專利名稱：一種赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒檢測用引物組、檢測方法和快速診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水生生物病害的生物學(xué)鑒定，尤其涉及魚類病毒性神經(jīng)壞死病 的檢測，具體涉及一種赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒檢測用引物組、檢測方法和快 速診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
魚類病毒性神經(jīng)壞死病又稱病毒性腦病和視網(wǎng)膜病，是世界范圍內(nèi)的一種 魚類流行性傳染病。病原是魚類神經(jīng)壞死病毒，屬于野田村病毒科II型野田村 病毒屬。魚類神經(jīng)壞死病毒分為4種基因型分別為紅鰭東方飩神經(jīng)壞死病毒
(tiger puffer NNV， TPNNV)、黃帶鰺神經(jīng)壞死病毒(striped jack NNV， SJNNV)、條斑星鰈神經(jīng)壞死病毒(barfm flouder NNV， BFNNV)和赤點石 斑魚神經(jīng)壞死病毒(red-spotted grouperNNV， RGNNV)。
在中國發(fā)現(xiàn)的魚類病毒性神經(jīng)壞死癥的病原主要是赤點石斑魚神經(jīng)壞死 病毒。魚類神經(jīng)壞死病毒對仔魚和幼魚危害很大，感染后死亡率極高，各種魚 類感染NNV后的發(fā)病時間及死亡率各不相同，最早發(fā)病時間是孵化后ld， 一 般是孵化后l-3周開始發(fā)病，嚴(yán)重者在一周內(nèi)死亡率可達(dá)100%。受NNV感染的 魚包括鰻鱺目、鱈形目、鱸形目、鰈形目和飩形目5個目17科的40多種魚類。 到目前為止，對于病毒性神經(jīng)壞死病還沒有有效的治療方法，防止病毒的傳染 和流行是能夠采取的主要措施，早期快速診斷神經(jīng)壞死病毒是減少損失的有效 途徑，因此，簡便快速、特異性好、靈敏度高的診斷試劑盒及其檢測方法對于 疾病的預(yù)防意義重大。目前常用的檢測技術(shù)是以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)為代表的病原核酸 檢測技術(shù)，但是這些檢測技術(shù)在實際應(yīng)用中存在一些問題，如普通聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)(PCR)技術(shù)需要專門的儀器，而且存在容易交叉污染和操作過程煩瑣的
缺點；熒光實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)雖然較好地解決了交叉污染的問題，
并簡化了操作過程，但卻需要更復(fù)雜的定量測定儀器，不適用于現(xiàn)場快速檢測，
而且實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù)中熒光探針的成本較高，加大了推廣應(yīng) 用的難度；免疫學(xué)檢測技術(shù)快速簡便成本低廉，但要求高質(zhì)量高穩(wěn)定性的單克 隆抗體，否則因準(zhǔn)確性不夠，目前只能是輔助檢測手段。所以及時運(yùn)用生物技 術(shù)發(fā)展的最新成果對滿足病原微生物檢測要求的不斷提高具有重要意義。
環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,簡稱LAMP
技術(shù))，是近年來新出現(xiàn)的一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)，具有快速、 敏感、特異性強(qiáng)等特點，LAMP主要是利用4種不同的特異性引物(引物F3、 引物B3、引物FIP和引物BIP)識別靶基因的6個特定區(qū)段，在聚合酶和等 溫條件下高效、快速、高特異地擴(kuò)增靶序列，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，通常是采用染 色劑對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析。LAMP中所用到的聚合酶通常都選用具有鏈置換特 性的DNA聚合酶，如BstDNA聚合酶。對LAMP來說，4種特異性引物的 設(shè)計是其關(guān)鍵所在。
LAMP因其自身的優(yōu)點，現(xiàn)已被用于病原微生物的檢測和傳染性疾病的診 斷，如嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)的檢測、分支桿菌屬檢 測、腺病毒性結(jié)膜炎檢測、真菌檢測等，現(xiàn)尚未見有將LAMP用于赤點石斑 魚神經(jīng)壞死病毒檢測的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種對赤點石斑魚神經(jīng)壞死 病毒具有高特異性，可用于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒 的引物組。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種用上述引物組對赤點石斑魚神經(jīng)壞死 病毒進(jìn)行快速、高效、高特異性檢測的方法。
本發(fā)明的另一個目的在于提供含有上述引物組的快速診斷試劑盒。 本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實現(xiàn)的
