專利名稱：一種l-精氨酸的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種L-精氨酸的制備方法，尤其涉及一種通過基因 重組技術(shù)改進(jìn)大腸桿菌積累精氨酸的能力，并利用改進(jìn)的大腸桿菌 發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸的方法。
背景技術(shù)：
L-精氨酸是生物代謝途徑中一種重要的氨基酸，也是一種工業(yè) 上用途廣泛的氨基酸，可用于食品及制藥等行業(yè)，生產(chǎn)氨基酸注射 液、保肝護(hù)肝劑等，有防提高人體免疫力、防治心血管疾病等作用， 并有可能是治療腫瘤的一種潛在藥物成分。
L-精氨酸發(fā)酵生產(chǎn)所用的菌種主要有谷氨酸棒桿菌、黃色棒桿 菌、鈍齒棒桿菌、大腸桿菌、枯草桿菌等。這些菌種一般通過篩選 抗精氨酸類似物的菌種以及誘變得到，也有些使用抗其它藥物的突 變體或基因重組技術(shù)改造的菌株。
細(xì)菌的精氨酸生物合成途徑是由L-谷氨酸開始，經(jīng)過八步酶催化 反應(yīng)最終生成L-精氨酸。精氨酸合成途徑的酶一般都是受到嚴(yán)格調(diào) 控的，酶基因的轉(zhuǎn)錄會受到精氨酸或精氨酸與阻遏物復(fù)合物的阻遏， 酶蛋白的催化活性也會受到精氨酸的反饋抑制。
基因工程改造菌種多采用大腸桿菌，其中一般是在重組的大腸桿 菌中引入一種編碼細(xì)菌精氨酸生物合成途徑的酶的基因以提高某種酶的活性，或者引入經(jīng)過人工突變的酶基因，其中酶與精氨酸結(jié)合 的位點(diǎn)得到改變，使精氨酸的抑制作用減弱或消除，從而大腸桿菌 積累L-精氨酸的能力得到提高。
在細(xì)菌的代謝過程中，合成途徑的各步的酶通常都會受到精氨酸 的不同程度的反饋抑制。在大腸桿菌中，精氨酸抑制其合成途徑的 關(guān)鍵酶是第一步的乙酰谷氨酸合成酶，它同時受精氨酸阻遏表達(dá)及 活性抑制，其余各步的酶受精氨酸的抑制作用較小。
在谷氨酸棒桿菌中，精氨酸合成途徑的關(guān)鍵酶是第二歩的乙酰谷 氨酸激酶，它受到精氨酸的阻遏和抑制。而在谷氨酸棒桿菌中第一 歩的乙酰谷氨酸合成酶和第五歩的鳥氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶實際上是由同 一個酶完成的，它基本上不受阻遏也不受抑制。
在細(xì)菌中還普遍存在一個精氨酸操縱子的調(diào)節(jié)基因argR，在不同 的細(xì)菌中有不同的功能，在大腸桿菌中，argR是一個負(fù)調(diào)控基因， 它會抑制細(xì)胞中精氨酸的合成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種耗時短、安全可靠、環(huán)保 型、過程簡單、產(chǎn)量高的L-精氨酸的制備方法。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的 本發(fā)明通過對大腸桿菌進(jìn)行基因重組改性，敲除了大腸桿菌中
的argR基因，改性后的大腸桿菌能大量發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸。所述大 腸桿菌的改性方法包括如下歩驟
(1)構(gòu)建含有乙酰谷氨酸合成酶基因的表達(dá)載體(2 )將含有乙酰谷氨酸合成酶基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中， 篩選陽性轉(zhuǎn)化子。
在上述制備方法中，所述改性大腸桿菌的培養(yǎng)條件優(yōu)選是在
通氣條件下培養(yǎng)16-72小時，pH值控制在6.5-7.5，溫度30-37°C 。
在上述制備方法中，步驟(1)具體包括如下步驟
利用聚合酶鏈反應(yīng)PCR的方法，以谷氨酸棒桿菌DNA為模板， 擴(kuò)增乙酰谷氨酸合成酶基因，PCR用的上游引物 CTACATATGGCAGAAAAAGGCATTAQSEQNO:l)，其中5'端加入 了 Ndel限制酶切位點(diǎn)；下游引物CTAGGATCCTTAAGTG CTGTACGCGGAGT(SEQNO:2)，其中5'端加入了 BamHI限制酶切 位點(diǎn)；PCR條件94。C30秒；60°C 30秒；72。C90秒；擴(kuò)增30個 循環(huán)，得到乙酰谷氨酸合成酶基因；
