專利名稱：用豬成纖維細(xì)胞生成誘導(dǎo)的多能性干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及干細(xì)胞領(lǐng)域，特別涉及用豬成纖維細(xì)胞生成誘導(dǎo)的多能性干細(xì) 月包的方法。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞(stem cells)是人體及其各種組織細(xì)胞的初始來源，其最顯著的生物學(xué) 特征是既有自我更新和不斷增殖的能力，又有多向分化的潛能。干細(xì)胞根據(jù)不同 的來源分為成體干纟田月包(somatic stem cells)和胚月臺干細(xì)月包(embryonic stem cells, ES細(xì)胞)。成體干細(xì)胞包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、胰腺干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等成 體組織中存在的。
1981年，ES細(xì)胞的分離和培養(yǎng)首先在小鼠中獲得成功，是至今研究最廣泛、 最成熟的干細(xì)胞體系。隨后，牛、羊等大動物的ES細(xì)胞分離和培養(yǎng)也相繼獲得 成功。
人類胚胎干細(xì)胞(hES細(xì)胞)研究的應(yīng)用前景主要是移植治療，在組織工程 學(xué)領(lǐng)域中以hES細(xì)胞作為種子細(xì)胞，可為臨床上細(xì)胞、組織或器官的移植治療提 供大量的材料。通過控制hES細(xì)胞分化培養(yǎng)環(huán)境、轉(zhuǎn)染能夠促進(jìn)ES細(xì)胞定向 分化的關(guān)鍵分子基因等體外誘導(dǎo)分化策略，可獲得特異性的組織細(xì)胞類型。這類 細(xì)胞用于移植治療，將給糖尿病、帕金森氏病、脊髓損傷、白血病、心肌損傷、 腎衰竭、肝硬化等疾病的治療帶來新的希望。
一直以來，hES細(xì)胞研究面臨著許多難題和爭議，主要包括以下幾個方面(1) 供體卵母細(xì)胞的來源困難，hES細(xì)胞建系效率低。此外，體細(xì)胞核移植術(shù)(SCNT 技術(shù))的不成熟必將需要進(jìn)一步耗費(fèi)更多的人類卵母細(xì)胞，故而其來源難以得到 保證。(2)免疫排斥反應(yīng)，除非采用SCNT技術(shù)，否則患者對hES細(xì)胞分化而來的各種細(xì)胞和組織仍然存在免疫排斥反應(yīng)。(3)hES細(xì)胞具有成瘤性，移植到受體 的體內(nèi)后有發(fā)展為腫瘤的可能性，即使采用SCNT技術(shù)、給移植細(xì)胞設(shè)置自殺基 因等應(yīng)對措施，也不一定能夠很好地解決這個問題。(4)體外維持hES風(fēng)險。
為避開hES細(xì)胞和治療性克隆研究的倫理學(xué)爭論，需要找到一種替代途徑， 以便將人類的體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為多潛能干細(xì)胞，為患者提供"個性化"的自體干 細(xì)胞。2003年，Gurdon研究小組發(fā)現(xiàn)，將已完全分化的小鼠胸腺細(xì)胞或成人外 周血淋巴細(xì)胞的細(xì)胞核注入爪蟾卵母細(xì)胞后，哺乳動物細(xì)胞核的分化標(biāo)志物喪失: 而哺乳動物干細(xì)胞中最具特征性的標(biāo)志物Oct4則呈高表達(dá)，提示哺乳動物細(xì)胞 核可直接被兩棲動物卵母細(xì)胞核泡所重構(gòu)從而表達(dá)O ct4 。
2006年，日本京都大學(xué)Yamanaka研究小組采用體外基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，從24 個因子中篩選出Oct4、 Sox2、 c-Myc、 Klf4等4個轉(zhuǎn)錄因子，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒將 上述4個轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入胚胎小鼠成纖維細(xì)胞或成年小鼠尾部皮膚成纖維細(xì)胞， 在小鼠ES細(xì)胞的培養(yǎng)條件下獲得了 Fbxl5+的多潛能干細(xì)胞系，該細(xì)胞系在細(xì) 胞形態(tài)、生長特性、表面標(biāo)志物、形成畸胎瘤等方面與小鼠ES細(xì)胞非常相似，而 在基因表達(dá)譜、DNA曱基化方式及形成嵌合體動物方面卻不同于小鼠ES細(xì)胞， 故將其命名為誘導(dǎo)的多能性干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)。