一、 本發(fā)明的赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒檢測用引物組，是基于環(huán)介導(dǎo)等溫 擴(kuò)增技術(shù)，根據(jù)已公開的赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒基因組序列，選取赤點石斑 魚神經(jīng)壞死病毒基因的特異性序列，然后分析設(shè)計出的，能專一性鑒別赤點石 斑魚神經(jīng)壞死病毒的特異性引物組，通過PCR來鑒定赤點石斑魚神經(jīng)壞死病 毒基因，該引物組由如下四條引物組成
內(nèi)引物FIP，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示； 內(nèi)引物BIP，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示； 外引物F3，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示； 外引物B3，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。
二、 采用本發(fā)明的赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒檢測用引物組，按照如下本領(lǐng) 域人員進(jìn)行LAMP反應(yīng)的常規(guī)操作步驟都可對赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒進(jìn)行 檢測，實現(xiàn)本發(fā)明
(1) 提取待測樣品核酸后反轉(zhuǎn)錄的cDNA;
(2) 向反應(yīng)管中加入上述赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒檢測用引物組、LAMP反應(yīng)液和Bst DNA聚合酶，恒溫反應(yīng)；
(3)反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)管中加入顯色液，混勻，通過觀察顏色判斷待測
樣品中是否含有赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒。
上述的LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件可參考本領(lǐng)域的常規(guī)操作或LAMP試 劑盒的說明。
為了提高檢測的特異性，取得更好的檢測效果，本發(fā)明人對檢測方法進(jìn)行 了優(yōu)化
(1)本發(fā)明人以0.2 uM F3和0.2 uM B3為基準(zhǔn)，對內(nèi)外引物的比例進(jìn)
行優(yōu)化，內(nèi)引物外引物為l: 1 1: 10，最佳比例為l: 4，即0.8 uM FIP、
0.8 uM BIP、 0.2 uM F3、 0.2 uM B3、 18 uL LAMP反應(yīng)液以及8 U Bst DNA聚合酶；
(2) LAMP反應(yīng)時，其LAMP反應(yīng)液的配方可為含有1X反應(yīng)緩沖液、 0.2 2.0 mM dNTPs、 0 1.4M甜菜堿和0 12 mM MgS04，優(yōu)選含有1X反應(yīng)緩 沖液、1.2mMdNTPs、 0.8 M甜菜堿和6 mM MgS04，所述1X反應(yīng)緩沖液是 本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行Bst DNA聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)時常用的反應(yīng)試劑，可采用 試劑盒中搭配BstDNA聚合酶的lX反應(yīng)緩沖液，其配方通常可包括如下組 分20mMpH8.8的Tris畫HCl、 10mMKCl、 10 mM (NH4)2S04、 2mMMgS04 和0.1% Triton X-100 (0.1 ^TritonX-100是Triton X-100占反應(yīng)液的體積百分 比為0.1。/O;
(3)LAMP反應(yīng)時，恒溫反應(yīng)溫度可選擇58 68。C，最佳為65'C，反應(yīng)時 間可選擇40 70min，最佳為60min。
三、根據(jù)上述檢測方法，本發(fā)明人還提供含有赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒檢測用引物組的試劑盒，該試劑盒包含如下組分
(1) 赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒檢測用引物組內(nèi)引物FIP，其核苷酸序列
如SEQ ID NO:l所示；內(nèi)引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；外 引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；外引物B3，其核苷酸序列如 SEQ ID NO:4所示；
(2) 陽性對照品含有赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒外殼蛋白基因的質(zhì)粒；
(3) 顯色液可選擇任何一種常用的熒光染料，優(yōu)選SYBR Green I或
該試劑盒在使用時，先提取待測樣品RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，然后用上 述赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒檢測用引物組進(jìn)行常規(guī)LAMP反應(yīng)，反應(yīng)后加入 顯色液，觀察顯色結(jié)果，并同時對比陽性對照品的顯色結(jié)果，若顯色結(jié)果一致， 則說明待測樣品中含有赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒，若不一致，則說明待測樣品 中不含有赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒。
