專利名稱：一種K-Ras基因突變分型熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)基因突變的熒光定量PCR試劑盒 及其檢測(cè)方法，特別涉及一種K-Ras基因突變分型熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
Ras癌基因參與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展，最初是在急性轉(zhuǎn)化性逆轉(zhuǎn)錄病毒實(shí)驗(yàn)中從 Harvey、Kirsten兩株大鼠肉瘤病毒中克隆出來(lái)的轉(zhuǎn)化基因，自1982年Weinberg等人發(fā) 現(xiàn)人的膀胱癌細(xì)胞中有活化的H-ras基因后，引起了人們對(duì)ras癌基因在人類腫瘤發(fā)生發(fā) 展過(guò)程中所起的作用的極大關(guān)注。ras基因家族與人類腫瘤相關(guān)的基因有三種——H-ras, K-ras和N-ras，分別定位在11、12和1號(hào)染色體上。其中，K-Ras則對(duì)人類癌癥影響最大， 它好像分子開關(guān)當(dāng)正常時(shí)能控制調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的路徑；發(fā)生異常時(shí)，則導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)生 長(zhǎng)，并阻止細(xì)胞自我毀滅。研究人員發(fā)現(xiàn)K-Ras蛋白并不是永遠(yuǎn)位于細(xì)胞膜上，它的位置受 到蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的控制。他們發(fā)現(xiàn)PKC使磷酸分子與K_Ras結(jié)合即 磷酸化，這種磷酸化過(guò)程導(dǎo)致K-Ras與細(xì)胞膜的結(jié)合減弱而改變位置，并移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾 基體和粒線體等位置。K-Ras 基因突變不但導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC, 30%由K-Ras基因突變引起)，還誘發(fā)結(jié)腸癌和胰腺癌。KRAS基因突變發(fā)生在腫瘤惡變 的早期，并且原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的KRAS基因高度保持一致。大腸癌患者KRAS突變率為 30%-35%,而沒有發(fā)生突變的正常kras基因占大多數(shù)，約60%。所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患 者都應(yīng)檢測(cè)KRAS基因狀態(tài)，只有KRAS野生型患者才建議接受EGFR抑制劑治療。一是所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者都應(yīng)檢測(cè)KRAS基因狀態(tài)，二是只有KRAS野生型患 者才建議接受EGFR抑制劑如西妥昔單抗和帕尼單抗(包括單藥或與化療聯(lián)合)治療。那 么，KRAS對(duì)臨床實(shí)踐的影響究竟有多大？美國(guó)喬治敦大學(xué)馬歇爾一言以蔽之在結(jié)直腸癌 的治療中，結(jié)直腸癌從此“一分為二”:KRAS基因是野生型還是突變型，使傳統(tǒng)意義上的一種 疾病被分成兩種獨(dú)立的疾病。KRAS突變型結(jié)直腸癌患者約占40 %，這類患者不能從抗EGFR 治療中獲益，反而徒增不良反應(yīng)危險(xiǎn)和治療費(fèi)用；而其余60%左右的KRAS野生型患者就很 有可能從這類藥物治療中獲益。靶向治療已經(jīng)成為腫瘤臨床治療的重要手段。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)是靶向 治療的主要作用靶點(diǎn)。FDA已經(jīng)批準(zhǔn)的作用于EGFR的靶向藥物包括抗EGFR單克隆抗體藥愛 必妥(Erbitux/ 西妥西單抗 /Cetuximab，默克)、帕尼單抗(Panitumumab/Vectibix, Amgen 和尼妥珠單抗(Nimotuzumab)，以及EGFR酪氨酸激酶抑制劑易瑞沙(Iressa/吉非替尼/ Gefitinib，阿斯利康)和特羅凱(Tarceva/厄羅替尼/Erlotinib，羅氏制藥)。但是，臨床 試驗(yàn)表明這些靶向藥物僅對(duì)部分病人有顯著療效。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中KRAS基 因發(fā)生突變(體細(xì)胞突變)的病人對(duì)此類靶向藥物完全耐藥。因此，檢測(cè)病人KRAS基因是 否突變成為決定能否使用EGFR靶向藥物的必要前提條件。
目前，檢測(cè)K-Ras基因突變的方法是傳統(tǒng)的直接測(cè)序法。直接測(cè)序法的結(jié)果雖然 具有客觀性和特異性，但是它卻存在以下缺點(diǎn)1、檢測(cè)周期長(zhǎng)(從標(biāo)本送檢到得出結(jié)果最短要24-48個(gè)小時(shí)左右)。2、操作過(guò)程復(fù)雜，且要涉及到PCR擴(kuò)增后的操作，因此易被污染，造成結(jié)果的不理
術(shù)g
