公司)；DMEM 培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)； 6孔細胞培養(yǎng)、1.8ml凍存管板、0.22um—次性濾器(廣州普博公司)。
實施例1: 1、引物設計
根據(jù)乙型肝炎病毒全包膜L基因的編碼序列，設計擴增HBVL的1對引
物
上游引物序列為:PI 5' —CAGCTAGCATAATGGGAGGTTGGTCT -3'含Nhel(GCTAGC)酶切位點和起始密碼子ATG;
下游引物序列為P2 5' -GGCGGAAGCTTAATGTATACCCAAAGAC -3';含 Hind III (AAGCTT)酶切位點，并刪除終止密碼子；
根據(jù)人結(jié)核分支桿菌H37Rv株Ag85B基因的編碼序列，設計擴增結(jié)核桿 菌Ag85B基因的l對引物
上游引物序列為P3 5' - TTATAAGCTTGGATCCGGAGGTTCATTCTCCCGGCCG GGGCTG -3';含HindIII(AAGCTT)酶切位點和含GGATCCGGAGGTTCA的Linker 序列；
下游引物序列為P4 5' -AATGGTACCTCAGCCGGCGCCTAACGAAC -3';含 Kpn I (GGTACC)酶切位點和終止密碼子；
2、重組質(zhì)粒pVL的構(gòu)建如圖1和圖4所示 (1) PCR法獲得HBV L基因
L基因擴增模板取自乙肝表面抗原陽性患者血清。血清抽提采用苯酚/氯 仿抽提法。乙肝病毒DNA的提取采集靜脈血，將100UL血清與蛋白酶K(PK) 緩沖液1UL混勻，加人10ULpK(20mg/mL)， 55。C過夜。與250UL飽和酚/氯仿 (l:l)混勻，10000轉(zhuǎn)/min4。C離心5MIN， 500UL冰乙醇沉淀15MIN， 12000轉(zhuǎn) /min離心15MIN， 20UL TE緩沖液(10 mmol /L三羥甲基氨基甲垸鹽酸鹽 (pH8.0) ，1腿ol /L乙二胺四乙酸二鈉)溶解DNA后，一20。C保存?zhèn)溆谩?以上述方法所得DNA提取液作為模板，用步驟(1)設計的引物P l和 P2進行常規(guī)鏈式聚合酶反應，擴增獲得HBVL基因；擴增的PCR產(chǎn)物大小約 為1. 2Kb。
具體步驟如下將混合液在94'C預變性5 min，然后進入下列循環(huán)94 。C變性45s， 55。C退火45s， 72。C延伸1 min，共進行30個循環(huán)，最后72°C 再延伸10min，擴增完畢后置4'C終止反應；所述混合液組成如下
濃度為1Oumo1/1的上游引物Pl 1 y 1
濃度為lOumol/1的下游引物P2 1 u 1 dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP的濃度
各為2. 5 mM的dNTP混合物 4 u 1
DNA提取液 5 u 1
Ex耐熱性DNA聚合酶反應緩沖液(含Mg2+) 5 u 1
Ex耐熱性DNA聚合酶 0. 25 u 1
滅菌水 33. 75 y 1
10PCR產(chǎn)物上樣電泳(質(zhì)量百分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳)，回收1.2KB 的目的條帶，如圖6所示
用OMEGA凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物
(2) 將HBVL基因插入到pVAXl中
將純化后的PCR產(chǎn)物和pVAXl質(zhì)粒用Nhe I和Hind III進行雙酶切處 理，具體反應體系如下PCR產(chǎn)物酶切體系10XM buffer 2yl ， Nhe I lul， Hind III lul， PCR產(chǎn)物6ul ，滅菌水lOul。載體pVAXl酶切 體系10XM buffer 2 u 1 ， Nhe I lul， Hind III lul， pVAX110ul， 滅菌水6ul.。反應體系旋渦振蕩混勻后置于PCR儀中，37t:反應5小時。
