專利名稱：一種高效防治油茶炭疽病的枯草芽孢桿菌y13及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物保護(hù)領(lǐng)域，尤其涉及一種防治油茶炭疽病的內(nèi)生生防菌株，具體地說涉及一種高效防治油茶炭疽病的枯草芽孢桿菌Y13及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
油茶(Ca^eL ia oJ"/fera)是我國特有的食用油料樹種，亦是世界四大木本油料樹種之一，已有2000多年的利用和栽培歷史。它適應(yīng)性廣，抗逆性強(qiáng)，適種于廣大的紅壤丘陵地區(qū)。主要生長(zhǎng)在南方，以湖南、江西、廣西為主，其中湖南省是國內(nèi)最大的油茶產(chǎn)地和最大的茶油消費(fèi)區(qū)。油茶全身都是寶，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。據(jù)統(tǒng)計(jì)，油茶面積在10萬畝以上的縣有130個(gè)，30萬畝以上的縣有56個(gè)，50萬畝以上的縣有19個(gè)。年產(chǎn)茶油1. 3 1.5億公斤，是二億多人口的主要食用油來源。目前全國有油茶林400萬公頃，占全國木本食用油料面積的80%以上，常年產(chǎn)油15萬噸。目前，油茶的病害種類繁多，其危害程度也愈發(fā)嚴(yán)重。每年因病害而造成的經(jīng)濟(jì)損失難以估計(jì)，其中油茶炭疽病是一種常見的油茶病害。
油茶炭疽病是由膠胞炭疽菌(Co/fetoWc/mw g/oms;wn'ozVfe)侵染引起的一種毀滅性病害，是我國油茶產(chǎn)區(qū)的主要病害之一，發(fā)生普遍，引起嚴(yán)重落果、落蕾、落葉、枝枯，甚至整株衰亡。病害落果率通常在20%左右，嚴(yán)重時(shí)40%以上。據(jù)浙江省的資料，由于油茶炭疽病，嚴(yán)重病區(qū)發(fā)病率高達(dá)80%，病樹的平均存果率比無病樹降低了63.3%。
當(dāng)前對(duì)油茶炭疽病的防治主要通過種植抗性品種和化學(xué)防治來控制，但有害生物抗性問題日益嚴(yán)重，且化學(xué)農(nóng)藥殘留造成嚴(yán)重的危害，如造成殘毒、污染環(huán)境，對(duì)人體健康、生態(tài)環(huán)境造成了很大的威脅，不利于油茶產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。因此尋找一種經(jīng)濟(jì)、安全、有效的防治措施是當(dāng)務(wù)之急。生物防治以其安全、高效及無污染等特點(diǎn)已經(jīng)成為植物病害防治的重要途徑，其中拮抗細(xì)菌在植物病害生物防治中起到非常重要的作用，其主要優(yōu)勢(shì)在于1)種類和數(shù)量眾多，在植物葉際、葉內(nèi)大量存在；2)對(duì)病原菌的作用方式多種多樣，包括競(jìng)爭(zhēng)、拮抗、寄生、誘導(dǎo)植物抗性的產(chǎn)生等；3)繁殖速度快；4)許多細(xì)菌在植物的葉內(nèi)或葉際定殖力強(qiáng)；5)細(xì)菌大多能夠人工培養(yǎng)，易于操作，便于生產(chǎn)應(yīng)用；6)有些細(xì)菌不僅能夠防治病害而且可以增加作物產(chǎn)量。
從油茶植株內(nèi)分離篩選獲得對(duì)油茶炭疽病菌具有拮抗作用的生防菌株，對(duì)油茶炭疽病
3的防治具有重要的意義，但目前相關(guān)技術(shù)仍舊很薄弱甚至空白，至今20多年能有效防治油茶炭疽病病的拮抗細(xì)菌未見報(bào)道，也沒有防治油茶炭疽病的生物農(nóng)藥的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的空白，提供一種高效防治油茶炭疽病的枯草芽孢桿菌Y13，枯草芽孢桿菌Y13是一種從油茶植株內(nèi)分離篩選獲得對(duì)油茶炭疽病菌具有拮抗作用的生防細(xì)菌菌株，對(duì)油茶炭疽病的防治具有重要意義。
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供所述高效防治油茶炭疽病的枯草芽孢桿菌Y13在防治炭疽病災(zāi)害方面的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是通過以下方式實(shí)現(xiàn)的。
