專利名稱：：一種用于制備堿性甘露聚糖酶的酵母基因工程菌株及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于遺傳工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體涉及含有堿性甘露聚糖酶突變體的酵母基因工程菌株，以及用該基因工程菌株制備堿性甘露聚糖酶的方法。
背景技術(shù)：
：甘露聚糖酶(M肌nanase，EC3.2丄78):P-甘露聚糖酶是一類降解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖主鏈e-i，4-D-甘露吡喃糖的酶，屬于半纖維素酶類，根據(jù)其最適pH值的不同可分酸性、中性、堿性甘露聚糖酶。它作為新型的工業(yè)酶制劑，可產(chǎn)生具有重要商業(yè)價值的甘露寡糖。被廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、造紙、飼料、石油開采及精細(xì)化工等行業(yè)，如紙漿的漂白、油井的破膠、降解植物膠生產(chǎn)低聚糖用作雙歧桿菌促生長因子、保健食品以及在飼料工業(yè)中作為抗?fàn)I養(yǎng)因子。我國甘露聚糖資源十分豐富，在許多植物如干椰子肉的胚乳、象牙棕櫚樹的堅果、咖啡樹、魔芋的塊莖和多種植物膠(槐豆膠、田箐膠、瓜兒膠)中都有高含量的甘露聚糖。目前甘露聚糖酶的開發(fā)和功能研究已經(jīng)取得了不少成果。如通過乳酸細(xì)菌的甘露聚糖酶作用于魔芋多糖，芽胞桿菌的甘露聚糖酶作用于瓜膠，放線菌的甘露聚糖酶作用于復(fù)雜半纖維素等生產(chǎn)甘露寡糖。甘露聚糖酶飼料添加劑早已投入生產(chǎn)，而以甘露寡糖研制的功能食品也已經(jīng)出現(xiàn)。甘露聚糖酶作為一種重要的半纖維素酶，從產(chǎn)酶菌種的篩選、誘變到利用分子生物學(xué)手段構(gòu)建基因工程菌等都得到了普遍的重視和深入的研究。自從1989年首次報道從芽孢桿菌中克隆得到甘露聚糖酶基因(參見AkinoTetal.:ArchMicrobiiol,152:10-15,1989.)，到目前為止已有大約30個微生物來源甘露聚糖酶基因得到克隆。其中一些甘露聚糖酶基因在大腸桿菌中得到了表達(參見BraithwaiteKLetal.:Biochem丄305:1005-1010,1995.DuffaudGDetal.:ApplEnvironMicrobiol,63:169-177,1997.EthierNetal.:ApplEnvironMicrobiol,64:4428-4432，1998.)，如來源于feci〃〃ss〃力tih'sNM-39的e-甘露聚糖酶基因在大腸桿菌DH5a重組表達，酶活力4.9U/ml(參見MendozaNSetal.:Bi。chemBi叩hysActa,1243(3):552-554'1995);來源于卩耆堿芽孢桿菌alkaliphilicfec^t/s(MaYHetal.:Extremophiles,8:447-454,2004.)、AMOOl、厭氧的嗜高溫細(xì)菌CsJAceWt/fflsscc力aroJytic〃/H、熒光假單孢菌、變青鏈霉菌以及里氏木霉等的甘露聚糖酶基因，均在大腸桿菌中實現(xiàn)了重組表達。但由于大腸桿菌中表達產(chǎn)量低，蛋白易形成包涵體，為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)帶來難度。另一方面，目前已有一些甘露聚糖酶基因如J《ST^"wW邵or^、eoW^、fe"77w^來源的甘露聚糖酶基因在畢赤酵母中得到了表達(喬宇等:中國生物工程雜志，26(7):52-56，2006。譚秀華等:微生物學(xué)報，45(4)，2004。)，表達的酶活分別為3.3U/ml、41.04U/ml、41.8U/ml。一種來源于枯草芽孢桿菌alkaliphilicBacillussp.N16-5的堿性甘露聚糖酶(GeneBankNo:AY534912)已經(jīng)被報道(MaYHetal.:Extremophiles,8:447-454,2004.)