用OMEGA凝膠回收試劑盒純化酶切產(chǎn)物，酶切并純化后的PCR片段HBV-L 與載體pVAXl質(zhì)粒利用T4 DNA連接酶進行連接反應。體系配好混勻后16°C 過夜，連接產(chǎn)物4t:保存，在24h內(nèi)進行轉(zhuǎn)化。連接反應體系如下lOXLigase buffer 2ul， T4 DNA Ligase ;U 1， PCR片段5yl，載體片段10iU， 滅菌水3 u 1 。
(3) 轉(zhuǎn)化
將上述連接反應產(chǎn)物以CaC12法轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌TOPIO中連 接產(chǎn)物5u 1與lOOix 1 T0P10感受態(tài)細菌混勻，冰浴30分鐘，42°C熱休 克90秒，迅速置冰中1-2分鐘，加入LB培養(yǎng)基800 u 1置干燥恒溫搖床中 200 rpm 37'C振搖45分鐘，使細菌復蘇并表達質(zhì)粒編碼的抗性基因。加于 含有卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基平板上，室溫放置20分鐘，將培養(yǎng)皿倒置于 37"C培養(yǎng)箱中過夜。
(4) 篩選鑒定陽性克隆
16小時左右長出菌落。從平板中挑出單菌落于4ml含Kana 50 u g/mL 的LB培養(yǎng)基中，置37'C200rpm的恒溫搖床中劇烈振搖6h，待抗性E. coli 生長并達到一定濃度后，取出lOOyl菌液于0.5ml EP管中，置沸水中煮 5min。冷卻后取出1 u 1用作菌落PCR的模板。菌落PCR鑒定，如圖7所示 將菌落PCR陽性的菌落擴增，提取質(zhì)粒，進行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物用質(zhì)量 分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，如圖8所示。
2、重組質(zhì)粒pVLA的構(gòu)建(如圖2和圖5所示) (1) PCR法獲得MTB-Ag85B基因
MTB H37Rv基因組DNA的提取與純化將MTB H37Rv接種于改良羅氏培 養(yǎng)基，器皿口加橡皮塞于37。C培養(yǎng)，每周觀察1次。結(jié)核分枝桿菌生長緩慢， 一般需2 4周長成肉眼可見的菌落。培養(yǎng)2-4周后，刮取少量細菌 于生理鹽水中磨菌，用OMEGA細菌基因組DNA抽提試劑盒提取純化基因組 腿。
以上述方法提取的基因組DNA為模板，用引物P3和P4進行常規(guī)鏈式聚 合酶反應，擴增Ag85B基因，擴增的PCR產(chǎn)物大小約為860bp。
具體步驟如下將混合液在94。C預變性5 min，然后進入下列循環(huán)94 。C變性45s， 52。C退火45 s， 72°〇延伸1 min，共進行30個循環(huán)，最后72 'C再延伸10min，擴增完畢后置4"C終止反應；所述混合液組成如下
濃度為10umo1/1的上游引物P3 1 ii 1
濃度為10umo1/1的下游引物P4 1 U 1 dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP的濃度
各為2. 5 mM的dNTP混合物 4 u 1
H37Rv基因組DNA 4ul
Ex耐熱性DNA聚合酶反應緩沖液(含Mg2+) 5 P 1
Ex耐熱性DNA聚合酶 0. 25 " 1
滅菌水 34. 75 u 1
PCR產(chǎn)物上樣電泳(質(zhì)量分數(shù)為1%瓊脂糖凝膠電泳)，回收860bp的目 的條帶，如圖9所示。
用OMEGA凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物。 (2)將Ag85B插入到PVAX-L