一種高效防治油茶炭疽病的枯草芽孢桿菌Y13，所述的枯草芽孢桿菌Y13， 5a"7/M做6"加Y13 ，保藏號(hào)CCTCC NO.M 208264 。
所述枯草芽孢桿菌Y13具有以下生化特性其對(duì)油茶炭疽病病菌有拮抗作用；對(duì)油茶炭疽病病菌菌絲有抑制、致畸作用；對(duì)油茶炭疽病病菌菌絲分生孢子萌發(fā)有抑制作用。
所述的枯草芽孢桿菌Y13在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上菌落呈乳白色，圓形或近圓形，邊緣較整齊，中央隆起，干燥折皺，不透明，不產(chǎn)生色素，菌落直徑一般2 3mm，菌體桿狀，革蘭氏染色陽性，芽孢中生。
所述的枯草芽孢桿菌Y13用于制備對(duì)油茶炭疽病病菌有拮抗作用的生化制劑。
所述的枯草芽孢桿菌Y13用于制備對(duì)油茶炭疽病病菌菌絲有抑制、致畸作用的生化制劑。
所述的枯草芽孢桿菌Y13用于制備對(duì)油茶炭疽病病菌菌絲分生孢子萌發(fā)有抑制作用的生化制劑。
本發(fā)明提供枯草芽孢桿菌Y13新菌株，其展現(xiàn)出對(duì)油茶炭疽病病菌具有較強(qiáng)的拮抗活性。
本發(fā)明的新菌株分離自油茶葉。新菌株培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g， NaC15.0g，蒸餾水1000mL，瓊脂10 20g， pH7.0 7.2。
本發(fā)明的枯草芽孢桿菌Y13顯示出以下形態(tài)和生化特征在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上菌落呈乳白色，圓形或近圓形，邊緣較整齊，中央隆起，干燥折皺，不透明，不產(chǎn)生色素，菌落直徑一般2 3mm，菌體桿狀，革蘭氏染色陽性，芽孢中生。菌株的生化反應(yīng)V.P、接觸酶、葡萄糖發(fā)酵、需氧性測(cè)定呈陽性，甲基紅反應(yīng)陰性，其生長(zhǎng)能水解淀粉、明膠。
本發(fā)明的有益效果是(1) 枯草芽孢桿菌Y13為植物內(nèi)生菌，對(duì)油茶炭疽病菌抑制作用強(qiáng)，對(duì)多種病原真菌具有拮抗作用，具有拮抗細(xì)菌在植物病害生物防治中所起到的非常重要的作用，例如種類和數(shù)量眾多，在植物葉際、葉內(nèi)大量存在；對(duì)病原菌的作用方式多種多樣，如對(duì)油茶炭疽病病菌有拮抗作用；對(duì)油茶炭疸病病菌菌絲有抑制、致畸作用；對(duì)油茶炭疽病病菌菌絲分生孢子萌發(fā)有抑制作用。繁殖速度快等優(yōu)點(diǎn)，尤其是對(duì)油茶炭疽病的防治具有重要意義。
(2) 種菌株培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，容易保存，易于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。枯草芽孢桿菌(S"c/〃船wMfc) Y13
保藏日期2008年12月27日
保藏單位名稱中國典型培養(yǎng)物保藏中心
保藏單位簡(jiǎn)稱CCTCC保藏號(hào)CCTCC NO.M 20826

圖1為Y13菌株對(duì)油茶炭疽病菌的平板對(duì)峙拮抗作用圖2為10 X 40倍顯微鏡下觀察到的枯草芽孢桿菌Y13對(duì)油茶炭疽病菌絲的致畸作用圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實(shí)施例1
枯草芽孢桿菌Y13的分離
取普通油茶健康葉，采用常規(guī)法進(jìn)行分離、純化和保存。
油茶葉用水沖洗干凈后，選取適量的健康組織，分別稱量后，剪成5mmX5mm的組織塊，在75%乙醇中浸泡lmin，然后在0.1%升汞溶液中浸泡40s 70s，再放入75%乙醇浸泡30s，取出后用無菌水沖洗4次。在無菌研缽內(nèi)加入10ml的無菌水和少許滅過菌的石英砂研磨成勻漿，加蓋靜置30min，將勻漿10倍系列稀釋后，用移液槍分別吸取O.lml至準(zhǔn)備好的NA平板上，涂抹均勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48h后記錄菌量，并根據(jù)菌落形態(tài)、顏色和大小選取，在平板上進(jìn)行純化保存，共分離5個(gè)批次。實(shí)施例2