，該酶結(jié)構(gòu)基因是1479bp的DNA，編碼一個由493個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其中l(wèi)-32位氨基酸為信號肽部分。該蛋白的pl為4.3，該甘露聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為7(TC，最適反應(yīng)pH值為9.5，可高效水解植物甘露聚糖產(chǎn)生寡糖。但是該基因在真核生物中的重組表達至今未見相關(guān)報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是獲得一種組成型分泌表達堿性甘露聚糖酶的酵母基因工程菌株。本發(fā)明的另一個目的就是提供一種由所述酵母基因工程菌制備堿性甘露聚糖酶的方法。本發(fā)明提供了一種用于制備堿性甘露聚糖酶的酵母基因工程菌株，該酵母基因工程菌株含有堿性甘露聚糖酶的突變體，該甘露聚糖酶突變體基因的核苷酸編碼序列如SEQIDNO1所示，上述的酵母基因工程菌株是鷹嘴豆胞克魯維酵母菌株(保藏號CCTCCNo.M202031)。4本發(fā)明中堿性甘露聚糖酶的突變體的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。上述的酵母基因工程菌株也可以是畢赤酵母、釀酒酵母等。本發(fā)明還提供了一種制備上述堿性甘露聚糖酶的方法，即取上述的酵母基因工程菌株，在28-32'C條件下發(fā)酵2-8天，然后去除菌體，即得；發(fā)酵液初始菌濃度為0D6。。=0.4-0.6;發(fā)酵液pH值為5.0-7.0;發(fā)酵液中含有質(zhì)量體積比為0.5-3%的酵母粉和質(zhì)量體積比不低于2%的碳源。本發(fā)明的發(fā)酵可以采用搖瓶、發(fā)酵罐等發(fā)酵方式，發(fā)酵時間可以為3-4天。如上述發(fā)酵方式中，發(fā)酵液pH值可以為5.0-7.0。如上述發(fā)酵方式中，發(fā)酵液中可以含有質(zhì)量體積比為0.5-3%的酵母粉。如上述發(fā)酵方式中，碳源可以為菊粉或者葡萄糖。如上述發(fā)酵方式中，菊粉的濃度可以為4%-6%，質(zhì)量體積比。如上述發(fā)酵方式中，葡萄糖的濃度可以為2%-4%，質(zhì)量體積比。本發(fā)明選用的堿性甘露聚糖酶突變體基因(又稱為MAN330)編碼序列，是指編碼具有堿性甘露聚糖酶蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO.1的核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQIDNO.1的核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQIDNO.1的核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQIDNO.2所述的氨基酸序列。本發(fā)明中，堿性甘露聚糖酶突變體基因指具有堿性甘露聚糖酶蛋白活性的如SEQIDN0.2所示序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與甘露聚糖酶相同功能的、SEQIDNO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為l-50個，較佳地l-30個，更佳地l-20個，最佳地l-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括甘露聚糖酶蛋白的活性片段、活性衍生物和修飾形式。本發(fā)明采用PCR方法，以枯草芽孢桿菌alkaliphilicBacillussp.N16-5來源的堿性甘露聚糖酶基因(AY534912)為模板，克隆其499位一1392位的核苷酸序列，即得。