；o3、測(cè)序結(jié)果的判讀較復(fù)雜、費(fèi)時(shí)(當(dāng)樣本量大時(shí)，此點(diǎn)尤為突出)。4、檢測(cè)的敏感性不夠高KatSuhiko等人曾在2005年8月份出版的《Lung Cancer))(《肺癌》)上報(bào)道，如果突變基因的含量占基因組DNA總量的10%以下時(shí)，則用直 接測(cè)序法檢測(cè)不到突變樣本的存在。5、一次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的樣本量有限，最多只能8-24例。6、不安全整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程要用到多種有毒物質(zhì)，如EB、丙烯酰胺等，對(duì)操作者和環(huán) 境都有危害。7.費(fèi)用較高(每個(gè)位點(diǎn)約需200元)。

發(fā)明內(nèi)容
為克服上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明的目的之一是提供一種K-Ras基因突變分型熒光定 量PCR檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的K-Ras基因突變分型熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，包括PCR混合反應(yīng)液、肽 核酸(PNA)探針、突變型KRas-Allglo 熒光探針和陽(yáng)性對(duì)照樣品。所述肽核酸探針的序列如SEQ ID NO AO所示SEQ ID NO AO :PNA probe-5，-CCTACGCCACCAGCTCC-3，。所述PCR混合反應(yīng)液中含PCR正向引物和PCR反向引物，所述PCR正向引物的序 列如SEQ ID NO A1所示，所述PCR反向引物的序列如SEQ ID NO A2所示SEQ ID NO A1 :5，-TTA GCT GTA TCG TCA AGG CAC TC-3，；SEQ ID NO A2 :5，-GCC TGC TGA AAA TGA CTG AAT ATA-3，。所述突變型KRas-Allglo 熒光探針包括如 SEQ ID NO A3、SEQ ID N0A4、SEQ ID NO A5、SEQ ID NO B3、SEQ ID NO B4、SEQ ID NO B5、SEQ IDN0 B6 所示的序列中的一種或 多種SEQ ID NO A3 (GAT-12 密碼子)SEQ ID NO A4 (GTT-12 密碼子)SEQ ID NO A5 (GCT-12 密碼子)SEQ ID NO B3 (GAC-13 密碼子)SEQ ID NO B4 (TGT-12 密碼子)SEQ ID NO B5 (AGT-12 密碼子)SEQ ID NO B6 (CGT-12 密碼子)
5’ -MAR-TGGAGCTGATGGCG-MAR-3‘； 5， -JUP-GTTGGAGCTGTTGGCGT-JUP-3' 5， -SAT-TGGAGCTGCTGGCGT-SAT-3，； 5’ -MAR-AGCTGGTGACGTAGGC-MAR-3' 5，-JUP-GTTGGAGCTTGTGGCGT-JUP-3' 5’ -URA-TGGAGCTAGTGGCGT-URA-3‘； 5， -SAT-TTGGAGCTCGTGGCGT-SAT-3，當(dāng)所述突變型KRas-Allglo 熒光探針包括如SEQ ID NO A3,SEQ ID N0A4、SEQ ID NO A5所示的序列中的一種或多種時(shí)，所述陽(yáng)性對(duì)照樣品是存在K-Ras基因第12號(hào)密碼子 三種突變類型(GAT，GTT和GCT)的混合質(zhì)?；蚪MDNA。該突變型KRas-Allglo 熒光探針 檢測(cè)的是K-Ras基因第12密碼子三種堿基置換突變(GGT — GAT，GGT — GTT，GGT — GCT)。
當(dāng)所述突變型KRas-Allglo 熒光探針包括如SEQ ID NO B3、SEQ ID N0B4、SEQ ID NO B5和SEQ ID NO B6所示的序列中的一種或多種時(shí)，所述陽(yáng)性對(duì)照樣品是存在K_Ras基因 第13號(hào)密碼子一種突變類型(GAC)和第12密碼子三種突變型(TGT、AGT和CGT)的混合質(zhì) ?；蚪MDNA。該突變型KRas-Allglo 熒光探針檢測(cè)的是K_Ras基因第13密碼子一種堿 基置換突變(密碼子13GGC — GAC)，第12密碼子三種堿基置換突變(密碼子12GGT — TGT， GGT — TGT 禾口 GGT — CGT)。 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種K-Ras基因突變分型熒光定量PCR檢測(cè)方法。該 方法具體是先針對(duì)K-Ras基因設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物和肽核酸探針，針對(duì)K-Ras基因突變位點(diǎn) 分別設(shè)計(jì)Allglo 熒光探針，反應(yīng)體系中加入PCR反應(yīng)液、PCR引物、肽核酸探針和Allglo 熒光探針進(jìn)行熒光定量PCR的檢測(cè)。所述的肽核酸探針的序列如SEQ ID NO AO所示SEQ ID NO AO :PNA probe-5，-CCTACGCCACCAGCTCC-3，。所述的PCR 引物如 SEQ ID NO A1 和 SEQ ID NO A2 所示SEQ ID NO A1 :5，-TTA GCT GTA TCG TCA AGG CAC TC-3，；SEQ ID NO A2 :5，-GCC TGC TGA AAA TGA CTG AAT ATA-3，。所述的Allglo 熒光探針包括如 SEQ ID NO A3,SEQ ID NO A4、SEQ ID N0A5、SEQ ID NO B3、SEQ ID NO B4、SEQ ID NO B5 和 SEQ ID NO B6 所示的序列中的一種或多種。SEQ ID NO A3 (GAT-12 密碼子)SEQ ID NO A4 (GTT-12 密碼子)SEQ ID NO A5 (GCT-12 密碼子)SEQ ID NO B3 (GAC-13 密碼子)SEQ ID NO B4 (TGT-12 密碼子)SEQ ID NO B5 (AGT-12 密碼子)SEQ ID NO B6 (CGT-12 密碼子)