上述試劑盒還可以包含如下組分
(1) LAMP反應(yīng)液含有IX反應(yīng)緩沖液、0.2-2.0 mM dNTPs、 0 1.4 M甜菜堿和0 12 mM MgS04，優(yōu)選含有IX反應(yīng)緩沖液、1.2 mM dNTPs、 0.8 M甜菜堿和6 mM MgS04;
(2) Bst DNA聚合酶。
因為本發(fā)明的赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒為RNA病毒，所以在試劑盒的制 備時，配置有RT和核酸提取的試劑，會更加方便試驗進(jìn)展，如Trizol、氯仿 (也可自備)、異丙醇(也可自備)、70%乙醇(也可自備)、無RNase水、RT 反應(yīng)液和反轉(zhuǎn)錄酶，其中，RT反應(yīng)液含有ImM dNTPs、 10mg/L堿基隨即引物和8U反轉(zhuǎn)錄酶，反轉(zhuǎn)錄酶可選擇本領(lǐng)域做RT實驗時常用的反轉(zhuǎn)錄酶，如 反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV等。
本發(fā)明的快速診斷試劑盒里還可以包括一個泡沬板，泡沫板的設(shè)計可以
為其大小與本發(fā)明試劑盒的底面相同，泡沫板上有不少于試劑盒中所裝試劑 小管數(shù)量的小孔，這樣試劑盒中所用試劑分裝成的小管可以分別對應(yīng)放置于這 些小孔中，從而使得試劑都能處于小管的下部，方便取用和吸取，也可以使取 用時殘留在管壁上的液體自動回到管底，節(jié)約試劑。 上述快速診斷試劑盒的生產(chǎn)工藝，包括如下步驟
1、 將內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化后，定量配制，濃度檢測， 分裝后抽樣質(zhì)檢；
2、 將Trizol分裝后抽樣質(zhì)檢；
3、 將氯仿無菌分裝，抽樣質(zhì)檢；
4、 將異丙醇無菌分裝，抽樣質(zhì)檢；
5、 將70%乙醇無菌分裝，抽樣質(zhì)檢；
6、 將無RNase水無菌分裝，抽樣質(zhì)檢；
7、 將RT反應(yīng)液無菌分裝，抽樣質(zhì)檢；
8、 將LAMP反應(yīng)液無菌分裝，抽樣質(zhì)檢；
9、 將逆轉(zhuǎn)錄酶無菌分裝，抽樣質(zhì)檢；
10、 將Bst DNA聚合酶無菌分裝，抽樣質(zhì)檢；
11、 將顯色液無菌分裝，抽樣質(zhì)檢；
12、 將陽性對照標(biāo)本制備，分裝，抽樣質(zhì)檢；
13、 準(zhǔn)備帶有小孔的泡沫板；14、組裝試劑盒。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
1. 引物設(shè)計是LAMP技術(shù)的關(guān)鍵所在，對于引物設(shè)計有許多的要求，如
各個引物之間的距離、Tm值以及引物末端穩(wěn)定性等，因此從200 300個堿基 的靶序列中設(shè)計四條符合要求的引物存在很大的難度，而本發(fā)明根據(jù)靶基因序 列設(shè)計了一種赤點石斑魚祌經(jīng)壞死病毒檢測用引物組，能特異性識別靶序列上 的六個獨(dú)立區(qū)域，在BW DNA聚合酶的作用下啟動循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在靶標(biāo) DNA區(qū)啟動互補(bǔ)鏈合成，在同一鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰 菜結(jié)構(gòu)的莖-環(huán)DNA混合物，由于LAMP技術(shù)只有在四條引物完全識別靶序 列六個結(jié)合區(qū)的情況下才能順利進(jìn)行，所以本發(fā)明的引物組在很大程度上減少 了擴(kuò)增反應(yīng)的背景影響，大大改善了赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒檢測的特異性；
2. 采用本發(fā)明的引物組對赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒進(jìn)行檢測，因為高特異 性，所以可以根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷目標(biāo)基因的存在與否，從而能夠確定樣品 是否感染RGNNV;
3. 本發(fā)明的快速診斷試劑盒是利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)快速檢測赤點石 斑魚神經(jīng)壞死病毒，檢測靈敏度高，擴(kuò)增模板僅需IO拷貝或更少；
4. 本發(fā)明的快速診斷試劑盒不但反應(yīng)條件溫和，而且所需儀器簡單，也不 需要特殊試劑，克服了傳統(tǒng)PCR固有的檢測時間長、容易污染及檢測成本高 等缺點；
5. 本發(fā)明的快速診斷試劑盒擴(kuò)增快速且高效，在不到1小時即可完成擴(kuò)增， 且產(chǎn)率高；
6. 本發(fā)明的快速診斷試劑盒鑒定簡便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg^結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物一焦磷酸鎂沉淀，可通過肉眼觀察鑒定， 并且加入顯色液后，陰陽性結(jié)果顯色差異顯著，驗證率高，更加明顯可靠；
