專利名稱：一種提取體液中病毒rna或dna的試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生化領(lǐng)域，具體涉及核酸的分離。
背景技術(shù)：
血漿、血清中病毒RNA/DNA提取的主流方法是"Trizol"法，但這種方法需要在提取過(guò) 程中吸取上清并換管，上清不能完全吸出，總要損失一部分RNA/DNA，且步驟比較繁瑣，因 此對(duì)于嚴(yán)格的絕對(duì)定量并不是很合適。另外我國(guó)及國(guó)外市場(chǎng)上也出現(xiàn)了一管式病毒RNA/DNA 提取試劑，但該類試劑的提取效率較低，需要200ul以上的液體標(biāo)本才能達(dá)到較高的敏感性， 如羅氏公司的HIV定量試劑及國(guó)內(nèi)天澤基因的RNAout提取試劑。羅氏公司的HIV定量試劑用 200ul血漿可使HIV定量敏感性達(dá)到200copies/ml ，而RNAout提取試劑據(jù)其廣告宣稱用200ul 血槳可使病毒定量敏感性達(dá)到50 100copies/ml，但實(shí)際上由于該試劑在沉淀病毒RNA的同 時(shí)沉淀了大量蛋白，且最終RNA溶解體積要100ul以上，所以其效率并不高，因此阻礙了其 大規(guī)模應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提高體液中病毒RNA或DNA的提取效率。 本發(fā)明解決上述問(wèn)題的技術(shù)方案是-
一種提取體液中病毒RNA或DNA的試劑，其特征在于每升試劑由以下組分組成異硫 氰酸胍4 6mo1，鹽酸胍l 2.5mo1，檸檬酸鈉20 50mmo1， & -巰基乙醇10 30ml ，十二垸 基肌氨酸鈉5 10g，尿素1.5 3mo1，糖原60 100mg，余量為水。
每升本發(fā)明試劑中各組分的含量?jī)?yōu)選異硫氰酸胍5.4mol，鹽酸胍2rao1，檸檬酸鈉 25鵬o1， e-巰基乙醇20ml，十二烷基肌氨酸鈉7g，尿素2mo1，糖原64mg，余量為水。
本發(fā)明試劑的制備方法為將異硫氰酸胍、鹽酸胍、檸檬酸鈉、e-巰基乙醇、十二烷基
肌氨酸鈉、尿素和糖原溶于水中即可。上述制備方法中所用的水均經(jīng)DEPC處理過(guò)。 采用本發(fā)明試劑提取體液中病毒RNA或DNA的方法是 (1 )取三體積份本發(fā)明試劑，加入標(biāo)本，上下顛倒混勻4 6次至混勻，常溫下靜置10min， 然后加入四體積份的異丙醇，上下顛倒混勻4 6次至混勻，在20 25'C下用高速離心機(jī) 12000-13000rpm離心15min;
(2) 傾去上清液，再以12000rpm離心lmin;
(3) 吸凈剩余的上清液，然后加入體積百分比濃度為50%的冷異丙醇八體積份，然后 在4。C下離心5min，傾去上清液體，留沉淀物；
3(4)以12000rpm離心lmin，吸凈剩余的上清液，留沉淀物。
上述步驟中，所述的標(biāo)本是體液標(biāo)本，如血漿、血清及用離心法除去細(xì)胞的腦脊液、胸 水、腹水等；所述的體積份均以標(biāo)本量為一單位體積計(jì)算得到的體積份數(shù)。
為了方便后續(xù)工作的進(jìn)行，上述方法獲得RNA或DNA沉淀物后應(yīng)盡快用逆轉(zhuǎn)錄溶液或 水溶解。所述的逆轉(zhuǎn)錄溶液是用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的緩沖液，如市售逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中的buffer。