5’ -MAR-TGGAGCTGATGGCG-MAR-3‘； 5， -JUP-GTTGGAGCTGTTGGCGT-JUP-3' 5， -SAT-TGGAGCTGCTGGCGT-SAT-3，； 5’ -MAR-AGCTGGTGACGTAGGC-MAR-3' 5，-JUP-GTTGGAGCTTGTGGCGT-JUP-3' 5’ -URA-TGGAGCTAGTGGCGT-URA-3‘； 5， -SAT-TTGGAGCTCGTGGCGT-SAT-3，其中，SEQID NO A3、SEQ ID NO A4、SEQ ID NO A5 是檢測(cè) K-Ras 基因第 12 密碼 子三種堿基置換突變(GGT — GAT, GGT — GTT, GGT — GCT) ；SEQ IDN0 B3、SEQ ID NO B4、 SEQ ID NO B5和SEQ ID NO B6是檢測(cè)K-Ras基因第13密碼子一種堿基置換突變(密碼 子13GGC — GAC)，第12密碼子三種堿基置換突變(密碼子12GGT — TGT，GGT — AGT和 GGT — CGT)。Allglo 熒光探針SEQ ID NO A3的5'和3，端均標(biāo)記MAR(熒光報(bào)告/淬滅基 團(tuán))；Allglo 熒光探針SEQ ID NO A4的5'和3，端均標(biāo)記JUP(熒光報(bào)告/淬滅基團(tuán))； Allglo 熒光探針SEQ ID NO A5的5'和3，端均標(biāo)記SAT (熒光報(bào)告/淬滅基團(tuán))。Allglo 熒光探針SEQ ID NO B3的5'和3，端均標(biāo)記MAR(熒光報(bào)告/淬滅基團(tuán))；Allglo 熒光 探針SEQ ID NO B4的5'和3，端均標(biāo)記JUP(熒光報(bào)告/淬滅基團(tuán))；Allglo 熒光探針 SEQ ID NO B5的5'和3，端均標(biāo)記URA(熒光報(bào)告/淬滅基團(tuán))。Allglo 熒光探針SEQ ID NO B6的5'和3，端均標(biāo)記SAT(熒光報(bào)告/淬滅基團(tuán))。優(yōu)選的，反應(yīng)體系之一包括(l)PCR混合反應(yīng)液、(2)肽核酸(PNA)探針、(3)突變 型KRas-Allglo 熒光探針和⑷陽(yáng)性對(duì)照樣品。該體系檢測(cè)的是K-Ras基因第12密碼子 三種堿基置換突變(GGT — GAT, GGT — GTT, GGT — GCT)。
其中，(1) PCR混合反應(yīng)液中含PCR正向引物和PCR反向引物，PCR正向引物的序列 如 SEQ ID NO A1 所示:SEQ ID NO A1 :5，_TTA GCT GTA TCGTCAAGG CAC TC_3，;PCR 反向引 物的序列如SEQ ID NO A2所示:SEQ ID N0A2 :5，_GCC TGC TGA AM TGA CTG AAT ATA-3，。(2)肽核酸探針抑制K-Ras基因突變區(qū)野生型基因擴(kuò)增的PNA序列，其序列如SEQ ID NO AO 所示:SEQ ID NO AO :PNA probe-5，-CCTACGCCACCAGCTCC-3，。(3)突變型 KRas-Allglo 熒光探針包括如 SEQ ID NO A3、SEQ ID N0A4、SEQ ID NO A5所示的序列SEQ ID NO A3 (GAT-12 密碼子)5，-MAR-TGGAGCTGATGGCG-MAR-3，；SEQ ID NO A4 (GTT-12 密碼子)5，-JUP-GTTGGAGCTGTTGGCGT-JUP-3，；SEQ ID NO A5 (GCT-12 密碼子)5，-SAT-TGGAGCTGCTGGCGT-SAT-3，；(4)陽(yáng)性對(duì)照樣品是存在K-Ras基因第12號(hào)密碼子三種突變類型(GAT，GCT和 GTT)的混合質(zhì)?；蚪MDNA。優(yōu)選的，反應(yīng)體系也可以為包括(l)PCR混合反應(yīng)液、⑵肽核酸(PNA)探針、(3) 突變型KRas-Allglo 熒光探針和⑷陽(yáng)性對(duì)照樣品。該體系檢測(cè)的是K-Ras基因第13密 碼子一種堿基置換突變(密碼子13GGC — GAC)，第12密碼子三種堿基置換突變(密碼子 12GGT — TGT, GGT — AGT 和 GGT — CGT)。其中，(1) PCR混合反應(yīng)液中含PCR正向引物和PCR反向引物，PCR正向引物的序列 如 SEQ ID NO A1 所示:SEQ ID NO A1 :5，_TTA GCT GTA TCGTCAAGG CAC TC_3，;PCR 反向引 物的序列如 SEQ ID NO A2所示:SEQ ID N0A2 :5，_GCC TGC TGA AM TGA CTG AAT ATA-3' (2)肽核酸探針的序列如SEQ ID NO AO所示SEQ ID NO AO :PNA probe-5' -CCTACGCCACCAGCTCC-3’。(3)Allglo 熒光探針包括如 SEQ ID NO B3、SEQ ID NO B4、SEQ ID N0B5、SEQ ID NO B6所示的序列SEQ ID NO B3 (GAC-13 密碼子)5，-MAR-AGCTGGTGACGTAGGC-MAR-3，；SEQ ID NO B4 (TGT-12 密碼子)5，-JUP-GTTGGAGCTTGTGGCGT-JUP-3，；SEQ ID NO B5 (AGT-12 密碼子)5，-URA-TGGAGCTAGTGGCGT-URA-3，；SEQ ID NO B6 (CGT-12 密碼子)5，-SAT-TTGGAGCTCGTGGCGT-SAT-3，；(4)陽(yáng)性對(duì)照樣品是存在K-Ras基因第13號(hào)密碼子一種突變類型(GAC)和第12 密碼子三種突變型(TGT，AGT和CGT)的混合質(zhì)?