專利名稱：一株高產(chǎn)原果膠酶的菌株及一種發(fā)酵提取果膠的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株高產(chǎn)原果膠酶的菌株及采用該菌株發(fā)酵提取果膠的方法。
背景技術(shù)：
果膠以原果膠、可溶性果膠、果膠酸等形式廣泛分布于植物的果實(shí)、根莖及葉中。作為一種重要的食品添加劑，果膠在市場上非常缺乏，目前
國際市場價格在17,000美元/噸左右。桔皮是桔子深加工等的副產(chǎn)物，是工業(yè)生產(chǎn)果膠的主要原料之一，其中含有約30% (占桔皮干重)的果膠。目前，從桔皮中提取果膠的方法主要有酸解法、微波法、離子交換樹脂法、微生物法等幾類。
酸解法為工業(yè)提取果膠最傳統(tǒng)的方法。其原理是采用稀酸將果皮細(xì)胞中的非水溶性原果膠水解為水溶性果膠。該法具有快速、簡單、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，果膠產(chǎn)率能達(dá)到26%以上，但提取過程中果膠分子會發(fā)生局部水解，降低了果膠相對分子質(zhì)量，從而影響果膠收率和質(zhì)量；果膠提取液黏度大導(dǎo)致過濾困難；生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的廢渣難以處理；同時因?yàn)樗岬拇罅繎?yīng)用，對設(shè)備的腐蝕也較大。
微波法是利用高功率的電磁波穿透被提取介質(zhì)內(nèi)部維管束和細(xì)胞系統(tǒng)，由于吸收微波能，細(xì)胞內(nèi)部溫度迅速上升，細(xì)胞受到的內(nèi)部壓力超過細(xì)胞壁承受能力導(dǎo)致細(xì)胞破裂，從而細(xì)胞內(nèi)有效成分自由流出，通過在較低的溫度條件下萃取介質(zhì)、溶解，進(jìn)一步過濾并、分離，即可獲得提取物。微波法提取法不僅具有簡單、快速等優(yōu)勢，而且產(chǎn)量很高，幾乎能夠完全提取出果皮中的果膠。但能耗較大，也因?yàn)榉磻?yīng)條件劇烈，造成后期固液 難分離。
離子交換樹脂法的工藝流程為將處理過的柑橘皮脫水后粉碎，與離 子交換樹脂和水制成的濃漿液在攪拌下加熱過濾，分離出不溶性的離子交 換劑和廢渣，得到含有果膠的濾液。用該法提取桔皮中的果膠，產(chǎn)率能夠 達(dá)到22% 23%，果膠的質(zhì)量也較好，但同樣采用了較高濃度的酸，對設(shè) 備的腐蝕也較大。
微生物法的原理是利用微生物生長過程中分泌的原果膠酶將植物組 織中原果膠分解為可溶的果膠，進(jìn)而可以將發(fā)酵液過濾、濃縮并用沉淀劑 將發(fā)酵液中的果膠沉淀提取出來。微生物法首先由日本人sakai等提出， 其用一株產(chǎn)原果膠酶菌株7h'c/^戶ra" 應(yīng)用到桔皮果膠提取 中，果膠產(chǎn)率能達(dá)到13.3%(與桔皮干重之比)。此后，JC Contreras Esquivd 等人利用從j^^^7/m fem^c/2// ifo 4308培養(yǎng)基原果膠酶溶液提取桔皮果 膠，產(chǎn)率達(dá)到17.7% (與桔皮干重之比)。采用微生物發(fā)酵法萃取的果膠分 子量大、果膠的膠凝度高、質(zhì)量穩(wěn)定、提取液中果皮不破碎(易于固液分離)， 無需進(jìn)行熱處理或酸處理，具有低消耗、低污染、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等一系列 優(yōu)點(diǎn)。但就目前的工藝來看，該法還存在產(chǎn)率不高的不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株高產(chǎn)原果膠酶的黑曲霉菌株J^^g///^ CD-Ol。
本發(fā)明涉及的黑曲霉菌株已于2009年3月4日提交保藏。保藏單位 名稱中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址中國、武漢、武漢大學(xué)；保 藏編號為CCTCCNO: M 209036，分類命名為黑曲霉CD-Ol， Aspergillus niger CD隱Ol。本發(fā)明的另一目的在于針對現(xiàn)有果膠提取技術(shù)存在的不足，提供一種生產(chǎn)成本低、產(chǎn)品質(zhì)量好、產(chǎn)出高且副產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)價值高的微生物發(fā)酵提取果膠的方法。
本發(fā)明的微生物發(fā)酵提取果膠的方法包括以下步驟
1) 斜面培養(yǎng)將黑曲霉孢子接種至斜面培養(yǎng)基上，34-36'C下培養(yǎng)3-5天，用無菌水洗下黑曲霉孢子，制成孢子懸液并稀釋至1.0-2.5xl(^個/mL，
冷藏于4t:備用；
2) 發(fā)酵取當(dāng)季無霉變的干桔皮按水料質(zhì)量比為10-20:1投入到蒸餾水中，靜置25國35min，將pH值調(diào)至4.5-5.5，高壓滅菌15-25min，冷卻后按質(zhì)量比加入0.1-0.2%的尿素，按質(zhì)量比接種5-15%的黑曲霉孢子懸液，恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24-48h，溫度為34-36。C，轉(zhuǎn)速為150-210r/min;