用本發(fā)明試劑提取病毒RNA或DNA的效率較高，體液標(biāo)本的用量可低至100 y L，且所 得RNA或DNA純度較高，用于反轉(zhuǎn)錄或定量PCR檢測(cè)時(shí)，可使檢測(cè)敏感性可達(dá)到 50copies/mL。本發(fā)明之所以有這樣的效果，是因?yàn)楸景l(fā)明試劑選用了合適的蛋白變性劑以及 提高了提取體系中的鹽濃度。本發(fā)明試劑中所含的異硫氰酸胍、鹽酸胍和尿素蛋白質(zhì)的強(qiáng)變 性劑，三者組合可使病毒的蛋白質(zhì)外殼快速變性并溶解在試劑里，充分暴露出蛋白質(zhì)外殼內(nèi) 的RNA，這樣可極大提高標(biāo)本的利用率；本發(fā)明試劑中高濃度的檸檬酸鈉提高了提取體系中 的鹽濃度，有利于減少在異丙醇沉淀RNA或DNA時(shí)蛋白質(zhì)的共沉淀，盡可能減少病毒RNA/DNA 沉淀物中的蛋白雜質(zhì)，大大提高了所得病毒RNA/DNA的純度，使最終溶解體積可低至8微升。


圖1是實(shí)施例1所得RNA的逆轉(zhuǎn)錄后的定量PCR擴(kuò)增曲線圖。 圖2是實(shí)施例1定量PCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。 圖3是實(shí)施例2所得DNA的定量PCR擴(kuò)增曲線圖。 圖4是實(shí)施例2定量PCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施方式
例1
本發(fā)明試劑組成異硫氰酸胍5. 4mo1，鹽酸胍2mo1，檸檬酸鈉25mmo1， P -巰基乙醇20ml， 十二垸基肌氨酸鈉7g，尿素2mo1，糖原64mg，其余為水。
本發(fā)明試劑的制備取異硫氰酸胍、鹽酸胍、檸檬酸鈉2、 巰基乙醇、十二烷基肌氨 酸鈉、尿素和糖原混合，用經(jīng)DEPC處理過(guò)的水溶解并定量至1L，然后用0.45um濾膜過(guò)濾。
病毒RNA的提取
(1) 材料將SIV病毒標(biāo)準(zhǔn)品(國(guó)際通用SIV病毒顆粒標(biāo)準(zhǔn)品，法國(guó)巴黎第五大學(xué)盧葳 教授惠贈(zèng))用猴血漿稀釋為6個(gè)濃度，分別為0.5X107 copies/ml、 0.5X106 copies/ml、 0. 5X105 copies/ml、 0. 5X 104 copies/ml、 0. 5X 103 copies/ml、 0. 5X 102copies/ml，每個(gè) 濃度做12個(gè)平行提取實(shí)驗(yàn)。同時(shí)設(shè)立猴血漿為陰性對(duì)照孔2孔。
(2) 方法向1. 5ml離心管中加入300ul本發(fā)明試劑，然后加入上述血漿標(biāo)本100ul， 上下顛倒混勻4次至混勻(不可劇烈搖蕩)，常溫下靜置10min;然后加入400ul常溫的異丙醇，上下顛倒混勻4次至混勻，于常溫下12000rpm離心15min。傾去上清液，再以12000rpm 離心lmin。用移液槍小心吸干凈管底的剩余液體(不可觸碰管底的沉淀)，然后加入體積百 分比濃度為50M的冷異丙醇800ul，然后在4'C下離心5min，傾去上清液體。再以12000rpm 離心lmin。用移液槍小心吸干凈管底的剩余液體(不可觸碰管底的沉淀)。最后加入8ul水 溶解沉淀(如沉淀難溶，需用移液槍吹打，務(wù)必使沉淀散開)。 所得RNA的質(zhì)量鑒定
將所得RNA逆轉(zhuǎn)錄定量PCR實(shí)驗(yàn)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和條件如下 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為(RNA樣品為沉淀，不計(jì)入體積)。
5X Buffer 1.6ul
Reverse引物(250nM) 0. 4ul
d證(lOmM) 0.8ul
Rnase inhibitor (40u/ul) 0. 2ul
水 4.6ul
逆轉(zhuǎn)錄酶(200u/ul)_0. 4ul
總體積
5XBuffer、 Rnase inhibitor和逆轉(zhuǎn)錄酶均為立陶宛MBI公司產(chǎn)品，購(gòu)自深圳中晶公司，水 為DEPC處理水，DEPC購(gòu)自廣州威佳公司。