7. 本發(fā)明的快速診斷試劑盒操作簡單，對檢測人員的技術(shù)素質(zhì)要求較低， 可建立成本低廉的快速篩選體系，實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測；
8. 本發(fā)明的快速診斷試劑盒建立了一套經(jīng)過優(yōu)化的反轉(zhuǎn)錄一環(huán)介導(dǎo)等溫 擴(kuò)增反應(yīng)(RT—LAMP)體系，不但使得赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒定性檢測更 加簡便快速、特異性高、靈敏度高，而且可用于魚類養(yǎng)殖過程中各時期的赤點 石斑魚神經(jīng)壞死病毒跟蹤檢測，避免病毒傳播流行，提高科學(xué)管理效率，具有 很高的實用價值。


圖1為實施例1待測樣品的RT-PCR檢測結(jié)果電泳其中，M為Marker DL2000， 1為陽性對照，2 9為含有赤點石斑魚神經(jīng) 壞死病毒的陽性魚，10 11為不含有赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒的健康魚，12 為陰性對照；
圖2為實施例4的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物電泳其中，M為Marker, 1為陽性對照，2為待測樣品的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物，3 為陰性對照。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步地闡述，但具體實施例并不對本發(fā) 明做任何限定。
實施例1 赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒檢測用引物組及有效性檢測
本實施例根據(jù)已公開的赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒基因組序列，選取赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒基因的特異性序列，然后分析設(shè)計出可用于LAMP檢測技 術(shù)的，能專一性鑒別赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒的特異性引物組，該引物組由如 下四條引物組成
內(nèi)引物FIP，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示； 內(nèi)引物BIP，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示； 外引物F3，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示； 外引物B3，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。
本實施例選擇已經(jīng)由RT-PCR檢測的8條陽性魚和2條健康魚(如圖1所 示)，然后分別提取這10條魚的腦組織的RNA進(jìn)行上述赤點石斑魚神經(jīng)壞死 病毒檢測用引物組的有效性。
首先將上述引物組中的四條引物送去生物公司合成，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 將10條魚的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，接著用赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒檢測用引 物組的四條弓I物分別對10條魚的cDNA進(jìn)行LAMP檢測，LAMP反應(yīng)體系為 0.8 uM FIP、 0.8 uM BIP、 0.2 uM F3、 0.2 uM B3、 18 uL LAMP反應(yīng)、液 (含有1X反應(yīng)緩沖液、1.2 mM dNTPs、 0.8 M甜菜堿和6 mM MgS04) 和8 U Bst DNA聚合酶，1 uL模板cDNA， 65。C恒溫反應(yīng)60min，反應(yīng)結(jié) 束后向各反應(yīng)管中加入SYBR Green I，其中有8個管的顏色變?yōu)榇渚G色，2 個管沒有顏色變化依然是橘紅色，對比RT-PCR的檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)顏色變?yōu)榇?綠色的8個管正是陽性魚，而沒有顏色變化的正好是正常魚，由此說明本發(fā)明 的赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒檢測用弓i物組可以準(zhǔn)確、特異性地檢測出赤點石斑 魚神經(jīng)壞死病毒。實施例2快速診斷試劑盒的制備
本實施例的快速診斷試劑盒可用于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)快速診斷樣品中 是否含有赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒，該試劑盒由赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒檢測 用引物組、LAMP反應(yīng)液、BstDNA聚合酶、陽性對照品、顯色液和泡沫板組
成，其中