將純化后的PCR產(chǎn)物Ag85B和重組質(zhì)粒pVL用Hind III和Kpn I進行 雙酶切處理，具體反應體系如下PCR產(chǎn)物酶切體系lOXMbuffer 2ul， Kpnllul， Hind III lul， PCR產(chǎn)物6 u 1 ，滅菌水lOiU。載體Pvax-L 酶切體系lOXMbuffer 2ul， Kpn I 1， Hind III lul， pVL10 u 1 ， 滅菌水6ul 。反應體系旋渦振蕩混勻后置于PCR儀中，37"C反應5小時。
用OMEGA凝膠回收試劑盒純化酶切產(chǎn)物，酶切并純化后的PCR片段Ag85B 與載體Pvax-L質(zhì)粒利用T4 DNA連接酶進行連接反應。體系配好混勻后16 "C過夜，連接產(chǎn)物4t:保存，盡量24h內(nèi)進行轉(zhuǎn)化。連接反應體系如下10 XLigase buffer 2ul， T4 DNA Ligase lul， PCR片段5ul，載體片段 10u 1，滅菌水3u 1 。 (3)轉(zhuǎn)化將上述連接反應產(chǎn)物以CaC12法轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌T0P10中連接 產(chǎn)物5u 1與100y 1 T0P10感受態(tài)細菌混勻，冰浴30分鐘，42°C熱休克 90秒，迅速置冰中1-2分鐘，加入LB培養(yǎng)基800 ii 1置干燥恒溫搖床中200 rpm 37'C振搖45分鐘，使細菌復蘇并表達質(zhì)粒編碼的抗性基因。加于含有 卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基平板上，室溫放置20分鐘，將培養(yǎng)皿倒置于37 'C培養(yǎng)箱中過夜。
(4)篩選鑒定陽性克隆
16小時左右長出菌落。從平板中挑出單菌落于4ml含Kana 50 u g/mL 的LB培養(yǎng)基中，置37'C200rpm的恒溫搖床中劇烈振搖6h，待抗性E. coli 生長并達到一定濃度后，取出100ul菌液于0. 5ml EP管中，置沸水中煮 5min。冷卻后取出1 u 1用作菌落PCR的模板。菌落PCR鑒定，如圖10所示將 菌落PCR陽性的菌落擴增，提取質(zhì)粒，使用Hind III和Kpn I雙酶切，Nhel、 Hind III和Kpn I三酶切鑒定，如圖11和圖12所示。 (5)重組質(zhì)粒序列分析
經(jīng)初步鑒定正確的重組質(zhì)粒pVLA，還需要通過測序驗證插入基因序列的 正確性，從插入片段的上游開始延順時針方向采用雙脫氧鏈末端終止法進行 單向測序，引物序列為pVAXl載體的通用引物，引物設計合成及測序工作由 上海生物技術(shù)工程公司完成。
3.重組質(zhì)粒pVLA轉(zhuǎn)染真核細胞及體外表達鑒定
(1) HEK293細胞的培養(yǎng)
(2) 重組質(zhì)粒pVLA轉(zhuǎn)染293細胞
1) HEK293細胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)染前1 d，將處于對數(shù)生長期的細胞用質(zhì)量體 積比為0. 25%的胰酶消化，制備成單細胞懸液，以每孔lX10Vml接種6孔 培養(yǎng)板，每孔加含體積百分比為20。/。的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基2ml，在37 °C、體積百分比為5%的C02的飽和濕度培養(yǎng)箱中，細胞生長至面積百分比為 50% 60%。
2) 脂質(zhì)體/DNA復合物制備A液為4 u g去內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒pVLA稀釋 于無血清OPTi-MEM培養(yǎng)基500" 1， B液為Lipofacta mine 2000 10u 1稀 釋于OPTi-MEM培養(yǎng)基500 u 1，輕輕混合AB液成脂質(zhì)體/DNA復合物，室溫 放置20 min。