3) 果膠提取將培養(yǎng)液過濾或離心，將分離得到的發(fā)酵溶液采用2.4倍體積的95%乙醇進(jìn)行沉淀提取，沉淀分離后用70%的乙醇洗滌兩次，冷凍干燥即得產(chǎn)品。
所述斜面培養(yǎng)最佳條件為34-36'C下培養(yǎng)4天，接種用孢子懸液優(yōu)選濃度為1.0-2.5 xl()6個/mL。
所述發(fā)酵步驟中最佳pH值為4.5-5.5，尿素的優(yōu)選添加量為0.1-0.2%,黑曲霉孢子接種在無菌條件下進(jìn)行，最佳接種量為5-15%。
所述發(fā)酵步驟中最佳培養(yǎng)條件為恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24-28h，溫度為34-36。C，轉(zhuǎn)速為150-210r/min。
所述濾液中存在的大量高活性果膠酶，久置會分解其中的果膠分子，影響果膠質(zhì)量，因此在離心或過濾得到果膠溶液后，應(yīng)立即加入乙醇進(jìn)行沉淀。
與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明具有以下優(yōu)勢
1)成本較低整個發(fā)酵提取過程條件溫和，對設(shè)備要求不高且耗能低；此外桔皮原料不需破碎，發(fā)酵溶液固液分離更容易，因此與其他方法相比成本要低很多；
2) 產(chǎn)率較高本發(fā)明的果膠提取產(chǎn)率高達(dá)24.5% (與桔皮干重之比)，與現(xiàn)有的微生物提取果膠方法相比，產(chǎn)率大大提高，與傳統(tǒng)果膠提取方法產(chǎn)率相當(dāng)；
3) 產(chǎn)品質(zhì)量好果膠產(chǎn)品分子量大，膠凝度高，質(zhì)量穩(wěn)定，各項(xiàng)指標(biāo)均符合果膠標(biāo)準(zhǔn)QB 2484-2000;
4) 副產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)價值高發(fā)酵液中除了果膠外還存在大量的原果膠酶和果膠酶，均有很高的經(jīng)濟(jì)價值，這是其他果膠提取方法所不具備的。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例旨在說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的進(jìn)一步限定，本發(fā)明可以按發(fā)明內(nèi)容所述的任一方式實(shí)施。
實(shí)施例1:
將黑曲霉孢子接種到斜面培養(yǎng)基上于35'C生長4天后，用無菌水洗下黑曲霉孢子，制成孢子懸液并稀釋到1.75xl(^個/mL，冷藏于4t:備用。
取當(dāng)季無霉變的干桔皮6.67 g投入到裝有100 mL蒸餾水的250mL三角瓶中，靜置30min，將pH值準(zhǔn)確調(diào)至5.0，高壓滅菌25 min;冷卻后在無菌條件下加入尿素0.14 g，再加入黑曲霉孢子懸液10mL，孢子濃度為1.75xl06+/mL;將接種后的搖瓶在恒溫?fù)u床中培養(yǎng)培養(yǎng)36h，設(shè)置溫度為35°C，轉(zhuǎn)速為180r/min;將培養(yǎng)液過濾或離心(取lmL用于產(chǎn)量測定)，取濾液用2.4倍體積的95。/。的乙醇對果膠進(jìn)行沉淀、過濾，用20mL、 70%的乙醇將果膠沉淀洗滌兩次，將最后將得到的果膠沉淀冷凍干燥。采用硫酸咔唑法測定果膠含量，測得果膠產(chǎn)率為24.5% (與桔皮干重之比)。實(shí)施例2:
將黑曲霉孢子接種到斜面培養(yǎng)基上于35'C生長4天后，用無菌水洗下黑曲霉孢子，制成孢子懸液并稀釋到1.75xl()S個/mL，冷藏于4。C備用。
取當(dāng)季無霉變的干桔皮6.67 g投入到裝有100 mL蒸餾水的250mL三角瓶中，靜置35min，將pH值準(zhǔn)確調(diào)至5.5,高壓滅菌20min;冷卻后在無菌條件下加入尿素0.15g，再加入黑曲霉孢子懸液10mL，孢子濃度為L75xl(^個/mL;將接種后的搖瓶在恒溫?fù)u床中培養(yǎng)培養(yǎng)32h，設(shè)置溫度為36°C，轉(zhuǎn)速為150r/min;將培養(yǎng)液過濾或離心(取lmL用于產(chǎn)量測定)，取濾液用2.4倍體積的95%的乙醇對果膠進(jìn)行沉淀、過濾，用20mL、 70%的乙醇將果膠沉淀洗滌兩次，將最后將得到的果膠沉淀冷凍干燥。采用硫酸咔唑法測定果膠含量，測得果膠產(chǎn)率為22.8% (與桔皮干重之比)。
實(shí)施例3:
將黑曲霉孢子接種到斜面培養(yǎng)基上于35-C生長4天后，用無菌水洗下黑曲霉孢子，制成孢子懸液并稀釋到1.75xl(^個/mL，冷藏于4。C備用。