；蚪MDNA。優(yōu)選的，反應(yīng)體系為15 u 1,PCR引物各0. 15 ill (終濃度20 u M), Allglo 熒光探 針探針各0. 2 ill (終濃度20 ii M)，PNA探針0. 3 ill (終濃度20 y M)，模板DNA 2. 5 u 1 (終 濃度 100-300ng/u 1), PCR 反應(yīng)液 7. 5 yl，加入 ddH20 至 15 yl。綜合Allglo 探針的優(yōu)勢(shì)和定量PCR技術(shù)特點(diǎn)，與PCR-SSCP測(cè)序等方法比較，本 技術(shù)用PNA增敏的FQ-PCR檢測(cè)K-Ras基因的突變具有以下優(yōu)勢(shì)1、特異性強(qiáng)設(shè)計(jì)的Allglo 探針分別針對(duì)KRAS基因第12和第13密碼子的七種 特異突變序列，能特異的與PCR擴(kuò)增的特異突變產(chǎn)物雜交；Allglo 探針提高TM值(可高 達(dá)10°C以上)，可以抑制非特異性PCR產(chǎn)物擴(kuò)增；另外本發(fā)明技術(shù)在PCR反應(yīng)液中加入野生 型K-Ras基因肽核酸序列(PNA)，通過(guò)抑制野生型基因組產(chǎn)物擴(kuò)增而富集突變型擴(kuò)增，也提 高檢測(cè)的特異性；
2、檢測(cè)敏感性高本發(fā)明技術(shù)在PCR反應(yīng)液中加入野生型K-Ras基因肽核酸序列 (PNA)，通過(guò)抑制野生型產(chǎn)物擴(kuò)增富集突變型擴(kuò)增，提高檢測(cè)敏感性；由于探針更短，可以達(dá) 到15-16mer ；Allglo 探針兩端熒光即可相互粹滅，水解后又可報(bào)告熒光，也提高了檢測(cè)靈 敏度。本技術(shù)檢測(cè)K-Ras突變基因組DNA敏感度為(即突變基因組DNA達(dá)到基因總 DNA的即可檢出)；直接測(cè)序法檢測(cè)K-Ras突變基因組DNA敏感度為20-30% (即突變 基因組DNA達(dá)到基因總DNA的20-30%才能檢出)；表1列示不同檢測(cè)方法對(duì)結(jié)直腸癌組織 K-Ras基因突變檢測(cè)的靈敏度表 1 3、可以進(jìn)行KRAS突變型基因組定量檢測(cè)；測(cè)序和其它方法均不能實(shí)現(xiàn)對(duì)K-Ras基 因突變基因組的真正定量檢測(cè)；4、本技術(shù)對(duì)標(biāo)本DNA獲取的質(zhì)量要求較低，無(wú)論是石蠟組織還是新鮮組織，都能 取得理想的檢測(cè)結(jié)果；直接測(cè)序法一般需要新鮮冰凍組織，檢測(cè)步驟繁瑣送檢標(biāo)本-提取 DNA-定性PCR擴(kuò)增-驗(yàn)證PCR產(chǎn)物-純化PCR產(chǎn)物-直接測(cè)序；5、檢測(cè)時(shí)間短(從標(biāo)本送檢到得出結(jié)果可在3個(gè)小時(shí)以內(nèi)完成)；測(cè)序方法最快 需要24-48小時(shí)才能出結(jié)果；6、操作過(guò)程簡(jiǎn)單，并且從PCR反應(yīng)開始，就是在封閉的體系中完成擴(kuò)增和實(shí)時(shí)測(cè) 定，大大降低了污染的可能性，因此也就降低了結(jié)果偏差的幾率(比較如下所示)。7、結(jié)果判讀明確、直觀(比較如下所示)；若需要亦可對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析。直接 測(cè)序法結(jié)果的判讀需將測(cè)序峰形圖人工讀出序列，再將所讀出的序列結(jié)合基因庫(kù)中的原 始序列一起分析，從而得到結(jié)果，熒光定量PCR法結(jié)果的判讀在域值線以上有擴(kuò)增曲線的 標(biāo)本均為陽(yáng)性標(biāo)本，結(jié)果判讀非常簡(jiǎn)單，直觀。8、檢測(cè)的樣本量大，一次最多可檢測(cè)384例；直接測(cè)序法一次試驗(yàn)最多可檢測(cè) 8-12 例。9、安全整個(gè)體系中不包含有毒有害物質(zhì)，對(duì)操作員和環(huán)境都無(wú)危害。本發(fā)明的試劑盒能快速、準(zhǔn)確、高敏感度的檢測(cè)各種癌組織中K-Ras基因特定位 點(diǎn)突變。本發(fā)明采用了 PNA技術(shù)合成覆蓋K-Ras基因檢測(cè)位點(diǎn)(第12和13密碼子)的肽核酸序列，結(jié)合采用了最新發(fā)展的Allglo 熒光探針技術(shù)。肽核酸(PNA，Peptide Nucleic Acid)是近十幾年發(fā)展起來(lái)的以中性酰胺鍵為骨 架的脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid, DNA)類似物，以中性酰胺鍵為骨架并兼有多 肽和核酸性質(zhì)的獨(dú)特化合物，其特點(diǎn)是1、可以高度親和并序列特異地與DNA和RNA結(jié)合， 與核酸的雜交能力強(qiáng)于核酸間的雜交能力，形成的雜交復(fù)合物具有相當(dāng)高的熱穩(wěn)定性以及 獨(dú)特的耐離子強(qiáng)度變化性質(zhì)；2、熱穩(wěn)定性高于核酸間的雜交體；3、抗酶解能力極強(qiáng)，由于 其非肽和非核酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，蛋白酶和核酸酶均不能降解PNA。目前，PNA被廣泛用于化學(xué)、 生物學(xué)、反義藥物、分子識(shí)別、遺傳診斷等領(lǐng)域。它能夠與DNA和RNA特異性地結(jié)合從而可 以制備PNA探針，與DNA探針相比，其雜交的穩(wěn)定性和特異性增加且能在低鹽濃度下進(jìn)行雜 交，可大大提高微生物學(xué)檢測(cè)和醫(yī)療診斷的效率和靈敏度。