3) 轉(zhuǎn)染準備用2 ml無血清躍EM培養(yǎng)基漂洗3次。4)轉(zhuǎn)染:將脂質(zhì)體/DNA復合物緩緩加入6孔培養(yǎng)板中，搖勻，37'C體積 百分比為5%的C02細胞培養(yǎng)箱中放置4 h，加入體積百分比的20%胎牛血清 的DMEM培養(yǎng)基，并置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
(3 )免疫組化檢測融合蛋白在細胞中的表達
轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA48h后，吸出培養(yǎng)基，每孔細胞加入300ul質(zhì)量體積比 濃度為4%的多聚甲醛，4"固定過夜或37。C固定半小時，用磷酸鹽緩沖液 (PBS)洗三次，每次5min。加過氧化物阻斷溶液(質(zhì)量體積比為3%的H202) 孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS洗三次，每次5min;再 加稀釋后的一抗，4。C濕盒過夜;PBS沖洗三次，各5min。加生物素標記的第 二抗體，室溫孵育10min， PBS沖洗三次，各5min。加鏈親和素一過氧化酶 溶液，室溫孵育10min。 二氨基聯(lián)苯胺溶液(DAB)顯色，水洗終止，光鏡下 觀察染色結(jié)果并拍照，如圖14所示。
(4 )免疫印記檢測融合蛋白的表達 1)細胞的裂解
PBS預冷，冰上配細胞裂解緩沖液，倒掉培養(yǎng)基，將培養(yǎng)細胞在冰上用 冰冷的PBS洗3次，甩凈。加0. 7ml細胞裂解緩沖液(含有50mmol/L三羥 甲基氨基甲烷鹽酸鹽(pH8. 0)， 150醒ol/L氯化鈉，0.02%疊氮鈉，0. 1%十二 烷基磺酸鈉，100ug/ml異丙醇溶液，lug/ml抑肽酶，1%乙基苯基聚乙二醇， 0.5%去氧膽酸鈉)，冰上放置20min隔一段時間搖一搖培養(yǎng)瓶。用細胞刮子 將貼壁細胞刮離，移至1. 5ml離心管中。12000xg離心5 min。取上清，-80 'C保存。
2 )蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳
采用SDS-PAGE電泳，底層分離膠為8% (體積百分比)、上部積層膠為 5% (體積百分比)；待測蛋白樣品與2XSDS加樣緩沖液按等體積混勻，100 。C加熱3-5min。上樣，室溫下1 XSDS電泳緩沖液中，開始電壓為130V，進 入分離膠后該為170V電泳至染料抵達分離膠底部，約lh(雙面兩個完全相同 的SDS-PAGE電泳)。
電泳完畢取下凝膠，在5倍體積的固定液中室溫緩慢搖動2h， 5倍體 積的考馬斯亮藍染色液浸泡、室溫緩慢搖動4h。 50ml固定液沖洗、脫色液 再緩慢搖動至獲得藍色條帶及干凈的背景，期間換液3-4次。將脫色后的凝 膠照像。
3)蛋白印跡》去(Western blotting)電泳后的另一凝膠置轉(zhuǎn)移緩沖液中室溫平衡30min。依次組裝轉(zhuǎn)印夾層 海綿墊層、濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜(NC膜)、濾紙、海綿墊層(NC膜和 濾紙均與凝膠等大，并預先以轉(zhuǎn)移緩沖液濕潤)。排出所有氣泡。前后端用 多孔有機玻璃板扣緊，在轉(zhuǎn)移緩沖液中冷卻條件下恒流350mA，電轉(zhuǎn)50min。 轉(zhuǎn)印結(jié)束，取出轉(zhuǎn)印膜，膜上標記定位。凝膠用考馬斯亮藍染色以確定轉(zhuǎn)移 效率。轉(zhuǎn)印膜置于平皿中，加lxPBST緩沖液，在水平搖床上緩慢搖動lh; 將NC膜浸入質(zhì)量體積比為5%的脫脂奶粉中，37"C于水平搖床緩和振蕩lh; lxPBST洗膜3次，每次10min;將NC膜封于雜交袋中，用Mouse Anti- HBsAg 單克隆抗體按照l: 400的稀釋倍數(shù)用lxPBS稀釋，雜交袋中加入相應的一 抗稀釋液5ml，排盡袋中氣體，封口，水平搖床振蕩，4"C反應過夜；將NC 膜從雜交袋中小心取出，lxPBST (將20mL滅菌磷酸鹽緩沖液中加入10 y L 0. 05 %吐溫20)洗膜3次，每次1 Omin。再將NC膜封于雜交袋中，用 辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG 二抗血清按照1: 5000的稀釋倍數(shù)用 lxPBS稀釋，雜交袋中加入相應的二抗稀釋液5ml，排盡袋中氣體，封口， 37。C水平搖床振蕩2-3h;取出NC膜，lxPBST洗膜3次，每次10min，用ECL 試劑盒以發(fā)光法顯色，顯影1 min，曝光5min，如圖15所示。