本發(fā)明在含有堿性甘露聚糖酶突變體基因序列的重組載體的制備過程中，首先設(shè)計突變體MAN330兩邊的引物，引入酶切位點；然后，PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切，再克隆到各種酵母系統(tǒng)用載體，如pPIC9K、pPIC9、pUKDS上等，獲得重組載體，例如pUKDS—MAN330。pUKDS中，P1NU:菊粉酶啟動子；S,NU:菊粉酶分泌信號肽；TINU:菊粉酶終止子，KD1:克魯維酵母自主復(fù)制序列。(詳見Caietal.,App]MiCTobio]Biotechnol67:364-369，2005)。獲得了重組載體后，可轉(zhuǎn)化相應(yīng)的酵母細(xì)胞獲得基因工程菌株。本發(fā)明的一個實施例中，將重組表達載體pUKDS—MAN330電轉(zhuǎn)化鷹嘴豆胞克魯維酵母Y179U(CCTCCNo:M202031)，從而構(gòu)建獲得組成型分泌表達的堿性甘露聚糖酶突變體的鷹嘴豆胞克魯維酵母基因工程菌株。分泌表達的堿性甘露聚糖酶突變體具有堿性甘露聚糖酶的活性，同時，與野生型的堿性甘露聚糖酶具有相似的底物特異性。該基因工程菌株至少在80世代內(nèi)保持穩(wěn)定。另一方面，本發(fā)明提供了一種利用上述基因工程菌株制備堿性甘露聚糖酶的方法，即取上述基因工程菌株，在常溫常壓下發(fā)酵即得。具體而言，可以取上述基因工程菌株在28-32"C、發(fā)酵2-8天，然后去除菌體，即得；發(fā)酵液初始菌濃度為0D6。。=0.4-0.6;發(fā)酵液pH值為5.0-7.0;發(fā)酵液中含有0.5-3%(質(zhì)量體積百分比)的酵母粉和濃度不低于2%(質(zhì)量體積百分比)的菊粉或葡萄糖。OD,表示菌體濃度，是在分光光度計(UNIC7200，上海儀器有限公司)600nm處測定獲得的光密度(OpticalDensity)來表示。發(fā)酵可以采用常規(guī)發(fā)酵方式和設(shè)備，例如發(fā)酵罐發(fā)酵，搖瓶發(fā)酵，等。發(fā)酵的時間、溫度等條件可以隨發(fā)酵方式和設(shè)備的改變而改變。例如，本發(fā)明可以采用搖瓶發(fā)酵方式，搖床轉(zhuǎn)速180-250rpm，發(fā)酵時間為3-4天。本發(fā)明的搖瓶制備堿性甘露聚糖酶的方法中，發(fā)酵液pH值可以為5.0-7.0。測pH值可以采用pH值試紙、pH計等常規(guī)方法。發(fā)酵壓強可以為常壓，發(fā)酵液初源，菊粉濃度較好為4%-6%，質(zhì)量體積比。如果采用葡萄糖作為碳源，葡萄糖濃度較好為2%_4%，質(zhì)量體積比。本發(fā)明中的百分比均采用質(zhì)量體積比。本發(fā)明改造了堿性甘露聚糖酶基因，以提高堿性甘露聚糖酶的分泌表達量;同時，利用鷹嘴豆胞克魯維酵母表達系統(tǒng)(CaiXPetal.:ApplMicrobiolBiotechnol.,67(3》364-369,2005.ZhangJetal.:ApplMicrobiolBiotechnol"62(4):387-391,2003.)，獲得了堿性甘露聚糖酶基因的高水平的分泌表達。用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的堿性甘露聚糖酶，活性可達1000U/ml以上，發(fā)酵產(chǎn)量高，發(fā)酵周期短，發(fā)酵成本低，適用于推廣至工業(yè)化生產(chǎn)。圖hMAN330與MAN493的氨基酸序列比較圖。其中，MAN493即AY534912所對應(yīng)的蛋白的氨基酸序列。圖2:分泌表達的堿性甘露聚糖酶最適反應(yīng)溫度分析圖。圖3:分泌表達的堿性甘露聚糖酶最適反應(yīng)pH分析圖。圖4:氮源及其含量對基因工程菌株分泌表達堿性甘露聚糖酶的影響圖。圖5:碳源及其含量對基因工程菌株分泌表達堿性甘露聚糖酶的影響圖。圖6:培養(yǎng)時間對基因工程菌株分泌表達堿性甘露聚糖酶的影響圖。圖7:培養(yǎng)溫度對基因工程菌株分泌表達堿性甘露聚糖酶的影響圖。圖8:接種量對基因工程菌株分泌表達堿性甘露聚糖酶的影響圖。圖9:基因工程菌株分泌表達堿性甘露聚糖酶的穩(wěn)定性分析圖。