Allglo 探針是美國(guó)AlleLogic Biosciences公司推出的最新一代熒光定量探 針，它擁有普通Taqman、Taqman-MGB及分子信標(biāo)(molecular beacon)探針?biāo)袃?yōu)點(diǎn)，去掉 了目前這幾種探針的最大弊端，能夠大大提高熒光定量PCR技術(shù)的研究和應(yīng)用。Allglo 探針打破傳統(tǒng)Taqman探針的一端報(bào)告基團(tuán)一端粹滅基團(tuán)的限制，利用美 國(guó)AlleLogic Biosciences公司生物化學(xué)專家大量研究開發(fā)的、獲得美國(guó)專利技術(shù)的幾種 常用波長(zhǎng)的特制熒光染料，該系列染料標(biāo)記在oligo上面互相互為報(bào)告及粹滅基團(tuán)，而且 上面含有特殊的可以大大提高TM值的化學(xué)基團(tuán)，可以大大提高探針特異性，經(jīng)同類比較， 雜交特異性大大超過(guò)Taqman及Taqman-MGB，在雜交水解之后兩端標(biāo)記的染料又全部變?yōu)?報(bào)告基團(tuán)，大大提高熒光增量。其優(yōu)勢(shì)在于，可提高TM值(可高達(dá)10°C以上)，探針更短， 可以15-16mer，可以適用于A、T含量比較高的序列設(shè)計(jì)探針，大大提高探針配對(duì)和非配對(duì) 的TM值差異，加大多重?zé)晒舛縋CR的選擇5-7種專利熒光選擇，適用于所有品牌熒光定 量PCR儀所有通道；每種染料即是報(bào)告基團(tuán)又是粹滅基團(tuán)，打破傳統(tǒng)Taqman探針，因?yàn)椴ㄩL(zhǎng) 原因標(biāo)記選擇困難，不受粹滅基團(tuán)波長(zhǎng)的限制；提高信噪比無(wú)背景熒光，空間距離近，更 好的淬滅效果，探針兩端熒光即可相互粹滅，水解后又可報(bào)告熒光。本發(fā)明的肽核酸(PNA)和Allglo 探針增敏的K-Ras基因突變熒光定量PCR檢測(cè) 試劑盒是針對(duì)K-Ras基因熱點(diǎn)突變區(qū)的檢測(cè)而設(shè)計(jì)的，包括K-Ras基因第12、13密碼子的 共7種突變基因型。該試劑盒包括PCR混合反應(yīng)液、優(yōu)選的，包括兩種熒光定量反應(yīng)液，熒光 定量反應(yīng)液的特征是均含有正、反引物和Allglo 熒光探針，抑制KRAS突變區(qū)野生型基因 組PCR擴(kuò)增的PNA序列，陽(yáng)性對(duì)照樣品，只是Allglo 熒光探針針對(duì)的突變位點(diǎn)有所區(qū)別， 相應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照樣品也有所不同而已。在本發(fā)明中，提供的兩端都標(biāo)有熒光發(fā)光基團(tuán)MAR的特異性熒光探針，在探針完 整時(shí)(隨機(jī)狀態(tài)和無(wú)PCR產(chǎn)物雜交狀態(tài))，則探針兩端MAR熒光染料均不發(fā)出熒光。當(dāng)特異 的PCR產(chǎn)物與Allglo 探針發(fā)生雜交反應(yīng)時(shí)，Taq酶同時(shí)也把探針裂解，則探針兩端標(biāo)記的 MAR熒光染料改變?yōu)殡s交消化形態(tài)而發(fā)出熒光。由于標(biāo)記Allglo 探針兩端的MAR互相互 為報(bào)告及粹滅基團(tuán)，而且上面含有特殊的可以大大提高TM值的化學(xué)基團(tuán)，可以大大提高探 針特異性，經(jīng)同類比較，雜交特異性顯著超過(guò)Taqman及Taqman-MGB，在雜交水解之后兩端 標(biāo)記的染料又全部變?yōu)閳?bào)告基團(tuán)，大大提高熒光增量。報(bào)告基團(tuán)所釋放出來(lái)的熒光就可以 被內(nèi)置在定量檢測(cè)儀內(nèi)的熒光計(jì)檢測(cè)到。PCR每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，熒光信號(hào)也和目的片段一 樣，有一個(gè)同步指數(shù)增長(zhǎng)的過(guò)程，熒光信號(hào)的強(qiáng)弱就代表了模板DNA的拷貝數(shù)的多少。因此本發(fā)明不僅可用于簡(jiǎn)單的定性檢測(cè)，亦可用做樣本具體含量的定量檢測(cè)。


圖1是用熒光定量PCR檢測(cè)腸癌陽(yáng)性樣本的KRAS基因第12密碼子三種堿基置換 突變的擴(kuò)增曲線圖；圖2是用熒光定量PCR檢測(cè)腸癌陽(yáng)性樣本的KRAS基因第13密碼子一種堿基置換 突變和第12密碼子兩種堿基置換突變的擴(kuò)增曲線圖。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面將進(jìn)一步闡述本發(fā)明的具體實(shí)施例。收集臨床病理診斷為腸腺癌(CRC)的80例患者的蠟塊組織，所有患者術(shù)前均未接 受過(guò)西妥昔單抗(cetuximab)治療。從蠟塊中提取基因組DNA供以下的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。實(shí)施例1 用熒光定量PCR(FQ-PCR)檢測(cè)KRAS基因第12密碼子四種堿基置換突 變(密碼子 I2GGT — GAT，GGT — GTT，GGT — GCT)。