(1) 赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒檢測用引物組采用DNA合成儀，l管， 內(nèi)裝外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP和內(nèi)引物BIP，內(nèi)引物FIP，其核苷 酸序列如SEQ ID NO:l所示；內(nèi)引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所 示；外引物F3，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；外引物B3，其核苷酸序 列如SEQIDNO:4所示，以上4種引物濃度分別為10uM;
(2) 配置LAMP反應(yīng)液含有1X反應(yīng)緩沖液、1.2mMdNTPs、 0.8 M Betaine、 6mMMgS04， 1管；
(3) 購置BstDNA聚合酶，置于容器，l管；
(4) 制備陽性對照品提取含赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒基因的質(zhì)粒DNA， 置于容器，l管；
(5) 購置顯色液SYBRGreenI，置于容器，l管；
(6) —塊泡沫板，其大小與長方體盒子的底面相同，高2.4cm，有三排孔， 第一排五個孔，孔徑1.4cm，第二排六個孔，孔徑l.l cm，第三六個孔，孔徑 0.7 cm。
將上述6個小管分別對應(yīng)放置于泡沫板的孔內(nèi)，裝于盒中即制備得到本實 施例的快速診斷試劑盒。
本實施例快速診斷試劑盒的生產(chǎn)工藝，包括如下步驟1、 將內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化后，定量配制，濃度檢測， 分裝后抽樣質(zhì)檢；
2、 將LAMP反應(yīng)液無菌分裝，抽樣質(zhì)檢；
3、 將Bst DNA聚合酶無菌分裝，抽樣質(zhì)檢；
4、 將SYBR Green I無菌分裝，抽樣質(zhì)檢；
5、 將陽性對照標(biāo)本制備，分裝，抽樣質(zhì)檢；
5、 準(zhǔn)備帶有小孔的泡沫板；
6、 組裝試劑盒。
實施例3快速診斷試劑盒的制備
本實施例的快速診斷試劑盒可用于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)快速診斷樣品中 是否含有赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒，該試劑盒由赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒檢測 用引物組、LAMP反應(yīng)液、BstDNA聚合酶、陽性對照品、顯色液、Trizol、 氯仿、異丙醇、70%乙醇、無RNase水、RT反應(yīng)液、反轉(zhuǎn)錄酶和泡沫板組成， 其中
(1)赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒檢測用引物組采用DNA合成儀，1管， 內(nèi)裝外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP和內(nèi)引物BIP，內(nèi)引物FIP，其核苷 酸序列如SEQ ID NO:l所示；內(nèi)引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所 示；外引物F3，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；外引物B3，其核苷酸序 列如SEQIDNO:4所示，以上4種引物濃度分別為10uM;
(2) 配置LAMP反應(yīng)液含有1X反應(yīng)緩沖液、1.2mMdNTPs、 0.8 M Betaine、 6mMMgS04， 1管；
(3) 購置BstDNA聚合酶，置于容器，l管；(4) 制備陽性對照品提取含神經(jīng)壞死病毒外殼蛋白基因的質(zhì)粒DNA， 置于容器，l管；
(5) 購置顯色液SYBRGreenI，置于容器，l管；
(6) 購置Trizol，置于容器，5ml/管，2管；
(7) 購置氯仿，置于容器，2ml， l管；
(8) 購置異丙醇，置于容器，5ml， l管；
(9) 制備70%乙醇，置于容器，5ml/管，2管；
(10) 制備無RNase水，置于容器，0.5ml/管，1管；
(11) 配置RT反應(yīng)液含有1X反應(yīng)緩沖液、lmMdNTPs、 10mg/L堿 基隨即引物、8URNA酶抑制劑，置于容器，O.lml/管，1管；
(12) 購置反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV，置于容器，l管；
(13) —塊泡沫板，其大小與長方體盒子的底面相同，高2.4cm，有三排 孔，第一排五個孔，孔徑1.4cm，第二排六個孔，孔徑l.l cm，第三六個孔， 孔徑0.7 cm。
將上述14個小管分別對應(yīng)放置于泡沫板的孔內(nèi)，裝于盒中即制備得到本實 施例的快速診斷試劑盒。
本實施例快速診斷試劑盒的生產(chǎn)工藝，包括如下步驟
1、 將內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化后，定量配制，濃度檢測， 分裝后抽樣質(zhì)檢；
2、 將Trizol分裝后抽樣質(zhì)檢；
3、 將氯仿無菌分裝，抽樣質(zhì)檢；
4、 將異丙醇無菌分裝，抽樣質(zhì)檢；5、 將70%乙醇無菌分裝，抽樣質(zhì)檢；
6、 將無RNase水無菌分裝，抽樣質(zhì)檢；
7、 將RT反應(yīng)液無菌分裝，抽樣質(zhì)檢；
8、 將LAMP反應(yīng)液無菌分裝，抽樣質(zhì)檢；
9、 將反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV無菌分裝，抽樣質(zhì)檢；
10、 將Bst DNA聚合酶無菌分裝，抽樣質(zhì)檢；
11、 將SYBR Green I無菌分裝，抽樣質(zhì)檢；