逆轉(zhuǎn)錄條件為置入42'C水浴鍋中1小時(shí)，然后即可進(jìn)行PCR反應(yīng)，亦可凍存于冰箱 中長(zhǎng)期保存。
將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所得的cDNA進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系和條件如下
引物sense (250nM): 0. 25ul
引物antisense (250nM): 0. 25ul
Probe (200nM) : 0. 2ul
水 9.8ul
定量PCRraix: 12. 5ul (市售ABI公司定量PCR試劑盒)
cDNA Sample:_^_
總體積 25ul
引物與探針均為上?；倒竞铣杉皹?biāo)記，定量PCRMix為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品，水為DEPC 處理水。DEPC購(gòu)自廣州威佳公司。
上機(jī)條件95°C， 10min，然后95。C， 15sec， 6CTC， lmin， 45個(gè)循環(huán)。
用本發(fā)明試劑提取所得的病毒RNA的定量PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示同一個(gè)濃度的12 個(gè)平行樣的Ct值都幾乎重合，說(shuō)明用本發(fā)明試劑提取病毒RNA的重復(fù)性極好；以病毒拷貝 數(shù)的對(duì)數(shù)值為自變量，Ct值為因變量作圖，得一標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖2)，標(biāo)準(zhǔn)方程為 y=-3.34x+39.01， R2=0.993。上述結(jié)果顯示定量PCR可檢測(cè)出低至50拷貝/毫升的所得RNA 樣品，說(shuō)明用本發(fā)明試劑提取病毒RNA的純度很高。
例2
本發(fā)明試劑組成異硫氰酸胍5. 4mo1，鹽酸胍2mol，檸檬酸鈉25mmol， P -巰基乙醇20ml，
5十二垸基肌氨酸鈉7g，尿素2mo1，糖原64mg，其余為水。
本發(fā)明試劑的制備取異硫氰酸胍、鹽酸胍、檸檬酸鈉、e-巰基乙醇、十二烷基肌氨酸
鈉、尿素和糖原混合，用經(jīng)DEPC處理過(guò)的水溶解并定量至1L，然后用0.45um濾膜過(guò)濾。 實(shí)驗(yàn)材料醫(yī)院臨床檢測(cè)的HBVDNA定量拷貝數(shù)在le9以上的病人血清標(biāo)本。 將HBVDNA病人血清標(biāo)本用細(xì)胞培養(yǎng)用新生牛血清進(jìn)行稀釋，稀釋為5e8拷貝/毫升、 5e7拷貝/毫升、5e6拷貝/毫升、5e5拷貝/毫升、5e4拷貝/毫升、5e3拷貝/毫升、5e2拷貝/ 毫升、5el拷貝/毫升，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并同時(shí)設(shè)立新生牛血清為陰性對(duì)照孔l孔，向 1. 5ml離心管中加入300ul本發(fā)明試劑，然后加入血清標(biāo)本100ul，上下顛倒混勻4次至混勻 (不可劇烈搖蕩)，常溫下靜置10min;然后加入400ul常溫的異丙醇，上下顛倒混勻4次至 混勻，于常溫下12000rpm離心15min。傾去上清液，再以12000rpm離心lmin。用移液槍小 心吸干凈管底的剩余液體(不可觸碰管底的沉淀)，然后加入體積百分比濃度為50%的冷異 丙醇800ul，然后在4。C下離心5min，傾去上清液體。再以12000rpm離心lmin。用移液槍小 心吸干凈管底的剩余液體(不可觸碰管底的沉淀)。最后加入8ul水溶解沉淀(如沉淀難溶， 需用移液槍吹打，務(wù)必使沉淀散開)。
將所得病毒DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系及條件如下