圖10:含有外源基因的pUKDS重組載體結(jié)構(gòu)示意圖。具體實施例方式本發(fā)明涉及到的實驗技術(shù)和方法可以參考(1)大腸桿菌培養(yǎng)、感受態(tài)細(xì)胞的制備以及轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒DNA的抽提純化、限制性內(nèi)切酶酶切、末端補平、PCR等分子生物學(xué)操作均參照《分子克隆實驗指南》(J.Sambrook，etal.，第二版，1996)(2)克魯維酵母的培養(yǎng)、感受態(tài)細(xì)胞的制備以及轉(zhuǎn)化等參照《酵母遺傳學(xué)7方法實驗指南》(A.Adams,etaL,2000)部分具體實驗方法見1:搖瓶發(fā)酵基本條件使用發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(葡萄糖4%，酵母粉1%)，在250ml的發(fā)酵搖瓶中裝30ml發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，220rpm，培養(yǎng)3天。發(fā)酵液中的菌體密度直接在600nm測定OD值(OD柳))。2:堿性甘露聚糖酶活性的檢測將發(fā)酵液上清用Gly-NaOH緩沖液(pH9.5)稀釋一定倍數(shù)，取100ul稀釋液，加入900yl底物(0.5%槐豆膠-緩沖液)，混勻樣品和底物，70°C水浴反應(yīng)10min，立即取出，置于冰上。略為冷卻(約需5min)后，各管加入lmlDNS試劑，混勻，沸水浴中10min,冷水冷卻。各管取200u1點樣于96孔板中，酶標(biāo)儀下測0D5TOn，最后根據(jù)甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算甘露聚糖酶酶活。甘露聚糖酶活性單位定義為每分鐘水解產(chǎn)生1微摩爾甘露糖所需要的酶量(ml)。3:基因工程菌穩(wěn)定性分析接種Y179U/pUKDS-MAN330-7于3mlSD培養(yǎng)液，30。C振蕩培養(yǎng)16hrs，再轉(zhuǎn)接lOul到2mlYEPD培養(yǎng)液，30。C振蕩培養(yǎng)24hrs(重復(fù)操作8次，24小時為IO個世代)，涂布平板制備單菌落(100-200個)3(TC培養(yǎng)1天，分別甩滅菌牙簽點種于SD和YEPD平板，計數(shù)100個，3CTC培養(yǎng)36hrs，觀察記錄并計算菌落在SD和YEPD平板上生長百分比。各種世代(10、20、30、40、50、60、70、80)菌液進行搖瓶發(fā)酵檢測堿性甘露聚糖酶表達水平的穩(wěn)定性。4:堿性甘露聚糖酶屬性分析堿性甘露聚糖酶最適反應(yīng)溫度的分析分別在35°C、4(TC、45°C、5(TC、55°C、6(TC、65°C、70°C、75°C、80°C、85°C、9CTC下檢測MAN330基因表達產(chǎn)物的酶活，比較不同反應(yīng)溫度下所測得的酶活值。堿性甘露聚糖酶最適反應(yīng)pH值的分析分別在不同pH值(pH值為3、4、5、6、7、8、9、9.5、10、11、12)的Gly-NaOH緩沖液下檢測MAN330基因表達產(chǎn)物的酶活，比較不同反應(yīng)pH值下所測得的酶活值。堿性甘露聚糖酶作用底物分析在7(TC，pH9.5的條件下，分別以槐豆膠、瓜爾膠、果膠、菊粉、可溶性淀粉、葡聚糖、木聚糖、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、殼聚糖、甘露聚糖、普魯蘭多糖作為底物，底物濃度均為0.5%(質(zhì)量體積比)，比較分析堿性甘露聚糖酶的酶活值。實施例1:堿性甘露聚糖酶突變體MAN330基因的克隆根據(jù)受體克魯維酵母菌細(xì)胞和分泌表達載體的特點，采用生物信息學(xué)方法，設(shè)計甘露聚糖酶MAN330基因的核苷酸序列和由此編碼的氨基酸序列。