將乙酰谷氨酸合成酶基因用Ndel和BamHI雙酶切，與用同樣 雙酶切的質(zhì)粒載體pET-9a連接，得到含有乙酰谷氨酸合成酶基因的 表達(dá)載體，稱為pET-argJ。
在上述制備方法中，歩驟(2)具體包括如下步驟 選取表達(dá)載體pET-argJ上的卡那霉素抗性基因作為選擇標(biāo)記，
將乙酰谷氨酸合成酶基因和卡那霉素抗性基因一起整合到大腸桿菌
基因組中的重組單元；
PCR上游引物序列為(SEQ NO:3):
6GTCACTGGAGCGATATCATACAGAGAGAGTTCTGAACCT GAAGGCAGTTGGGTTTTTAACAGTAGTGCAMTAGCTCACGCT GTAGGTATCTCAG;
PCR下游引物序列為(SEQN0:4):
TCACTATAGG;
以表達(dá)載體pET-argJ為模板，用以上兩條序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增； PCR反應(yīng)條件為94°C 30秒；72°C 4分鐘；擴(kuò)增30個循環(huán)，得到 兩端帶有argR基因同源重組序列、包含乙酰谷氨酸合成酶基因和卡 那霉素抗性基因的重組單元；
將重組單元導(dǎo)入到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中；
篩選重組單元插入到大腸桿菌argR基因位點(diǎn)的陽性轉(zhuǎn)化子。
對于改性后的大腸桿菌，可以采用生產(chǎn)精氨酸類似的方法進(jìn)行 發(fā)酵培養(yǎng)，并在培養(yǎng)液中純化L-精氨。培養(yǎng)所需的碳源一般可以使 用糖類，如葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖及淀粉水解產(chǎn)物等。氮源可 以使用無機(jī)氮源如銨鹽、氨水等，也可使用有機(jī)氮源如蛋白胨、大 豆水解物、玉米槳等。另外還需要適量的微量元素類物質(zhì)，如鎂離 子、鐵離子、鈣離子、酵母提取物及維生素B1等。
從發(fā)酵液中分離純化L-精氨酸的方法可以采用濃縮結(jié)晶法、離子 交換樹脂吸附法以及其它己知的方法。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明利用PCR技術(shù)擴(kuò)增了來源于谷氨酸棒桿菌的乙酰谷氨酸合成酶基因，構(gòu)建了 大腸桿菌表達(dá)載體，導(dǎo)入大腸桿菌中，利用同源重組方法，使乙酰
谷氨酸合成酶基因表達(dá)單元定點(diǎn)插入整合到大腸桿菌的argR基因位 點(diǎn)，使得外源基因在整合的同時破壞了argR基因的結(jié)構(gòu)，即相當(dāng)于 敲除了 argR基因。插入的基因表達(dá)單元表達(dá)谷氨酸棒桿菌來源的乙 酰谷氨酸合成酶，完成精氨酸合成途徑第一步由谷氨酸到乙酰谷氨 酸的催化功能而不受終產(chǎn)物L(fēng)-精氨酸的反饋抑制。
利用這種改性大腸桿菌進(jìn)行發(fā)酵，能夠產(chǎn)生并在培養(yǎng)基中積累 L-精氨酸，通過分離純化步驟收集L-精氨酸。
本發(fā)明的大腸桿菌改性方法避免了將整個表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿 菌帶來的基因拷貝數(shù)過高，使基因過度表達(dá)，從而干擾代謝途徑中 其它酶基因的表達(dá)?？商岣呔N的遺傳穩(wěn)定性。


圖1為pET-argJ的結(jié)構(gòu)圖譜。
具體實施例方式
實施例l:含有乙酰谷氨酸合成酶基因的表達(dá)載體的構(gòu)建
利用PCR的方法，以谷氨酸棒桿菌(ATCC 13032) DNA為模 板，擴(kuò)增乙酰谷氨酸合成酶基因。PCR用的上游引物