2007年，Yamanaka研究小組進(jìn)一步用Nanog代替Fbxl5進(jìn)行篩選，得到了 Nanog+的iPS細(xì)胞系，該iPS細(xì)胞不僅在細(xì)胞形態(tài)、生長特性、標(biāo)志物表達(dá)、 移植到小鼠皮下可形成包含3個胚層組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的畸胎瘤等方面與小鼠ES 細(xì)胞非常相似，而且在DNA曱基化方式、基因表達(dá)譜、染色質(zhì)狀態(tài)、形成嵌合 體動物等方面也與小鼠ES細(xì)胞幾乎完全相同。此外，研究還發(fā)現(xiàn)重新激活原癌 基因c-Myc是嵌合體動物出現(xiàn)腫瘤形成的原因；而轉(zhuǎn)染的上述4個基因在iPS細(xì) 胞中并沒有表達(dá)，表明這些基因只在誘導(dǎo)過程中起作用，iPS細(xì)胞保持多潛能性 狀態(tài)的原因是內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子Nanog基因的表達(dá)。同時獨(dú)立發(fā)表的另 一篇來自 美國科學(xué)家的研究論文同樣證實(shí)了上述4個轉(zhuǎn)錄因子足以使小鼠成纖維細(xì)胞在 體外誘導(dǎo)重構(gòu)成為類似小鼠ES細(xì)胞的iPS細(xì)胞。
新近報道了小鼠肝細(xì)胞和胃上皮細(xì)胞同樣也可被重構(gòu)成為iPS纟田胞，遺傳學(xué)細(xì)胞譜系示蹤分析顯示，iPS細(xì)胞源自i普系定型的體細(xì)胞的直接重構(gòu)，而未發(fā)現(xiàn) 逆轉(zhuǎn)錄病毒整合到特定的基因位點(diǎn)與細(xì)胞核重構(gòu)相關(guān)。
還有研究者利用相同的技術(shù)，將上述同樣的4個轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入到人類皮膚 成纖維細(xì)胞中，也成功獲得了 iPS細(xì)胞。原代人類成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞和源自 新生兒成纖維細(xì)胞的細(xì)胞系同樣也可被重構(gòu)成為iPS細(xì)胞。這類iPS細(xì)胞在細(xì)胞 形態(tài)、增殖能力、表面抗原標(biāo)志、基因表達(dá)譜、多潛能干細(xì)胞特異性基因的表 觀遺傳學(xué)狀態(tài)、端粒酶活性等方面與hES細(xì)胞相似，并且在體外培養(yǎng)時和在小鼠 體內(nèi)畸胎瘤形成中均可分化為3個胚層的不同細(xì)胞類型。與此同時，威斯康辛大 學(xué)Thomson研究小組也報道了成功誘導(dǎo)胎兒成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有hES細(xì)胞 基本特征的人類iPS細(xì)胞，所不同的是他們使用慢病毒作為載體，并在14個候選 基因中選擇了 Oct4、 Sox2、 Nanog、 Lin28等4個基因進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。
Park IH等人利用來自胎兒、新生兒及成人的皮膚或肺部的原代成纖維細(xì)胞， 其中包括來自l名健康男性皮膚活檢得到的成纖維細(xì)胞，采用Yamanaka研究小 組的策略也獲得了相同的結(jié)果。他們還發(fā)現(xiàn)Oct4和Sox2在誘導(dǎo)重構(gòu)為iPS細(xì) 胞過程中是必需的，正是這兩個轉(zhuǎn)錄因子維持了人類iPS細(xì)胞的多潛能性，而 Kif4和c-Myc的作用是改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而有利于Oct4和Sox2的結(jié)合， 以提高誘導(dǎo)的效率。此外，這項(xiàng)研究的重要意義在于將取自皮膚活檢的成纖維細(xì) 胞誘導(dǎo)為iPS細(xì)胞。上述研究表明，從活檢人類皮膚組織中提取體細(xì)胞后進(jìn)行誘 導(dǎo)以制備患者特異性的干細(xì)胞是可行的，因而有望克服細(xì)胞移植治療中存在的 免疫排斥反應(yīng)。鑒于導(dǎo)入c-Myc基因可使嵌合體小鼠的腫瘤發(fā)生率高達(dá)20%，可 能會阻礙其未來的臨床應(yīng)用。