設(shè)計和合成引物寡核苷酸Pl:5，-G(;ACTAGTTCTTCTGGTTTCTACGTTGATGGCA-3'，(SEQIDNO3)P2:5，-CAGCGGCCGCCTATGTAAATACGGTGGA-3，(SEQIDNO4)(PI的5'端引入SpeI位點，P2的5'端引入NotI位點)，引物由上海英俊生物工程有限公司合成與純化。以GeneBankNo:AY534912序列為模板，以PI和P2為引物進行PCR，回收PCR產(chǎn)物894bp片段，獲得堿性甘露聚糖酶突變體基因，命名MAN330。并將該片段克隆到pUKDS上的Spel和Notl酶切位點之間，即得pUKDS-MAN330。堿性甘露聚糖酶突變體MAN330的氨基酸序列與全長的堿性甘露聚糖酶的氨基酸序列(GeneBankNo:AY534912)的比較見圖1。圖1中的MAN493代表了AY534912所對應(yīng)的全長堿性甘露聚糖酶的氨基酸序列。實施例2:含有堿性甘露聚糖酶突變體MAN330基因的鷹嘴豆胞克魯維酵母基因工程菌的構(gòu)建及篩選將分泌表達質(zhì)粒pUKDS-MAN330按參考例的方法轉(zhuǎn)化克魯維酵母受體菌Y179U(CCTCCNo.M202031)。從轉(zhuǎn)化子中挑選10個陽性轉(zhuǎn)化子，與受體菌陰性對照同步進行發(fā)酵，發(fā)酵上清液分別進行SDS-PAGE和甘露聚糖酶的酶活性檢測，結(jié)果顯示工程菌株Y179U/pUKDS-MAN330-7的表達量最高，表達產(chǎn)物酶活也最高。因而后面培養(yǎng)條件的優(yōu)化均用該菌株來研究。實施例3:鷹嘴豆胞克魯維酵母基因工程菌制備的堿性甘露聚糖酶突變體MAN330的底物特異性分析9將工程菌株Y179U/pUKDS-MAN330-7培養(yǎng)于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(1%酵母粉、4%葡萄糖)中，培養(yǎng)體積為30ml，培養(yǎng)溫度分別為3CTC，在250ml的發(fā)酵搖瓶，220rpm，培養(yǎng)4天，離心獲得發(fā)酵上清液。分別檢測底物為0.5%槐豆膠、0.5%瓜爾膠、0.5%果膠、0.5%菊粉、0.5%可溶性淀粉、0.5%葡聚糖、0.5%木聚糖、0.5%羧甲基纖維素鈉、0.5%甲基纖維素、0.5%殼聚糖、0.5%甘露聚糖、0.5%普魯蘭多糖時MAN330基因表達產(chǎn)物的酶活。以槐豆膠為底物時測得的堿性甘露聚糖酶的活性設(shè)為100%，以瓜爾膠為底物時，其相對活性為30.7±1.9%，而以果膠、菊粉、可溶性淀粉、葡聚糖、木聚糖、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、殼聚糖、甘露聚糖、普魯蘭多糖為底物時，均無反應(yīng)活性。詳見表l。表l:分泌表達的堿性甘露聚糖酶底物特異性分析底物MAN330相對活性(％)槐豆膠100瓜爾膠30.7±1.9果膠0菊粉0可溶性淀粉0葡聚糖0木聚糖0羧甲基纖維素鈉0甲基纖維素0殼聚糖0甘露聚糖0普魯蘭多糖0實施例4:鷹嘴豆胞克魯維酵母基因工程菌制備的堿性甘露聚糖酶的最適反應(yīng)溫度和最適作用PH分析按參考例中提到的方法分析堿性甘露聚糖酶突變體MAN330的最適反應(yīng)溫度以及最適反應(yīng)pH值，結(jié)果表明該堿性甘露聚糖酶突變體MAN330在反應(yīng)溫度為70°C，反應(yīng)pH值為9.5時有最高酶活，最高酶活可達1369U/ml。詳見圖2和圖3。實施例5:氮源及其含量對基因工程菌株生長和產(chǎn)酶的影響將工程菌株Y179U/pUKDS-MAN330-7培養(yǎng)于不同氮源的培養(yǎng)基中，分別為1%酵母粉和2%蛋白胨、0.5%酵母粉、1%酵母粉、1.5%酵母粉、2%酵母粉、3%酵母粉、4%酵母粉、1°/。蛋白胨、2%蛋白胨、1%尿素、2%尿素、1%黃豆粉、2%黃豆粉、3%黃豆粉、4%黃豆粉，培養(yǎng)基其他成分相同，均為4%葡萄糖，培養(yǎng)體積為30ml。在250ml的發(fā)酵搖瓶，30°C，220rpm，培養(yǎng)4天。取發(fā)酵上清液進行SDS-PAGE電泳檢測，并分析檢測酶的活性。