設(shè)計(jì)能特異性檢測(cè)上述三種堿基置換突變的特異性Allglo 熒光定量檢測(cè)探針 各一條及PCR引物一對(duì)，各探針、引物序列分別具體如下PNA 序列為 PNA probe-5，-CCTACGCCACCAGCTCC-3，，如序列表中 SEQID NO AO 所 示； 針對(duì)GAT-12密碼子的突變型KRAS-Allglo 熒光定量檢測(cè)探針序列為 5，-MAR-TGGAGCTGATGGCG-MAR-3，，如序列表中 SEQ ID NO A3 所示；針對(duì)GTT-12密碼子的突變型KRAS-Allglo 熒光定量檢測(cè)探針序列為 5，-JUP-GTTGGAGCTGTTGGCGT-JUP-3，，如序列表中 SEQ ID NO A4 所示；針對(duì)GCT-12密碼子的突變型KRAS-Allglo 熒光定量檢測(cè)探針序列為 5，-SAT-TGGAGCTGCTGGCGT-SAT-3，，如序列表中 SEQ ID NO A5 所示；PCR 正向引物序列為:5，-TTA GCT GTA TCG TCAAGG CAC TC-3，，如序列表中 SEQ ID NO Al 所示；PCR反向引物序列為5'-GCC TGC TGA AAA TGA CTG AAT ATA-3，，如序列表中 SEQ ID NO A2 所示。其中，PNA序列是抑制K-Ras基因突變區(qū)野生型基因擴(kuò)增，針對(duì)GAT-12密碼子的突 變型KRAS-Allglo 熒光定量檢測(cè)探針的5’和3’端均標(biāo)記MAR(熒光報(bào)告/淬滅基團(tuán))；針 對(duì)GTT-12密碼子的突變型KRAS-Allglo 熒光定量檢測(cè)探針的5’和3’端均標(biāo)記JUP (熒 光報(bào)告/淬滅基團(tuán))；針對(duì)GCT-12密碼子的突變型KRAS-Allglo 的熒光定量檢測(cè)探針的 5’和3’端均標(biāo)記SAT (熒光報(bào)告/淬滅基團(tuán))。陽(yáng)性對(duì)照樣品是存在K-Ras基因第12號(hào) 密碼子3種突變類型(GAT，GCT和GTT)的混合質(zhì)?；蚪MDNA。優(yōu)化反應(yīng)體系進(jìn)行FQ-PCR的檢測(cè)反應(yīng)體系為15 μ 1，PCR正向引物和PCR反 向引物各0. 15μ1(終濃度20μΜ)，三種突變型KRAS-Allglo 的熒光定量檢測(cè)探針 各0. 2 μ 1 (終濃度20 μ M)，PNA探針0. 3 μ 1 (終濃度20 μ M)，模板DNA 2. 5 μ 1 (終濃 度100-300ng/y 1)，PCR反應(yīng)混合液(CS PCR Master Mix，購(gòu)自上海超市生物技術(shù)公 司)7. 5 μ 1，補(bǔ)加ddH20至總體積為15 μ 1。熒光定量反應(yīng)在ΑΒΙ7900檢測(cè)儀上進(jìn)行。反應(yīng)條件為95 °C變性5分鐘，95 °C 30秒，60 V 30秒，72 °C 1分鐘，擴(kuò)增反應(yīng)40循環(huán)。結(jié)果為在80例樣本中共檢測(cè)出9例樣本發(fā)生KRAS基因第12密碼子GGT — GAT 突變，5例樣品發(fā)生KRAS基因第12密碼子GGT — GTT突變，2例樣本發(fā)生KRAS基因第12密 碼子GGT — GCT突變。部分陽(yáng)性樣本見圖1，圖IA示KRAS基因第12密碼子GGT — GAT突 變的部分樣品陽(yáng)性擴(kuò)增曲線；圖IB示KRAS基因第12密碼子GGT — GTT突變的部分樣品陽(yáng) 性擴(kuò)增曲線；圖IC示KRAS基因第12密碼子GGT — GCT突變的部分樣品的陽(yáng)性擴(kuò)增曲線。實(shí)施例2 用熒光定量PCR檢測(cè)KRAS基因第13密碼子一種堿基置換突變(密碼子 13GGC — GAC)，第12密碼子三種堿基置換突變(密碼子12GGT — GCT，GGT — AGT，GGT — CGT)設(shè)計(jì)能特異性檢測(cè)上述四種堿基置換突變的特異性Allglo 熒光定量檢測(cè)探針 各一條及PCR引物一對(duì)，各探針、引物序列分別具體如下PNA 序列為 PNA probe-5，-CCTACGCCACCAGCTCC-3，，如序列表中 SEQID NO AO 所 示；針對(duì)GAC-13密碼子的突變型KRAS-Allglo 熒光定量檢測(cè)探針序列為 5，-MAR-AGCTGGTGACGTAGGC-MAR-3，，如序列表中 SEQ ID NO B3 所示；針對(duì)TGT-12密碼子的突變型KRAS-Allglo 熒光定量檢測(cè)探針序列為 5，-JUP-GTTGGAGCTTGTGGCGT-JUP-3，，如序列表中 SEQ ID NO B4 所示；針對(duì)AGT-12密碼子的突變型KRAS-Allglo 熒光定量檢測(cè)探針序列為 5，-URA-TGGAGCTAGTGGCGT-URA-3，，如序列表中 SEQ ID NO B5 所示；針對(duì)CGT-12密碼子的突變型KRAS-Allglo 熒光定量檢測(cè)探針序列為 5，-SAT-TTGGAGCTCGTGGCGT-SAT-3，；如序列表中 SEQ ID NO B6 所示；PCR 正向引物序列為5'-TTA GCT GTA TCG TCA AGG CAC TC-3，，如序列表中 SEQ ID NO Al 所示；PCR反向引物序列為5'-GCC TGC TGA AAA TGA CTG AAT ATA-3，，如序列表中 SEQ ID NO A2 所示。其中，PNA序列是抑制K-Ras基因突變區(qū)野生型基因擴(kuò)增，針對(duì)GAC-13密碼子的 突變型KRAS-Allglo 熒光定量檢測(cè)探針B3的5，和3，端均標(biāo)記MAR(熒光報(bào)告/淬滅基 團(tuán))；針對(duì)TGT-12密碼子的突變型KRAS-Allglo 熒光定量檢測(cè)探針B4的5’和3’端均標(biāo) 記JUP (熒光報(bào)告/淬滅基團(tuán))；針對(duì)AGT-12密碼子的突變型KRAS-Allglo 的熒光定量檢 測(cè)探針B5的5’和3’端均標(biāo)記URA(熒光報(bào)告/淬滅基團(tuán))。