因此,Yamanaka研究小組新近報道，小鼠和人類皮 膚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染c-Myc以外的其余3個基因，在調(diào)整培養(yǎng)條件后也可得到iPS 細(xì)胞。去除c-Myc基因盡管可使未來臨床應(yīng)用的安全性顯著提高，但形成iPS細(xì) 胞的效率卻明顯降低。雖然嵌合體小鼠在100天內(nèi)沒有腫瘤發(fā)生，但逆轉(zhuǎn)錄病毒 的再激活仍有導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的潛在風(fēng)險。同樣，慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)可能也存在類似 的風(fēng)險。
盡管科學(xué)家們在人類ES細(xì)胞方面做出了顯著的成績，但從ES細(xì)胞，或者說iPS細(xì)胞到可以移植的組織和器官，路途仍然艱辛而遙遠(yuǎn)。從另一個角度來講， 部分科學(xué)家已經(jīng)開始尋找可以直接移植的器官。但由于人體器官來源的局限性， 其它物種的器官開始進(jìn)入研究者的視野中，而豬就是其中一個典型的例子。由 于豬在器官體積及生理方面與人的相似性，在過去的幾十年中，對于豬的科學(xué) 研究已經(jīng)取得了可喜進(jìn)步。由于ES細(xì)胞可作為良好的研究模型，許多科學(xué)家曾 嘗試分離豬的ES細(xì)胞，但都以失敗而告終。因此，目前對于豬細(xì)胞的遺傳操作 都基于核移植技術(shù)。但由于核移植對于細(xì)胞核的重編程不徹底，因此即使產(chǎn)生 后代，其也多有畸形，且核移植操作繁瑣，周期長，因此效率低、費(fèi)時費(fèi)力。 此外，將人類iPS細(xì)胞應(yīng)用到臨床之前，安全問題，即成瘤性問題需要被嚴(yán)格檢 測。由于小鼠的壽命較短，而猴的飼養(yǎng)又較為困難。因此，豬作為另一個可候 選的生物模型來檢測iPS安全性，極具應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
為克服上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明的目的是提供用豬成纖維細(xì)胞生成誘導(dǎo)的多 能' 性干細(xì)胞的方法。
為實(shí)現(xiàn)該目的，采用如下技術(shù)方案
本發(fā)明的用豬成纖維細(xì)胞生成誘導(dǎo)的多能性干細(xì)胞的方法包括如下步驟
(1) 用包含多能性干細(xì)胞因子的cDNA導(dǎo)入豬成纖維細(xì)胞；
(2) 培養(yǎng)步驟(1)得到的豬成纖維細(xì)胞；
(3) 鑒定多能性干細(xì)胞克隆。
所述多能性干細(xì)胞因子為對于干細(xì)胞多能性維持關(guān)4建的因子。 所述多能性干細(xì)胞因子包括Oct4、 Sox2、 Soxl、 C-myc、 L-Myc、 N-Myc、 Klf4、 Klf5和Klf2中的一種或多種。
其中，所述多能性因子為對于干細(xì)胞多能性維持關(guān)鍵的因子，優(yōu)選地，所 述的多能性因子包括Oct4、 Sox2 (任選地，Soxl)、 C-myc (任選地L-Myc或 N-Myc),以及Klf4(任選地，Klf5或Klf2 )。最優(yōu)選地，所述多能性因子包括 Oct4、 Sox2、 C-myc以及Klf4。上述多能性因子可以是任何來源的，優(yōu)選為小鼠和人的多能性因子以及其變體，如Sox2, NCBI登錄號為NM_011443.3 (小 鼠)和NM—003106.2 (人)；Oct4, NCBI登錄號為NM—013633.2 (小鼠)和 NM—002701.4(人)；Klf4， NCBI登錄號為NM—010637.2(小鼠)和NM—004235.4 (人)；c-Myc， NCBI登錄號為NM—010849.4 (小鼠)和NM—002467.3 (人)； Soxl， NCBI登錄號為NM_009233,3,(小鼠)和NM—005986.2 (人)；KIG, NCBI登錄號為NM_008452.2 (小鼠)和NM—016270.2 (人)；Klf5, NCBI登錄 號為NM—009769.4 (小鼠)和NM—001730.3 (人)。C-Myc還可以被換為其突變 體L-myc (登錄號為NM_008506.2 (小鼠)和NM_001033081.1 (人))；或者 N-Myc (登錄號為NM—008709.3 (小鼠)和NM—005378.4 (人))。