取當(dāng)季無霉變的干桔皮6.67 g投入到裝有100 mL蒸餾水的250mL三角瓶中，靜置25min，將pH值準(zhǔn)確調(diào)至4.5，高壓滅菌15min;冷卻后在無菌條件下加入尿素0.14g，再加入黑曲霉孢子懸液10mL，孢子濃度為1.7xl()S個/mL;將接種后的搖瓶在恒溫?fù)u床中培養(yǎng)培養(yǎng)40h，設(shè)置溫度為34°C，轉(zhuǎn)速為200r/min;將培養(yǎng)液過濾或離心(取lmL用于產(chǎn)量測定)，取濾液用2.4倍體積的95%的乙醇對果膠進(jìn)行沉淀、過濾，用20mL、 70%的乙醇將果膠沉淀洗滌兩次，將最后將得到的果膠沉淀冷凍干燥。采用硫酸咔唑法測定果膠含量，測得果膠產(chǎn)率為23.1% (與桔皮干重之比)。
權(quán)利要求
1、一株高產(chǎn)原果膠酶的黑曲霉菌株Aspergillus niger CD-01，其保藏編號為CCTCC NOM 209036。
2、 一種采用權(quán)利要求l所述黑曲霉菌株發(fā)酵提取果膠的方法，其特征在 于包括以下步驟1) 斜面培養(yǎng)將黑曲霉菌株^^^^7/MW/g^CD-01孢子接種至斜面培養(yǎng) 基上，34-36匸下培養(yǎng)3-5天，用無菌水洗下黑曲霉孢子，制成孢子懸液并稀 釋至1.0-2.5xl(^個/mL，冷藏于4"C備用；2) 發(fā)酵取干桔皮按水料質(zhì)量比為10-20:1投入到蒸餾水中，靜置 25-35min，將pH值調(diào)至4.5-5.5，高壓滅菌15-25min，冷卻后按質(zhì)量比加入 0.1-0.2%的尿素，按質(zhì)量比接種5-15%的黑曲霉孢子懸液，恒溫?fù)u床中培養(yǎng) 24-48h，溫度為34-36。C，轉(zhuǎn)速為150-210r/min;3) 果膠提取將培養(yǎng)液過濾或離心，將分離得到的發(fā)酵溶液采用2.4倍 體積的95%乙醇進(jìn)行沉淀提取，沉淀分離后用70%的乙醇洗滌兩次，冷凍干 燥即得產(chǎn)品。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種微生物發(fā)酵提取果膠的方法，其特征在于 斜面培養(yǎng)條件為34-36匸培養(yǎng)3-5天。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種微生物發(fā)酵提取果膠的方法，其特征在于 接種用孢子懸液濃度為1.0-2.5xl(^個/mL。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種微生物發(fā)酵提取果膠的方法，其特征在于 干桔皮不用破碎，直接加入。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種微生物發(fā)酵提取果膠的方法，其特征在于 發(fā)酵步驟中將pH值調(diào)至4.5-5.5。
7、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種微生物發(fā)酵提取果膠的方法，其特征在于 尿素的添加量為0.1-0.2%。
8、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種微生物發(fā)酵提取果膠的方法，其特征在于 發(fā)酵步驟中黑曲霉孢子接種在無菌條件下進(jìn)行，接種量為5-15%。
9、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種微生物發(fā)酵提取果膠的方法，其特征在于:發(fā)酵步驟中培養(yǎng)條件為恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24-48h，溫度為34-36°C，轉(zhuǎn)速為 150-210r/min。
10、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種微生物發(fā)酵提取果膠的方法，其特征在 于在離心或過濾得到的果膠溶液后立即加入乙醇。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株高產(chǎn)原果膠酶的黑曲霉菌株及采用該菌株發(fā)酵提取果膠的方法。所述黑曲霉Aspergillus niger CD-01從湖南常德一傾倒腐爛柑桔的土壤中篩選到，保藏編號為CCTCC NOM 209036。本發(fā)明發(fā)酵提取果膠的方法包括斜面培養(yǎng)、發(fā)酵、果膠提取等步驟，所得產(chǎn)品分子量大、膠凝度高、質(zhì)量穩(wěn)定，各項(xiàng)指標(biāo)符合果膠標(biāo)準(zhǔn)，在生產(chǎn)成本方面優(yōu)于其他果膠提取方法，且在果膠產(chǎn)率方面與以往微生物發(fā)酵提取法相比有較大提高。
文檔編號C12N1/14GK101665769SQ200910043038
公開日2010年3月10日 申請日期2009年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月3日
發(fā)明者夏金蘭, 浩 孟, 張成桂, 張瑞永, 王潤民, 聶珍媛, 邱冠周 申請人:中南大學(xué)