上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上 述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改 變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的 保護范圍序列表
〈110〉 李君武
〈120〉乙肝L基因與結(jié)核桿菌Ag85B融合基因及其表達載體的構(gòu)建和應用
〈130〉 2
〈160〉 5
<170> Patentln version 3. 5
〈210〉 1
〈211〉 2093
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 1
gctagcgtaatgggaggttggtcttccaaacctcgacaaggcatggggacaaatctttct60
gttcccaatcctctgggattctttcccgatcaccagttggaccctgcgttcggagccaat120
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gtatacattaagcttggatccggaggttcattctcccggccggggctgccggtcgagtac1260<image>image see original document page 17</image>〈213〉人工序列 <400〉 4
ttataagctt ggatccggag gttcattctc ccggccgggg ctg 43
〈210〉 5 〈211〉 29 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈400〉 5
aatggtacct cagccggcgc ctaacgaac 29
權(quán)利要求
1、一種乙肝病毒全包膜L基因和結(jié)核桿菌Ag85B基因的融合基因，其特征在于其序列如SEQ ID NO.1所述。
2、 一種包含了權(quán)利要求1所述乙肝病毒全包膜L基因和結(jié)核桿菌Ag85B 基因的融合基因的真核表達載體的構(gòu)建和表達方法，其特征在于包括以下步驟(1) 引物設計根據(jù)乙肝病毒全包膜L基因的編碼序列，設計擴增乙肝病毒全包膜L基因的l對引物上游引物序列為Pl 5' -CAGCTAGCATAATGGGAGGTTGGTCT -3'含Nhel 酶切位點和起始密碼子ATG;下游引物序列為P2 5' -GGCGGAAGCTTAATGTATACCCAAAGAC -3';含 Hind III酶切位點，并刪除終止密碼子；根據(jù)人結(jié)核分支桿菌H37Rv株Ag85B基因的編碼序列，設計擴增結(jié)核桿 菌Ag85B基因的l對引物上游引物序列為P3 5, - TTATAAGCTTGGATCCGGAGGTTCATTCTCCCGGCCG GGGCTG -3';含HindIII酶切位點和含GGATCCGGAGGTTCA的Linker序列；下游引物序列為P4 5' -AATGGTACCTCAGCCGGCGCCTAACGAAC -3';含 Kpn I酶切位點和終止密碼子；(2) 重組質(zhì)粒pVL的構(gòu)建 將乙肝表面抗原陽性患者血清采用苯酚/氯仿抽提法獲得DNA提取液，作為L基因擴增模板，用步驟(1)設計的引物P1和P2進行常規(guī)鏈式聚合酶反應， 擴增出乙肝病毒全包膜L基因片段，將純化后的乙肝病毒全包膜L基因片段和 質(zhì)粒pVAXl分別用Nhel和HindlII進行雙酶切，純化、連接、轉(zhuǎn)化獲得重組質(zhì) 