本發(fā)明所述的"誘導(dǎo)的多能性干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)"是這樣的細(xì)胞，其在ES 細(xì)胞培養(yǎng)條件下，與ES細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、生長特性、表面標(biāo)志物表達(dá)、移植到 皮下可形成包含3個胚層組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的畸胎瘤等方面與人ES細(xì)胞非常相似。 本文所述的術(shù)語"誘導(dǎo)重編程"是指將體細(xì)胞去分化為多能性干細(xì)胞的過程。 優(yōu)選地，通過將維持干細(xì)胞多能性所需的多能性因子cDNA導(dǎo)入體細(xì)胞可以誘 導(dǎo)體細(xì)胞去分化成為多能性干細(xì)胞。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
與現(xiàn)有技術(shù)公開的其它可以被誘導(dǎo)為iPS的細(xì)胞不同，本發(fā)明中由豬成纖維 細(xì)胞誘導(dǎo)形成的iPS細(xì)胞，為該物種的進(jìn)一步研究提供了良好的細(xì)胞模型。鑒于 目前仍然沒有分離得到豬ES細(xì)胞，豬iPS細(xì)胞為遺傳操作提供了便利，可以進(jìn) 一步開展分化研究及疾病模型的建立。此外，還可以以豬為模型檢測iPS細(xì)胞的 安全性問題，為優(yōu)化iPS誘導(dǎo)策略，加速人類iPS細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供科學(xué)數(shù)據(jù)。 本發(fā)明利用外源基因高表達(dá)的方式，將豬成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為干細(xì)胞樣細(xì)胞(iPS )， 并證明了其具有分化多能性，為該物種的進(jìn)一步科學(xué)研究提供了良好的細(xì)胞模 型。同時，本發(fā)明基于iPS技術(shù)，成功誘導(dǎo)了ES樣細(xì)胞，具有體外分化潛能， 易于基因操作，為科學(xué)研究提供了良好的平臺。


圖l是豬成纖維細(xì)胞iPS誘導(dǎo)過程的示意圖； 圖2是豬iPS細(xì)胞系的形態(tài)示意圖和外源基因整合分析； 圖3是豬iPS細(xì)胞系的多能性標(biāo)記鑒定圖； 圖4是豬iPS細(xì)胞系畸胎瘤分化鑒定和核型分析。
具體實(shí)施例方式
為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng) 理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
除非另外指明，本發(fā)明的實(shí)踐將使用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、
免疫學(xué)和重組DNA的傳統(tǒng)技術(shù)，其屬于本領(lǐng)域技術(shù)范圍。參見例如，Sambrook, Fritsch和Maniatis ，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第3版(2002); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel等人編著(1987));叢書METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR2: A PRACTICAL APPROACH (M丄MacPherson, B.D. Hames和G.R. Taylor編著，(1995))， Harlow和Lane編 著，(1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL and ANIMAL CELL CULTURE (R.I.Freshney編著，(1987)); W. French Anderson等人，HANDBOOK 。FSTEMCEIXS,巻2。