了 Ndel P艮制酶切位點(diǎn)；下游引物CTAGGATCCTTAAGTG CTGTACGCGGAGT(SEQNO:2)，其中5'端加入了 BamHI限制酶切 位點(diǎn)。PCR條件94。C30秒；60。C30秒；72。C90秒。擴(kuò)增30個 循環(huán)。得到長度為1.2kb的DNA片段，此即為谷氨酸棒桿菌的乙酰谷氨酸合成酶基因。將此PCR產(chǎn)物用NdeI和BamHI雙酶切、純化 后的DNA片段與用同樣雙酶切的質(zhì)粒載體pET-9a (購自Novagen 公司)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化用氯化鈣處理的大腸桿菌DH5a感受態(tài) 細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布到含有10pg/mL卡那霉素的固體LB平板 培養(yǎng)基上。固體LB培養(yǎng)基成分為1%蛋白胨，0.5%酵母粉，1%氯 化鈉，2%瓊脂。37"C培養(yǎng)16-20小時后，挑取數(shù)個轉(zhuǎn)化子單菌落， 分別培養(yǎng)、提取質(zhì)粒DNA，用T7通用引物進(jìn)行DNA序列測定。篩 選序列正確的質(zhì)粒，即為含有乙酰谷氨酸合成酶基因的表達(dá)載體， 將其命名為pET-argJ。 pET-argJ的結(jié)構(gòu)圖譜見圖1。 實施例2:將乙酰谷氨酸合成酶基因表達(dá)單元引入大腸桿菌
本發(fā)明中所用的出發(fā)菌株為大腸桿菌，是通過誘變篩選得到的 L-精氨酸生產(chǎn)菌株。實施例1中構(gòu)建的表達(dá)載體pET-argJ上帶有完 整的可在大腸桿菌中表達(dá)來源于谷氨酸棒桿菌的乙酰谷氨酸合成酶 基因的表達(dá)單元。為了方便轉(zhuǎn)化子的篩選，我們需要一個選擇標(biāo)記， 因此選取表達(dá)載體pET-argJ上的卡那霉素抗性基因作為選擇標(biāo)記， 將乙酰谷氨酸合成酶基因和卡那霉素抗性基因一起作為整合到大腸 桿菌基因組中的重組單元。
采用表達(dá)載體上卡那霉素抗性基因啟動子5'端序列作為PCR 物ATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAG; T7啟動子上游序列作 為PCR下游引物GCGAAATTAATACGACTCACTATAGG，就可以 將包含乙酰谷氨酸合成酶基因和卡那霉素抗性基因的重組單元擴(kuò)增為了定點(diǎn)整合到大腸桿菌的argR基因上，需要在PCR上、下 游引物上再分別加上一段argR基因上、下游同源序列。
選取上游同源序列為 GTCACTGGAGCGATATCATACAGAGAGAGTTCTGAACCTGAA GGCAGTTGGGTTTTTAACAGTAGTGCAA;
選取下游同源序列為
ACAGCACCAAACTTGGTCAACATCCGC;
因此，加上了 argR同源序列的PCR上游引物序列為:
GGTATCTCAG(SEQ NO:3);
加上了 argR同源序列的PCR下游引物序列為:
TCACTATAGG(SEQ NO:4);
以實施例1中構(gòu)建的質(zhì)粒表達(dá)載體pET-argJ為模板，用以上兩 條長序列PCR弓1物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用高保真聚合酶Pyrobest DNA polymerase (Takara公司)，兩步法進(jìn)PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為 94°C 30秒；72°C 4分鐘。擴(kuò)增30個循環(huán)。得到長度為3.3kb的DNA 片段，即為兩端帶有argR基因同源重組序列、包含谷氨酸棒桿菌的 乙酰谷氨酸合成酶基因和卡那霉素抗性基因的重組單元。將PCR擴(kuò)增得到的同源重組單元DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳分 離純化，分離3.3kb的DNA片段，以清除殘留的模板質(zhì)粒DNA。 采用電激轉(zhuǎn)化法將純化的同源重組單元導(dǎo)入到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 中。按照實施例1中相同的方法涂布在含卡那霉素的LB平板培養(yǎng) 基上，37"C培養(yǎng)16-20小時。由于轉(zhuǎn)化用的重組單元本身不能在大 腸桿菌中自主復(fù)制，所以必須是發(fā)生了同源重組整合到大腸桿菌基 因組中的轉(zhuǎn)化子才能長出單菌落。雖然這種轉(zhuǎn)化的效率很低，但仍 能獲得少量轉(zhuǎn)化子。