引物sense (250nM): 0. 25ul
引物antisense (250nM): 0. 25ul
Probe (200nM) : 0.2ul
水 9.8ul
定量PCRmix: 12. 5ul (市售ABI公司定量PCR試劑盒)
DNA S柳ple:__
25ul
上述試劑中，引物與探針均為上?；倒竞铣杉皹?biāo)記，定量PCRMix為美國(guó)ABI公司 產(chǎn)品，水為DEPC處理水。DEPC購(gòu)自廣州威佳公司。
上機(jī)條件95。C, 10min，然后95。C, 15sec， 60°C， lmin， 共反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。
用本發(fā)明試劑提取所得的病毒DNA的定量PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示同一個(gè)濃度的12 個(gè)平行樣的Ct值都幾乎重合，說(shuō)明用本發(fā)明試劑提取病毒RNA的重復(fù)性極好；以病毒拷貝 數(shù)的對(duì)數(shù)值為自變量，Ct值為因變量作圖，得一標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖4)，標(biāo)準(zhǔn)方程為 y=-3.285566x+42.496368， R2-0.994。上述結(jié)果顯示定量PCR可檢測(cè)出低至50拷貝/毫升的 所得RNA樣品，且重復(fù)性極好，說(shuō)明用本發(fā)明試劑提取病毒RNA的純度很高。
例3
本發(fā)明試劑組成異硫氰酸胍4mo1，鹽酸胍lmol，檸檬酸鈉20國(guó)o1， P -巰基乙醇10ml，十二垸基肌氨酸鈉5g，尿素1.5mo1，糖原60mg，余量為水。
本發(fā)明試劑的制備取異硫氰酸胍、鹽酸胍、檸檬酸鈉、巰基乙醇、十二烷基肌氨酸 鈉、尿素和糖原混合、用經(jīng)DEPC處理過(guò)的水溶解并定量至1L，然后用0.45lim濾膜過(guò)濾。
實(shí)驗(yàn)材料醫(yī)院臨床檢測(cè)的HBVDNA定量拷貝數(shù)在le9以上的病人血清標(biāo)本。
將HBVDNA病人血清標(biāo)本用細(xì)胞培養(yǎng)用新生牛血清進(jìn)行稀釋，稀釋為5e8拷貝/毫升、 5e7拷貝/毫升、5e6拷貝/毫升、5e5拷貝/毫升、5e4拷貝/毫升、5e3拷貝/毫升、5e2拷貝/ 毫升、5el拷貝/毫升，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并同時(shí)設(shè)立新生牛血清為陰性對(duì)照孔l孔，向 1. 5ml離心管中加入300ul本發(fā)明試劑，然后加入血清標(biāo)本100ul，上下顛倒混勻4次至混勻 (不可劇烈搖蕩)，常溫下靜置10min;然后加入400ul常溫的異丙醇，上下顛倒混勻4次至 混勻，于常溫下12000rpm離心15min。傾去上清液，再以12000rpm離心lmin。用移液槍小 心吸干凈管底的剩余液體(不可觸碰管底的沉淀)，然后加入體積百分比濃度為50%的冷異 丙醇800ul，然后在4'C下離心5min，傾去上清液體。再以12000rpm離心lmin。用移液槍小 心吸干凈管底的剩余液體(不可觸碰管底的沉淀)。最后加入8ul水溶解沉淀(如沉淀難溶， 需用移液槍吹打，務(wù)必使沉淀散開)。
例4
本發(fā)明試劑組成異硫氰酸胍6mo1,鹽酸胍2.5tno1，檸檬酸鈉50ramo1， P-巰基乙醇 30ml，十二烷基肌氨酸鈉10g，尿素3mo1,糖原100mg,余量為水。
本發(fā)明試劑的制備取異硫氰酸胍、鹽酸胍、檸檬酸鈉、e-巰基乙醇、十二垸基肌氨酸
鈉、尿素和糖原混合，用經(jīng)DEPC處理過(guò)的水溶解并定量至1L，然后用0.45nm濾膜過(guò)濾。 病毒RNA的提取