本發(fā)明的用豬成纖維細(xì)胞生成誘導(dǎo)的多能性干細(xì)胞的方法的優(yōu)選實(shí)施例的 過程如下，圖l為從體外轉(zhuǎn)染到獲得iPS克隆的豬iPS細(xì)胞系IPS誘導(dǎo)過程概覽。使 用5天大的西藏小型豬，與我們實(shí)驗(yàn)使用的品系類似，如圖左所示。獲得使用GFP 對照逆轉(zhuǎn)錄病毒和SKOM感染后6天的豬胚胎成纖維細(xì)胞，在特定培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 使用熒光顯微鏡觀察到GFP有100。/。的感染率。早期的典型形態(tài)改變(與人和鼠 的iPS誘導(dǎo)類似，細(xì)胞變得圓而緊密)只出現(xiàn)在SKOM感染的細(xì)胞克隆中。具體 過程如下
細(xì)胞培養(yǎng)
分離豬胚胎成纖維細(xì)胞，37天的胚胎在HEPES緩沖液培養(yǎng)基中攪碎，39 °C 膠原酶消化4小時。用吸液管多次吹打混合，用PEF培養(yǎng)基1: l稀釋(DMEM-高葡萄糖，青霉素/鏈霉素雙抗，以及10。/。Hyclone胎牛血清)。樣品在700rpm轉(zhuǎn) 速下離心10分鐘，在PEF培養(yǎng)中集中吹打重懸。只有早期的幾代細(xì)胞用于iPS誘 導(dǎo)。用絲裂霉素C處理過的鼠胚胎成纖維細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞。HEK293T細(xì)胞用 作逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細(xì)胞系。以上3種細(xì)胞型均在與豬胚胎成纖維細(xì)胞相同的細(xì) 胞中培養(yǎng)。所有細(xì)胞一直在39t:培養(yǎng)(逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝及感染除外)。 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染
使用含有Sox2、 Klf4、 Oct4、 c-Myc的pMX質(zhì)粒和EGFP的質(zhì)粒以及人因子 的質(zhì)粒(購自Adgene )。 HEK293T細(xì)胞使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)轉(zhuǎn)染。 2輪(一次24小時)，停止轉(zhuǎn)染后收集上清液，過濾(0.45m微孔直徑)，加入到提前 一天分離的豬胚胎成纖維細(xì)胞中；加入聚凝胺(8g/ml， Sigma)以提高轉(zhuǎn)染效率。 iPS細(xì)胞培養(yǎng)基成份為DMEM-高糖，抗生素，谷氨酰胺(2mM, Gibco)，丙酮酸鹽 (2mM,Gibco)，非必須氨基酸(1%, Gibco)， beta巰基乙醇(0.1 mM, Sigma), bFGF(4ng/ml， Invitrogen)， Lif (1000U/ml，Millipore)以及15%提純胎牛血清(dFBS， Hyclone)。 iPS克隆先使用巴氏吸管傳代，然后使用中性蛋白酶(lmg/ml,Invitrogen) 傳代，iPS誘導(dǎo)和維持的培養(yǎng)基每日更新。
相關(guān)結(jié)果見圖2-4，圖2中，圖2A為豬iPS細(xì)胞形態(tài)圖，由圖可見，第16天出現(xiàn) 與胚胎干細(xì)胞(ESC)類似的克隆，并觀察到多種非ESC形態(tài)的其他類型細(xì)胞。 圖2B為挑取單克隆的圖片，在多次傳代后，豬iPS克隆仍然保持最初的形態(tài)，并 且呈現(xiàn)AP染色陽性。圖2C是半定量RT-PCR的凝膠電泳圖，顯示外源的鼠或者人 因子成功整合進(jìn)了豬iPS的基因組DNA中，包括了陽性對照(C+，病毒感染6天的 MEF)對照和陰性對照(未被感染的PEF)。DNA抽提使用Wizard 基因組DNA純 化試劑盒(Promega)。檢測鼠外源因子整合進(jìn)基因組的引物和衡量基因沉默的引 物相同(如下)。用于人因子的引物如下
pMX載體
上游引物5，-GCCGACACCAGACTAAGAACCTAGAACCTC-3,， human Sox2上游引物5，-CTTGGCTCCATGGGTTCG-3，， human Oct4上游引物5，-GAGAACCGAGTGAGAGGCAAC-3，，human Klf4上游引物5 ，-TCTCTTCGTGCACCCACTTG-3 ，，
human c-Myc上游引物5，-AGAGTCTGGATCACCTTCTGCTG -3,。
圖2D是TERT基因的實(shí)時定量RT-PCR結(jié)果，與未感染的PEF比較，顯示在才兆 選的豬ips克隆中得到高表達(dá)。熒光定量PCR使用SYBR Green (Takara)和ABI 7300儀器，數(shù)值使用18S標(biāo)準(zhǔn)化。引物如下