為了鑒定重組表達(dá)單元是否準(zhǔn)確地插入到大腸桿菌的argR基因 位點(diǎn)，采用菌落PCR方法對所有轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定。采用argR基因 兩端外圍的序列作為引物(ATATGGCTCAGATCGACAGC和 AGCACCAGATTCTTCAATGG)，取少量轉(zhuǎn)化子菌落為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳鑒定，如果PCR產(chǎn)物大小為 0.8kb，則表明外源基因未能準(zhǔn)確插入到argR基因中；如果PCR產(chǎn) 物大小為3.4kb，則證明帶有谷氨酸棒桿菌的乙酰谷氨酸合成基因的 重組表達(dá)單元已經(jīng)正確插入到大腸桿菌的argR基因位點(diǎn)，也就是說， 同時敲除了大腸桿菌的argR基因。通過PCR鑒定篩選，得到了正 確的轉(zhuǎn)化子，即改性大腸桿菌菌株，從而完成了本發(fā)明。 實施例3:改性大腸桿菌菌株的搖瓶發(fā)酵產(chǎn)精氨酸試驗
將實施例2所得改性大腸桿菌與普通大腸桿菌在相同條件進(jìn)行 搖瓶發(fā)酵，比較它們的產(chǎn)L-精氨酸的能力。將兩個菌種各自接一環(huán) 到5mL液體LB培養(yǎng)基中，32"C振蕩培養(yǎng)過夜。次日，將種子液分別接種到50rnL搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基成分葡萄糖
10%，硫酸銨5%，磷酸二氫鉀0.5%，酵母浸粉0.5%，硫酸鎂0.05 %，硫胺素0.1g/L，硫酸亞鐵0.02g/L，碳酸鈣1%， pH7.2;接種后 于220-240rpm， 32"培養(yǎng)72小時。培養(yǎng)基中積累的L-精氨酸的量 35g/L。如表1所示。
表1改性大腸桿菌菌株與親本產(chǎn)酸量比較
菌株L-精氨酸產(chǎn)量(g/L)
普通大腸桿菌26
改性大腸桿菌菌株35
可見，改性大腸桿菌菌株產(chǎn)生L-精氨酸的能力明顯提高。
12Untitled—ST25
SEQUENCE LISTING <110〉 廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司 〈120〉 一種L-精氨酸的制備方法 <130> <160〉 4
<170〉 Patentln version 3. 5
<210> 1
<211〉 26
<212〉 DNA 〈213>人工序列
<400> 1
ctacatatgg cagaaaaagg cattac 26
<210> 2
〈211〉 29
〈212〉 DNA
<213> 人工序列
〈400〉 2
ctaggatcct taagtgctgt acgcggagt 29
<210〉 3
〈211> 95
〈212〉 DNA <213>人工序列
<400〉 3
gtcactggag cga'tatcata cagagagagt tctga.a.cctg aaggcagttg ggtttttaac 60 agtagtgcaa atagctcacg ctgtaggtat ctcag 95
<210〉 4
<211〉 96
〈212> 腿
<213> 人T.序列
〈400〉 4
tggcaggcag taaaccattt ccatt"ttggc attgcgtgta cgtacagcac caaacttggt 60 caacatccgc gcgaaattaa tacgactcac tatagg %
權(quán)利要求