結(jié)果表明以1%酵母粉作為培養(yǎng)基氮源時，甘露聚糖酶的表達和酶活都最高。而以蛋白胨或尿素或黃豆粉為氮源時，沒有檢測到堿性甘露聚糖酶的表達。詳見圖4。實施例6:碳源及其含量對基因工程菌株生長和產(chǎn)酶的影響將工程菌株Y179U/pUKDS-MAN330-7培養(yǎng)于不同碳源(分別為葡萄糖和菊粉)的培養(yǎng)基中，含量分別為1%，2%，3%，4%，6%，8%，培養(yǎng)基其他成分相同，均為1%酵母粉，培養(yǎng)體積為30ml。在250ml的發(fā)酵搖瓶，30°C，220rpm，培養(yǎng)4天。取發(fā)酵上清液進行SDS-PAGE電泳檢測，并分析檢測酶的活性，發(fā)酵液中的菌體密度直接在600nm下測定0D600。結(jié)果表明隨著培養(yǎng)基碳源(葡萄糖或菊粉)含量的增加，菌體密度隨之增加，而培養(yǎng)基碳源成分為4%葡萄糖或4%菊粉時，甘露聚糖酶的表達和酶活都最高。見圖5。實施例7:培養(yǎng)時間對基因工程菌株生長和產(chǎn)酶的影響將工程菌株Y179U/pUKDS-MAN330-7培養(yǎng)于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(1%酵母粉、4%葡萄糖)中，培養(yǎng)體積為30ml，在250ml的發(fā)酵搖瓶，30°C，220rpm，培養(yǎng)6天，第2、3、4、5、6天分別取樣，并將發(fā)酵上清液進行SDS-PAGE電泳檢測，并分析檢測酶的活性。結(jié)果表明發(fā)酵在第二天和第六天時，甘露聚糖酶的表達和酶活均較高?？梢姲l(fā)酵周期為48h或144h為理想發(fā)酵周期。見圖6。實施例8:培養(yǎng)溫度對基因工程菌株生長和產(chǎn)酶的影響將工程菌株Y179U/pUKDS-MAN330-7培養(yǎng)于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(1%酵母粉、4%葡萄糖)中，培養(yǎng)體積為30ml，培養(yǎng)溫度分別為30。C、37°C、42°C，在250ml的發(fā)酵搖瓶，220rpm，培養(yǎng)4天。將發(fā)酵上清液進行SDS-PAGE電泳檢測，并分析檢測酶的活性，發(fā)酵液中的菌體密度直接在600nm下測定0DM。結(jié)果表明隨著發(fā)酵溫度的升高，菌體密度隨之下降，甘露聚糖酶的表達量和酶活也呈線性下降趨勢。見圖7。實施例9:接種量對基因工程菌株生長和產(chǎn)酶的影響取不同量的工程菌株Y179U/pUKDS-MAN330-7(分別為50D、IOOD、150D、200D、250D)接種于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(1%酵母粉、4%葡萄糖)中，培養(yǎng)體積為30ml,在250ml的發(fā)酵搖瓶，30°C，220rpm,培養(yǎng)4天。將發(fā)酵上清液進行SDS-PAGE電泳檢測，并分析檢測酶的活性。結(jié)果表明當(dāng)接種量在5-150D之間時，甘露聚糖酶的表達量和酶活隨著接種量的增加逐漸提高，但當(dāng)接種量大于150D時，甘露聚糖酶的表達量隨接種量的增加略有下降，趨于平緩?？梢娊臃N量為150D為宜。見圖8。實施例10:基因工程菌株穩(wěn)定性研究受體Y179U菌株是wra3缺陷株，可由表達載體質(zhì)粒所帶的KcURA3基因彌補，因此工程菌Y179U/pUKDS-MAN330在SD的基本培養(yǎng)基上能生長，如果在工程菌株中丟失了表達載體質(zhì)粒pUKDS-MAN330，那么在缺少尿嘧啶的SD培養(yǎng)基中不能生長，通過分析不同世代的菌在SD和YEPD培養(yǎng)皿上的生長情況，可以測定菌株的質(zhì)粒穩(wěn)定性。分析結(jié)果表明工程菌Y179U/pUKDS-MAN330在80世代后仍保持了卯％以上的表達質(zhì)粒和表達產(chǎn)物相對活性95%左右的表達水平的高穩(wěn)定性。