反相端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT, NCBI NO:AY785158):
上游引物5'-TGCTCGCCAACGTTTACA-3，；
下游引物5 ，-CAAGCCGGAGGAAAAATG-3 ，；
18S(NR_002170):
上游引物5，-ACCCACGGAATCGAGAAA-3，； 下游引物5 ，-GCCTGCGGCTTAATTTGA-3 ，。
豬iPS細(xì)胞使用的是豬iPS克隆的第9代(mouse SKOM)和15代(human SK。M)。
圖3A為免疫熒光顯微觀察。iPS細(xì)胞系在有滋養(yǎng)層細(xì)胞包被的載玻片中生長 2-3天，然后使用4%多聚曱醛固定。玻片使用Triton X100通透，然后使用封閉試 劑(含5。/。FBS的PBS溶液)孵育30分鐘?？筍SEA4的抗體以及二抗(山羊抗鼠 TRITC)分別購于Invitrogen以及中山金橋生物技術(shù)有限公司，抗Nanog和Rexl的抗 體購自Abcam。室溫一抗一個小時以上，二抗一小時或少于一小時。DAPI購自 Sigma，蓋玻片用甘油和指曱油封片至于載玻片上，使用常規(guī)的熒光顯微鏡觀察。 結(jié)果顯示iPS克隆表達(dá)ES細(xì)胞多能性標(biāo)記SSEA4， Nanog和Rexl。
圖3B為半定量RT-PCR鑒定多能性標(biāo)記。使用Trizol(MRC)提取RNA。反 轉(zhuǎn)錄的半定量PCR使用降落PCR技術(shù)和LA Taq聚合酶(Takara)。豬序列的引物 如下
外源的Sox2 (NCBI accession number畫_001123197) 上游引物5'-GGTTACCTCTTCTTCCCACTCCA-3，； 下游引物5 ，-CAAAAATAGTCCCCCCAAAAGAAG-3 ，； Nanog(顧—001129971):上游引物5，-CTTATTCAGGACAGCCCTGATTCTTC-3，； 下游引物5，- AAGACGGCCTCCAAATCACTG誦3,; Lin28(NMJ)01123133):
上游引物5，-TCAACGTGCGCATGGGGTTCGGCTTCCTGT-3，； 下游引物5, - GTGGACGTCTTTGTGCACCAGAGTAAGCTG誦3 ，； beta actin (AY550069):
上游引物5，-CCGTGAGAAGATGACCCAGATCATGT-3，；
下游引物5 ，-CGTGATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3 ，；
Sox2、 Lin2S和Nanog擴(kuò)增子克隆進(jìn)pMD18-T (TAKARA)并測序。證明與 預(yù)測序列100%吻合，此外在NCBI和Sanger豬基因組數(shù)據(jù)庫中沒有其他可吻合序 列。用5-azad處理含有人因子C13和C17iPS克隆沒有進(jìn)一步增加ESC marker的表 達(dá)(如圖右所示)。使用豬iPS克隆的第9代(鼠SKOM)和第15代(人SKOM)。
圖3C為外源轉(zhuǎn)基因沉默程度檢測，其引物為
pMX載體上游引物 5，-GCCGACACCAGACTAAGAACCTAGAACCTC-3，，
mouse Sox2下游引物5 ，-GCTTCAGCTCCGTCTCCATCATGTTATACAT-3 ，, mouse Oct4下游引物5 ，-AGTATGCCATCCCTCCGCAGAACTCGTATG-3 ，，
mouse Klf4下游引物5，- AGGATAAAGTCTAGGTCCAGGAGGTCGTTG-3'，
mouse c-Myc下游引物5，-AGTCGTAGTCGAGGTCATAGTTCCTGTTGG-
3，，
human Sox2下游引物5，-TGACCACCGAACCCATGGAGCCAAGAG-3，， humanOct4下游引物5，-GTTGCTCTCCACCCCGACTCCTGCTTC-3，， human Klf4下游引物5 ，-GGAGGATGGGTCAGCGAATTGGAGAGA-3 ，， human c-Myc下游引物5 ，-AGGACGGAGAGAAGGCGCTGGAGTCTTG-3，。
半定量RT-PCRs使用上述的逆轉(zhuǎn)錄樣品。使用半定量RT-PCR檢測顯示挑 選的iPS細(xì)胞系與對照感染細(xì)胞的mRNA產(chǎn)物相比有低程度的沉默，水作為PCR反應(yīng)的的陰性對照。