12、 將陽性對照標(biāo)本制備，分裝，抽樣質(zhì)檢；
13、 準(zhǔn)備帶有小孔的泡沫板；
14、 組裝試劑盒。
實施例4赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒快速診斷試劑盒的應(yīng)用
本實施例采用實施例2制備所得試劑盒，采用LAMP技術(shù)對待測樣品是 否含有赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒進(jìn)行快速檢測，其具體步驟如下
(1) 向勻漿器中加入赤點石斑魚腦組織，并加入約待測樣品10倍體積的 Trizol液稀釋，冰浴勻漿，室溫靜置3min;
(2) 向上述勻漿液中加入200ul氯仿，上下顛倒混勻，室溫靜置5min; (3 ) 4。C ， 12000r/min離心1 Omin;
(4) 取300lU上清，加入等體積異丙醇，輕輕晃動后，室溫靜置10min;
(5) 4°C， 12000r/min離心10min;
(6) 棄上清，用lml預(yù)冷的70%乙醇洗滌2次，4°C ， 10000r/min離心5min;
(7) 空氣干燥，加20-50ul無RNase水溶解，得到RNA提取液；
(8) 將上述RNA提取液在65。C溫育5min，立即置于冰上冷卻；(9) 取2ul冷卻后的RNA提取液，0.5 P 1反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV， 一起加入 到7.5ulRT反應(yīng)液中，37°C孵育lh;然后95。C處理5min，得到LAMP反應(yīng) 模板；
(10) 按照LAMP反應(yīng)體系為0.8uMFIP、 0.8uMBIP、 0.2uMF3、 0.2uM B3、 18 uL LAMP反應(yīng)液、8 U Bst DNA聚合酶、1 uL模板cDNA，將模板 cDNA、引物、BstDNA聚合酶和LAMP反應(yīng)液等混合到反應(yīng)管中，混勻后離 心數(shù)秒，置于PCR儀中，65"C反應(yīng)1小時，然后8(TC， 10min， 4°C保存；
(11) 反應(yīng)結(jié)束后在反應(yīng)管和陽性對照管中分別加入1 P 1SYBR Green I， 混勻后，陽性對照管中顏色為翠綠色，而反應(yīng)管中的顏色也為翠綠色，說明本 實施例的待測樣品含有赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒；
(12) LAMP反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物和陽性對照一起進(jìn)行瓊脂糖凝膠電 泳，20分鐘后于紫外儀上觀察，同時也做一個陰性對照(不含有赤點石斑魚 神經(jīng)壞死病毒)，電泳結(jié)果如圖2所示，可以看出陽性對照出現(xiàn)階梯狀反應(yīng)條 帶，LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的電泳帶和陽性對照一樣，陰性對照無條帶出現(xiàn)，說明待 測樣品中含有赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒。
上述電泳結(jié)果和顯色反應(yīng)結(jié)果是一致的，說明本發(fā)明的快速診斷試劑盒可 準(zhǔn)確、特異性地檢測赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒。一種赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒檢測用引物組、檢測方法和快速診斷試劑盒序列表 SEQUENCE LISTING
<110>中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所
〈120> —種赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒檢測用引物組、檢測方法和快速診斷試劑盒
〈130〉
<160> 4
<170〉 Patentln version 3.5
<210〉 1
<211〉 39
<212〉 DNA 〈213>人工序列
<400> 1
acgagttgct tgaagcgcgt cctggcttcc tgcctgatc 39
〈210> 2
<211〉 40
<212〉 DNA 〈213〉人工序列
<400> 2
ggtgggaaag cagaacagtc cgctcctttc ccgacgaggt 40
<210〉 3
<211〉 18
<212〉 腿 〈213〉人工序列
<400> 3
aatgtgcccc gcaaacac 18
<210〉 4
<211〉 18
<212〉 DNA
〈213> 人工序列
<400> 4
cgaccaggtg acgtgaga 18
權(quán)利要求
1、一種赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒檢測用引物組，其特征在于該引物組由如下四條引物組成內(nèi)引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示；內(nèi)引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示；外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO3所示；外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO4所示。