粒pVL;(3)重組質(zhì)粒pVLA的構(gòu)建提取人結(jié)核分支桿菌H37Rv基因組DNA作為模板，用步驟(1)設計的 引物P3和P4進行常規(guī)鏈式聚合酶反應，擴增獲得結(jié)核桿菌Ag85B基因；將 純化的結(jié)核桿菌Ag85B基因與步驟(2)所得重組質(zhì)粒pVL分別用HindIII 和Kpn I雙酶切，純化、連接、轉(zhuǎn)化獲得重組質(zhì)粒pVLA (4)重組質(zhì)粒pVLA轉(zhuǎn)染真核細胞及體外表達鑒定將酶切和測序鑒定正確的步驟(3)所得重組質(zhì)粒pVLA轉(zhuǎn)染HEK293細胞，并通過免疫組織化學法和免疫印記法檢測融合基因的表達蛋白質(zhì)。
3、根據(jù)權(quán)利要求2所述真核表達載體的構(gòu)建和表達方法，其特征在于:步驟(2)所述常規(guī)鏈式聚合酶反應具體歩驟如下將混合液在94t:預變性 5 min，然后進入下列循環(huán)94°C、 45s，55。C、 45s， 72°C、 lmin，共進行30 個循環(huán)，最后72。C延伸10min，擴增完畢后置4。C終止反應；所述混合液組成如下濃度為10umo1/1的上游引物Pl 1 u 1濃度為10umol/l的下游引物P2 ly 1 dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP的濃度各為2. 5 mM的dNTP混合物 4 u 1DNA提取液 5 u 1含Mg"的Ex耐熱性DNA聚合酶反應緩沖液 5 ii 1Ex耐熱性DNA聚合酶 0. 25 u 1滅菌水 33.75ul
4、根據(jù)權(quán)利要求2所述真核表達載體的構(gòu)建和表達方法，其特征在于 步驟(3)所述常規(guī)鏈式聚合酶反應具體步驟如下將混合液在94。C預變性 5 min，然后進入下列循環(huán)94°C、 45s，52。C、 45s， 72°C、 1 min,共進行 30個循環(huán)，最后72。C延伸10min，擴增完畢后置4。C終止反應；所述混合液組成如下濃度為1Oumo1/1的上游引物P3 1 U 1濃度為1Oumo1/1的下游引物P4 1 u 1 dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP的濃度各為2. 5 raM的dNTP混合物 4 u 1H37Rv基因組DNA 4iU含Mg"的Ex耐熱性DNA聚合酶反應緩沖液 5 u 1Ex耐熱性DNA聚合酶 0. 25 P 1滅菌水 34. 75 u 1
5、 根據(jù)權(quán)利要求2所述方法構(gòu)建的真核表達載體作為制備乙肝和結(jié)核 聯(lián)合疫苗的用途。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2所述方法表達的融合基因的表達蛋白質(zhì)作為制備乙 肝和結(jié)核聯(lián)合疫苗的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種乙肝病毒全包膜L基因與結(jié)核桿菌Ag85B的融合抗原基因及其構(gòu)建和表達方法。該融合基因的真核表達載體pVLA的構(gòu)建和表達根據(jù)乙肝病毒全包膜L基因設計1對擴增乙肝病毒全包膜L基因的引物，根據(jù)結(jié)核桿菌Ag85B基因的編碼序列設計1對擴增Ag85B基因的引物；重組質(zhì)粒pVL的構(gòu)建；重組質(zhì)粒pVLA的構(gòu)建；重組質(zhì)粒pVLA轉(zhuǎn)染真核細胞及體外表達鑒定。本發(fā)明融合抗原基因及其真核表達載體和表達蛋白質(zhì)均可用于制備乙肝和結(jié)核的聯(lián)合DNA疫苗。
文檔編號C12N15/79GK101509009SQ200910037758
公開日2009年8月19日 申請日期2009年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月11日
發(fā)明者李君武 申請人:李君武