針對(duì)CGT-12密碼子的突變型 KRAS-Allglo 的熒光定量檢測(cè)探針的5’和3’端均標(biāo)記SAT(熒光報(bào)告/淬滅基團(tuán))。陽(yáng) 性對(duì)照樣品B是存在K-Ras基因第13號(hào)密碼子一種突變類型(GAC)和第12密碼子三種突 變型(TGT，AGT和CGT)的混合質(zhì)?；蚪MDNA。優(yōu)化反應(yīng)體系進(jìn)行FQ-PCR的檢測(cè)反應(yīng)體系為15 μ 1，PCR正向引物和PCR反 向引物各0. 15μ 1(終濃度20μΜ)，四種突變型KRAS-Allglo 的熒光定量檢測(cè)探針探 針各0. 2 μ 1 (終濃度20 μ M)，PNA探針0. 3 μ 1 (終濃度20 μ M)，模板DNA2. 5 μ 1 (終濃 度100-300ng/y 1)，PCR反應(yīng)混合液(CS qPCR Master Mix，購(gòu)自上海超市生物技術(shù)公 司)7. 5 μ 1，補(bǔ)加ddH20至總體積為15 μ 1。熒光定量反應(yīng)在ΑΒΙ7900檢測(cè)儀上進(jìn)行。反應(yīng) 條件為95 °C變性5分鐘，95 °C 30秒，60 V 30秒，72 °C 1分鐘，擴(kuò)增反應(yīng)40循環(huán)。結(jié)果為在80例樣本中共檢測(cè)出2例樣本發(fā)生KRAS基因第13密碼子GGC — GAC突變，1例樣品發(fā)生KRAS基因第12密碼子GGT — TGT突變，1例樣本發(fā)生KRAS基因第12 密碼子GGT — AGT突變。本組病例沒有發(fā)現(xiàn)KRAS基因第12密碼子GGT — CGT突變。部分 陽(yáng)性樣本見圖2 圖2A示KRAS基因第13密碼子GGC — GAC突變的部分樣品陽(yáng)性擴(kuò)增曲線； 圖2B示KRAS基因第12密碼子GGT — TGT突變的部分樣品陽(yáng)性擴(kuò)增曲線；圖2C示KRAS基 因第12密碼子GGT — AGT突變的部分樣品的陽(yáng)性擴(kuò)增曲線。上述結(jié)果表明本發(fā)明的FQ-PCR法檢測(cè)腫瘤組織KRAS基因突變不僅是快速、高效 的，而且其結(jié)果的判讀非常明確、直觀，結(jié)果亦是可靠、特異的，結(jié)果可靠性的驗(yàn)證可見該實(shí) 驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。最后所應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保 護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng) 理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì) 和范圍。序列表<120> 一種K-Ras基因突變分型熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法<160>10<170>PatentIn version 3. 2<210>1<211>17<212>DNA<213> 人工序列 AO<400>1cctacgccac cagctcc17<210>1<211>17<212>DNA<213> 人工序列 Al<400>2ttagctgtat cgtcaaggca ctc23<210>1<211>24<212>DNA<213> 人工序列 A2<400>3gcctgctgaa aatgactgaa tata24<210>1<211>14<212>DNA<213> 人工序列 A3<400>4
tggagctgat ggcg
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列A4
<400>5
gttggagctg ttggcgt
<210>1
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列A5
<400>6
tggagctgct ggcgt
<210>1
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列B3
<400>7
agctggtgac gtaggc
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列B4
<400>8
gttggagctt gtggcgt
<210>1
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列B5
<400>9
tggagctagt ggcgt
<210>1
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列B6
<400>10
ttggagctcg tggcgt
權(quán)利要求
一種K Ras基因突變分型熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括PCR混合反應(yīng)液、肽核酸探針、突變型KRas AllgloTM熒光探針和陽(yáng)性對(duì)照樣品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的K-Ras基因突變分型熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于， 所述肽核酸探針的序列如SEQ ID NO AO所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的K-Ras基因突變分型熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于， 