2、 一種赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒的檢測方法，其特征在于該方法是利用 權(quán)利要求1所述引物組通過常規(guī)LAMP反應(yīng)和反應(yīng)后的顯色反應(yīng)，對待測樣 品中是否含有赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒進(jìn)行檢測。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測方法，其特征在于所述LAMP反應(yīng)的反應(yīng)體系 為0.8uMFIP、 0.8uMBIP、 0.2uMF3、 0.2uMB3、 18 uL LAMP反應(yīng)液、8U BstDNA聚合酶和luL模板cDNA，所述LAMP反應(yīng)液含有1 X反應(yīng)緩沖液、 0.2~2.0 mM dNTPs、 0~1.4M甜菜堿和0 12 mM MgS04。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述檢測方法，其特征在于所述LAMP反應(yīng)液含有1 X反應(yīng)緩沖液、1.2 mM dNTPs、 0.8 M甜菜堿和6 mM MgS04。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測方法，其特征在于所述LAMP反應(yīng)的反應(yīng)溫 度為58 68"C，反應(yīng)時間為40 70min。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述檢測方法，其特征在于所述LAMP反應(yīng)的反應(yīng)溫 度為65"C，反應(yīng)時間為60min。
7、 一種赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒快速診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒 包含如下組分(1)赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒檢測用引物組內(nèi)引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:l所示；內(nèi)引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；外 引物F3，其核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示；外引物B3，其核苷酸序列如 SEQ ID NO:4所示；(2) 陽性對照品含有赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒外殼蛋白基因的質(zhì)粒；(3) 顯色液SYBR Green I或EvaGreen。
8、根據(jù)權(quán)利要求7所述診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒還包含如下組分(1 ) LAMP反應(yīng)液含有l(wèi) X反應(yīng)緩沖液、0.2~2.0 mM dNTPs、 0~1.4 M甜 菜堿和0 12uMMgSO4，所述lX反應(yīng)緩沖液含有20mMpH8.8的Tris-HCl、 10 mM KC1 、 10 mM (NH4)2S04、 2 mM MgS04和0.1 % Triton X-100; (2) Bst DNA聚合酶。
9、根據(jù)權(quán)利要求8所述診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒還包含如下組分(1) Trizol;(2) RT反應(yīng)液含有1X反應(yīng)緩沖液、ImM dNTPs、 10 mg/L隨機(jī)引物 和8U反轉(zhuǎn)錄酶。
全文摘要
本發(fā)明公開一種赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒檢測用引物組、檢測方法和快速診斷試劑盒，該引物組由如下四條引物組成內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP、外引物F3和外引物B3。本發(fā)明的引物組和試劑盒均可高效高特異性地檢測赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒，它們均是基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)，應(yīng)用六個區(qū)段，四條引物，一個恒定溫度，在不到1小時即可完成擴(kuò)增反應(yīng)，檢測成本低、耗時短、產(chǎn)率高，特異性高，且陰陽性結(jié)果顯色差異顯著，驗證率高，更加明顯可靠。本發(fā)明的試劑盒建立了一套經(jīng)過優(yōu)化的反轉(zhuǎn)錄—環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)體系，可用于魚類養(yǎng)殖過程中各時期的赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒跟蹤檢測，避免病毒傳播流行，提高科學(xué)管理效率，具有很高的實用價值。
文檔編號C12N15/11GK101591714SQ20091003953
公開日2009年12月2日 申請日期2009年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月6日
發(fā)明者娟 馮, 區(qū)又君, 蘇友祿, 許海東, 郭志勛 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所