(1) 材料將SIV病毒標(biāo)準(zhǔn)品(國(guó)際通用SIV病毒顆粒標(biāo)準(zhǔn)品，法國(guó)巴黎第五大學(xué)盧葳 教授惠贈(zèng))用猴血漿稀釋為6個(gè)濃度，分別為0.5X107 copies/ml、 0.5X106 copies/ml、 0. 5X105 copies/ml、 0. 5X 104 copies/ml、 0. 5X 103 copies/ml、 0. 5X 102copies/ml，每個(gè) 濃度做12個(gè)平行提取實(shí)驗(yàn)。同時(shí)設(shè)立猴血漿為陰性對(duì)照孔2孔。
(2) 方法向1.5ml離心管中加入300ul本發(fā)明試劑，然后加入上述血漿標(biāo)本100ul， 上下顛倒混勻4次至混勻(不可劇烈搖蕩)，常溫下靜置10min;然后加入400ul常溫的異丙 醇，上下顛倒混勻4次至混勻，于常溫下12000rpm離心15min。傾去上清液，再以12000rptn 離心lmin。用移液槍小心吸干凈管底的剩余液體(不可觸碰管底的沉淀)，然后加入體積百 分比濃度為50X的冷異丙醇800ul，然后在4'C下離心5min，傾去上清液體。再以12000rpm 離心lmin。用移液槍小心吸干凈管底的剩余液體(不可觸碰管底的沉淀)。最后加入8ul水 溶解沉淀(如沉淀難溶，需用移液槍吹打，務(wù)必使沉淀散開)。
權(quán)利要求
1、一種提取體液中病毒RNA或DNA的試劑，其特征在于每升試劑由以下組分組成異硫氰酸胍4～6mol，鹽酸胍1～2.5mol，檸檬酸鈉20～50mmol，β-巰基乙醇10～30ml，十二烷基肌氨酸鈉5～10g，尿素1.5～3mol，糖原60～100mg，余量為水。
2、 如權(quán)利要求l所述的試劑，其特征在于每升試劑由以下組分組成 異硫氰酸胍5.4rao1，鹽酸胍2mo1，檸檬酸鈉25ramo1， e-巰基乙醇20ml，十二烷基肌氨酸鈉7g，尿素2mo1，糖原64mg，余量為水。
3、 一種提取體液中病毒RNA或DNA的方法，該方法由以下步驟組成 (1) 取三體積份權(quán)利要求1或2所述試劑，加入標(biāo)本，上下顛倒混勻4 6次至混勻， 常溫下靜置10min，然后加入四體積份的異丙醇，上下顛倒混勻4~6次至混勻，在20 25 。C下用高速離心機(jī)12000 13000rpm離心15min;(2) 傾去上清液，再以12000rpm離心lmin;(3) 吸凈剩余的上清液，然后加入體積百分比濃度為50%的冷異丙醇八體積份，然后 在4。C下離心5min，傾去上清液體，留沉淀物；(4) 再以12000rpm離心lmin，吸凈剩余的上清液，留沉淀物；其中，所述的標(biāo)本是體液標(biāo)本；所述的體積份均以標(biāo)本量為一單位體積計(jì)算得到的體積 份數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種提取體液中病毒RNA或DNA的試劑，其特征在于每升試劑由以下組分組成異硫氰酸胍4～6mol，鹽酸胍1～2.5mol，檸檬酸鈉20～50mmol，β-巰基乙醇10～30ml，十二烷基肌氨酸鈉5～10g，尿素1.5～3mol，糖原60～100mg，余量為水。用本發(fā)明試劑提取出來(lái)的病毒RNA或DNA的效率較高，僅用100μL的體液標(biāo)本穩(wěn)定即可獲得高純度的病毒RNA或DNA。所得RNA或DNA用于定量PCR檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)敏感性可達(dá)到50copies/mL。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101565700SQ200910039350
公開日2009年10月28日 申請(qǐng)日期2009年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月8日
發(fā)明者何金洋 申請(qǐng)人:廣州中醫(yī)藥大學(xué)