所述PCR混合反應(yīng)液中含PCR正向引物和PCR反向引物，所述PCR正向引物的序列如SEQ ID NO Al所示，所述PCR反向引物的序列如SEQID NO A2所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的K-Ras基因突變分型熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于， 所述突變型 KRas-AllgloTM 熒光探針包括如 SEQ ID NO A3、SEQID NO A4、SEQ ID NO A5、 SEQ ID NO B3、SEQ ID NO B4、SEQ ID NO B5禾口 SEQ ID NO B6所示的序列中的一種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的K-Ras基因突變分型熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于， 當(dāng)所述突變型KRas-AllgloTM熒光探針包括如SEQ ID NO A3、SEQID NO A4和SEQ ID NO A5所示的序列中的一種或多種時(shí)，所述陽(yáng)性對(duì)照樣品是存在K-Ras基因第12號(hào)密碼子三種 突變類型(GAT，GCT和GTT)的混合質(zhì)粒基因組DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的K-Ras基因突變分型熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于， 當(dāng)所述突變型 KRas-AllgloTM 熒光探針包括如 SEQ ID NO B3、SEQID NO B4、SEQ ID NO B5 和SEQ ID NO B6所示的序列中的一種或多種時(shí)，所述陽(yáng)性對(duì)照樣品是存在K-Ras基因第13 號(hào)密碼子一種突變類型(GAC)和第12密碼子三種突變型(TGT、AGT和CGT)的混合質(zhì)粒基 因組DNA。
7.一種K-Ras基因突變分型熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征在于，針對(duì)K-Ras基因設(shè)計(jì) 一對(duì)PCR引物、肽核酸探針，并針對(duì)K-Ras基因突變位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)AllgloTM熒光探針，反應(yīng) 體系中加入PCR反應(yīng)液、PCR引物、肽核酸探針和AllgloTM熒光探針進(jìn)行熒光定量PCR的 檢測(cè)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種K-Ras基因突變分型熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征在 于，所述的肽核酸探針的序列如SEQ ID NO AO所示。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種K-Ras基因突變分型熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征在 于，所述的PCR引物如SEQ ID NO Al和SEQ ID NO A2所示。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種K-Ras基因突變分型熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征在 于，所述的 AllgloTM 熒光探針包括如 SEQ ID NO A3、SEQ ID N0A4、SEQ ID NO A5、SEQ ID NO B3、SEQ ID NO B4、SEQ ID NO B5禾口 SEQ IDNO B6所示的序列中的一種或多種。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種K-Ras基因突變分型熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，包括PCR混合反應(yīng)液、肽核酸探針、突變型K-Ras-AllgloTM熒光探針和陽(yáng)性對(duì)照樣品。本發(fā)明還提供了一種K-Ras基因突變分型熒光定量PCR檢測(cè)方法先針對(duì)K-Ras基因設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物和肽核酸探針，針對(duì)K-Ras基因突變位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)AllgloTM熒光探針，反應(yīng)體系中加入PCR反應(yīng)液、PCR引物、肽核酸探針和AllgloTM熒光探針進(jìn)行熒光定量PCR的檢測(cè)。本發(fā)明采用了PNA技術(shù)，結(jié)合AllgloTM熒光探針技術(shù)，能快速、準(zhǔn)確、高敏感度的檢測(cè)各種癌組織中K-Ras基因突變位點(diǎn)，時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、判讀明確、直觀、安全。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101899496SQ20091003980
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2009年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月27日
發(fā)明者石大陸 申請(qǐng)人:廣州達(dá)健生物科技有限公司