枯草芽孢桿菌Y13的篩選
初篩采用對(duì)峙培養(yǎng)法。對(duì)內(nèi)生菌拮抗病原真菌篩選。將打好直徑為6mm的油茶炭疽病菌菌餅放于平板中央，然后用接菌環(huán)蘸取待測(cè)細(xì)菌的懸浮液等距離(距平板中央3cm)點(diǎn)接2 3種內(nèi)生細(xì)菌，放于培養(yǎng)箱中25°C黑暗培養(yǎng)，4d后觀察記錄抑菌帶的有無及大小，共重復(fù)3次。選出抑菌帶寬度大于等于4mm的8個(gè)菌株進(jìn)行復(fù)篩，依次為Y5、Y12、 Y13、 Y19、 Y21、 Y29、 Y31、 Y35進(jìn)行復(fù)篩(見表l)。
表1內(nèi)生細(xì)菌對(duì)油茶炭疽病菌的抑菌作用
抑菌帶寬度L (mm)菌株編號(hào)
L<4Y2、Y3、 Y4、 Y6、 Y7、 Y8、 Y9、 Y10、 Yll、 Y14、 Y15、
Y16、Y17、 Y18、 Y20、 Y22、 Y23、 Y24、 Y25、 Y26、 Y27、
Y28、 Y30、 Y32、 Y33、 Y34、 Y36、 Y37、 Y38
4《L<7Y5、 Y21、 Y29、 Y31
7《L<10Y12、 Y19、、 Y35
10《LY13
復(fù)篩采用發(fā)酵法。將初步篩選出的8株菌分別在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2d后，用接菌環(huán)移取一環(huán)置入裝有150mlNB培養(yǎng)液的三角瓶中(250ml)，在28°C、 150rpm的搖床上振蕩培養(yǎng)48h。培養(yǎng)液用0.22細(xì)菌過濾器過濾得到培養(yǎng)濾液，將濾液與約50°CPDA培養(yǎng)基按1:19混勻倒入培養(yǎng)皿，冷卻后在平板中央放入d=6mm的炭疽菌菌餅，4d后測(cè)量病菌菌落直徑，以無菌水為對(duì)照，Y13菌株發(fā)酵液的抑菌效果最明顯，抑制率達(dá)到84.1%。見表2。
表2發(fā)酵液對(duì)油茶炭疽病菌的抑制作用
菌株菌落直徑(mm)抑制率(％)
Y517.872.5
Y1216.275.1
Y1310.384.1
Y1915.476.3
Y2120.568.5
Y2919.869.6
Y3119.470.2
Y3512.980.2
CK65—
實(shí)施例3
枯草芽孢桿菌Y13對(duì)油茶炭疽病菌絲的抑制作用將直徑為6mm的油茶炭疽病菌菌餅放于馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基PDA平板中央，然后等 距離3cm點(diǎn)接拮抗細(xì)菌Y13，三次重復(fù)，25 28'C培養(yǎng)，4天后測(cè)定抑菌帶的直徑。由圖 1可見枯草芽孢桿菌Y13對(duì)油茶炭疽病菌抑菌作用強(qiáng)。 實(shí)施例4
枯草芽孢桿菌Y13對(duì)油茶炭疽病菌絲的致畸作用
將玻璃紙剪成5mraX25mm的長(zhǎng)條狀，12rC高壓滅菌，用鑷子將其鋪放于菌株Y13和 病原菌之間。28t:恒溫培養(yǎng)5 7天，帶菌株Y13和病原菌菌絲之間出現(xiàn)明顯的抑菌帶后， 將玻璃紙小心取下，置于10X40倍顯微鏡下觀察菌絲的形態(tài)變化，以不接菌株Y13的病 原菌為對(duì)照。觀察到菌絲前期膨大突出，后期明顯變細(xì)，分枝多而短，形態(tài)不均勻，見圖 2，其中l(wèi):正常菌絲的病原菌菌絲(10X40); 2:前期菌絲膨大突出(10X40)。 實(shí)施例5
枯草芽孢桿菌Y13對(duì)油茶炭疸病菌絲分生孢子萌發(fā)的抑制作用