1、一種L-精氨酸的制備方法，其特征是培養(yǎng)經(jīng)過改性的大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸，所述大腸桿菌的改性方法包括如下步驟(1)構(gòu)建含有乙酰谷氨酸合成酶基因的表達(dá)載體(2)將含有乙酰谷氨酸合成酶基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。
2、 如權(quán)利要求1所述的L-精氨酸的制備方法，其特征在于所述培養(yǎng)的條件是在通氣條件下培養(yǎng)16-72小時，pH值控制在6.5-7.5， 溫度30-37。C。
3、 如權(quán)利要求1所述的L-精氨酸的制備方法，其特征在于步驟 (1)包括如下步驟利用PCR的方法，以谷氨酸棒桿菌DNA為模板，擴(kuò)增乙酰谷 氨酸合成酶基因，PCR 用的上游引物 CTACATATGGCAGAAAAAGGCATTAG其中5'端加入了 Ndel限 制酶切位點(diǎn)；下游引物CTAGGATCCTTAAGTG CTGTACGCGGAGT，其中5'端加入了 BamHI限制酶切位點(diǎn)；PCR 條件94。C30秒；6CTC30秒；72。C90秒；擴(kuò)增30個循環(huán)，得到 乙酰谷氨酸合成酶基因；將乙酰谷氨酸合成酶基因用Ndel和BamHI雙酶切，與用同樣 雙酶切的質(zhì)粒載體pET-9a連接，得到含有乙酰谷氨酸合成酶基因的 表達(dá)載{本，稱為pET-argJ。
4、 如權(quán)利要求1所述的L-精氨酸的制備方法，其特征在于步 驟(2)包括如下歩驟選取表達(dá)載體pET-argJ上的卡那霉素抗性基因作為選擇標(biāo)記， 將乙酰谷氨酸合成酶基因和卡那霉素抗性基因一起整合到大腸桿菌 基因組中的重組單元；PCR上游引物序列為 GTCACTGGAGCGATATCATACAGAGAGAGTTCTGAACCTGAA GGCAGTTGGGTTTTTAACAGTAGTGCAAATAGCTCACGCTGTA GGTATCTCAG;PCR下游引物序列為TCACTATAGG;以表達(dá)載體pET-argJ為模板，用以上兩條序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增； PCR反應(yīng)條件為94°C 30秒；72°C 4分鐘；擴(kuò)增30個循環(huán)，得到 兩端帶有argR基因同源重組序列、包含乙酰谷氨酸合成酶基因和卡 那霉素抗性基因的重組單元；將重組單元導(dǎo)入到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中； 篩選重組單元插入到大腸桿菌argR基因位點(diǎn)的陽性轉(zhuǎn)化子。
全文摘要
一種L-精氨酸的制備方法，它是培養(yǎng)改性的大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸，所述大腸桿菌的改性方法包括如下步驟(1)構(gòu)建含有乙酰谷氨酸合成酶基因的表達(dá)載體。(2)將含有乙酰谷氨酸合成酶基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明使乙酰谷氨酸合成酶基因表達(dá)單元定點(diǎn)插入整合到大腸桿菌的argR基因位點(diǎn)，使得外源基因在整合的同時敲除了argR基因。利用這種改性大腸桿菌進(jìn)行發(fā)酵，能夠產(chǎn)生并在培養(yǎng)基中積累L-精氨酸，通過分離純化步驟收集L-精氨酸。本發(fā)明的大腸桿菌改性方法避免了將整個表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌帶來的基因拷貝數(shù)過高，使基因過度表達(dá)，從而干擾代謝途徑中其它酶基因的表達(dá)?？商岣呔N的遺傳穩(wěn)定性。
文檔編號C12N15/70GK101586130SQ20091004048
公開日2009年11月25日 申請日期2009年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月23日
發(fā)明者寧異真, 張?zhí)碓? 達(dá) 徐, 鄭明英, 陸林芳, 雷劍芬 申請人:廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司