圖4是豬iPS細(xì)胞系具有多能性的分析圖。圖4A表示在免疫缺陷的小鼠中形 成的畸胎瘤分化成了3個胚層。豬iPSCs使用中性蛋白酶收獲，IOO萬個細(xì)胞皮下 注射進(jìn)棵鼠的拱側(cè)翼。8-9周后，小鼠被處死，畸胎瘤嵌入石蠟中，使用 hematoxilin/eosin切片染色后進(jìn)行組織結(jié)構(gòu)上地分析。使用細(xì)胞系為hs SKOM C13 (第16代)和hsSKOMC17(第16代)。圖4B為iPS細(xì)胞的核型分析。細(xì)胞在 培養(yǎng)瓶(Coming,美國)中培養(yǎng)至指數(shù)生長期，加入^C水仙素(Dahui biotech)終濃 度50pg/ml，然后細(xì)胞用胰蛋白酶處理，2,000 rpm離心5min，在8ml的0.075M KC1重懸，在37。C中孵育20分鐘。加入固定液(由1份醋酸和3份曱醇)至10ml,輕 柔混合，37。C孵育10分鐘。離心，并棄上清，加入冰凍固定溶液(由1份醋酸和3 份曱醇)至10ml。細(xì)胞由高處滴落至水凍載玻片，75。C孵育3h。顯帶時用胰蛋 白酶和著色劑處理，并且用01ympusBX51顯微鏡分析分裂中期的狀態(tài)。通過核 型分析顯示出，兩個不同的人SKOMips細(xì)胞系(第18代)擁有與對照組PEF細(xì) 胞等量的染色體(19對)。
最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā) 明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不 脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
權(quán)利要求
1、一種用豬成纖維細(xì)胞生成誘導(dǎo)的多能性干細(xì)胞的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)用包含多能性干細(xì)胞因子的cDNA導(dǎo)入豬成纖維細(xì)胞；(2)培養(yǎng)步驟(1)得到的豬成纖維細(xì)胞；(3)鑒定多能性干細(xì)胞克隆。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用豬成纖維細(xì)胞生成誘導(dǎo)的多能性干細(xì)胞的方法， 其特征在于，所述步驟(2)與所述步驟(3)之間可以包括如下步驟感染后第16天，選擇與hES相似的ES樣克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用豬成纖維細(xì)胞生成誘導(dǎo)的多能性干細(xì)胞的 方法，其特征在于，所述多能性干細(xì)胞因子為對于干細(xì)胞多能性維持關(guān)鍵的因 子。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用豬成纖維細(xì)胞生成誘導(dǎo)的多能性干細(xì)胞的方法， 其特征在于，所述多能性干細(xì)胞因子包括Oct4、 Sox2、 Soxl、 C-myc、 L-Myc、 N-Myc、 Klf4、 Klf5和Klf2中的一種或多種。
5、 用權(quán)利要求1或2所述的用豬成纖維細(xì)胞生成誘導(dǎo)的多能性干細(xì)胞的方 法得到的多能性干細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了用豬成纖維細(xì)胞生成誘導(dǎo)的多能性干細(xì)胞的方法。該方法包括如下步驟(1)用包含多能性干細(xì)胞因子的cDNA導(dǎo)入豬成纖維細(xì)胞；(2)培養(yǎng)步驟(1)得到的豬成纖維細(xì)胞；(3)鑒定多能性干細(xì)胞克隆。本發(fā)明成功誘導(dǎo)了ES樣細(xì)胞，具有體外分化潛能，易于基因操作；本發(fā)明的豬iPS細(xì)胞為遺傳操作提供了便利，可以進(jìn)一步開展分化研究及疾病模型的建立；還可以以豬為模型檢測iPS細(xì)胞的安全性問題，為優(yōu)化iPS誘導(dǎo)策略，加速人類iPS細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供科學(xué)數(shù)據(jù)。
文檔編號C12N15/867GK101613717SQ20091003874
公開日2009年12月30日 申請日期2009年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月17日
發(fā)明者彭梅秀, 徐建勇, 楊佳銀, 米蓋爾·埃斯特班, 裴端卿, 賴良學(xué) 申請人:中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院