采用載玻片懸滴法。將油茶炭疽病病菌在PDA平板上(22t!)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10d后， 用移菌環(huán)挑取孢子堆轉(zhuǎn)移到盛有滅菌水的試管中，振蕩搖勻后配成孢子懸浮液(5X10S個(gè) /ml)，備用。取100ul孢子懸浮液，同100lU發(fā)酵原液和被稀釋10倍、100倍的發(fā) 酵液及l(fā)OOul發(fā)酵濾液分別混合，滴加到凹玻片上，以滴加無菌水為對(duì)照。每處理重復(fù) 3次，置于28'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h以后鏡檢孢子萌發(fā)情況，計(jì)算孢子萌發(fā)率。由表3結(jié) 果可知，Y13的發(fā)酵原液對(duì)炭疽病菌分生孢子的萌發(fā)和芽管的生長(zhǎng)都有著明顯的抑制作 用，其中對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)到94.4%，發(fā)酵液被稀釋后抑制效果逐漸降低。Y13發(fā)酵 濾液對(duì)孢子萌發(fā)的抑制效果也十分明顯，使孢子萌發(fā)率降低了 88.7%,結(jié)果表明，菌株在 發(fā)酵培養(yǎng)過程中可能產(chǎn)生了對(duì)炭疽病菌有抑制作用的代謝產(chǎn)物。
表3 內(nèi)生菌株培養(yǎng)液對(duì)炭疽病菌分生孢子萌發(fā)的影響
處理孢子萌發(fā)率(％)
稀釋100倍的發(fā)酵液13.5
稀釋10倍的發(fā)酵液9.8
發(fā)酵原液5.6
發(fā)酵液濾液11.3
CK100
權(quán)利要求
1、一種高效防治油茶炭疽病的枯草芽孢桿菌Y13，其特征在于，所述的枯草芽孢桿菌Y13，Bacillus subtilis Y13，保藏號(hào)為CCTCC NO.M 208264。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效防治油茶炭疽病的枯草芽孢桿菌Y13，其特征在于， 所述枯草芽孢桿菌Y13具有以下生化特性其對(duì)油茶炭疽病病菌有拮抗作用；對(duì)油茶炭疽 病病菌菌絲有抑制、致畸作用；對(duì)油茶炭疽病病菌菌絲分生孢子萌發(fā)有抑制作用。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種高效防治油茶炭疽病的枯草芽孢桿菌Y13，其特征 在于，所述的枯草芽孢桿菌Y13在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上菌落呈乳白色，圓形或近圓形， 邊緣較整齊，中央隆起，干燥折皺，不透明，不產(chǎn)生色素，菌落直徑一般2 3mm，菌體桿 狀，革蘭氏染色陽性，芽孢中生。
4、 權(quán)利要求1所述的高效防治油茶炭疽病的枯草芽孢桿菌Y13的應(yīng)用，其特征在于， 所述的枯草芽孢桿菌Y13用于制備對(duì)油茶炭疽病病菌有拮抗作用的生化制劑。
5、 權(quán)利要求1所述的高效防治油茶炭疽病的枯草芽孢桿菌Y13的應(yīng)用，其特征在于， 所述的枯草芽孢桿菌Y13用于制備對(duì)油茶炭疽病病菌菌絲有抑制、致畸作用的生化制劑。
6、 權(quán)利要求1所述的高效防治油茶炭疽病的枯草芽孢桿菌Y13的應(yīng)用，其特征在于， 所述的枯草芽孢桿菌Y13用于制備對(duì)油茶炭疽病病菌菌絲分生孢子萌發(fā)有抑制作用的生化 制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效防治油茶炭疽病的枯草芽孢桿菌Y13，Bacillus subtilis Y13，保藏號(hào)CCTCC NO.M 208264，屬植物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域。同時(shí)公開了其分離方法以及應(yīng)用，所述枯草芽孢桿菌Y13菌株經(jīng)平板對(duì)峙試驗(yàn)篩選所得，能夠有效抑制油茶炭疽病菌的生長(zhǎng)，防效高，環(huán)境安全性好，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101475922SQ20091004246
公開日2009年7月8日 申請(qǐng)日期2009年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月9日
發(fā)明者劉君昂, 盧麗俐, 周國英, 宋光桃, 河 李, 琳 李, 靳愛仙 申請(qǐng)人:中南林業(yè)科技大學(xué)