見圖8和下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>序列表<210>1<211〉894<212〉腿<213〉A(chǔ)rtificial<220〉<221〉CDS<222〉(1)..(894)〈223〉<400>1tcttctggtttctacgttgatggcaatacgttatatgacgcaaacggg48SerSerGlyPheTyrValAspGlyAsnThrLeuTyrAspAlaAsnGly151015GinProtttgtcPheVal20atgaaaggcMetLysGlylie肌cAsn25catHisGlycatgetHisAlatggtatTrpTyr30Lys96gacaccgetteaacagetattcctgccattgcagagcaaggcgcgaac144AspThrAlaSerThrAlalieProAlalieAlaGluGinGlyAlaAsn354045acgatacgtattgttttateagatggcggtcaatgggaaaaagacgac192ThrlieArglieValLeuSerAspGlyGlyGinTrpGluLysAspAsp505560attgacaccgttcgtgaagttattgagcttgcggagcaaaataaaatg240lieAspThrValArgGluVallieGluLeuAlaGluGinAsnLysMet65707580gtggetgtcgttgaagttcatgatgccacgggccgtgatteacgcagt288ValAlaValValGluValHisAspAlaThrGlyArgAspSerArgSer859095gatttagategggcagtcgattattggatagagatgaaagatgcactt336AspLeuAspArgAlaValAspTyrTrplieGluMetLysAspAlaLeu100105110ateggcHeGlyaaagagLysGlu115gatactgtcAspThrVallie120a_ttlieaacAsnattliegC￡Laa_cAlaAsn125g犯tggGluTrpta_tTyr38413ggcagttgggatggcgccgettgggetgatggctacattgatgtcatt432GlySerTrpAspGlyAlaAlaTrpAlaAspGlyTyrlieAspVallie130135140ccgaagcttcgcgatgccggcttaacacacaccttaatggttgatgca480ProLysLeuArgAspAlaGlyLeuThrHisThrLeuMetValAspAla145150155160gcaggatgggggcaatatccgcaatctattcatgattacggacaagat528AlaGlyTrpGlyGinTyrProGinSerlieHisAspTyrGlyGinAsp165170175gtgtttaatgcagatccgttaaaaaatacgatattctecatecatatg576ValPheAsnAlaAspProLeuLysAsnThrliePheSerlieHisMet180185190tatgagtatgetggtggtgatgetaacactgttagateaaata_ttgat624TyrGluTyrAlaGlyGlyAspAlaAsnThrValArgSerAsnlieAsp195200205agagtcatagatcaagaccttgetetcgtaataggtgagttcggtcat672ArgVallieAspGinAspLeuAlaLeuVallieGlyGluPheGlyHis210215220agacacactgatggcgatgttgatgaagatacaatecttagttattct720ArgHisThrAspGlyAspValAspGluAspThrlieLeuSerTyrSer225230235240gaagaaactggcscsggatggetcgettggtcttgga犯ggcaacagt768GluGluThrGlyThrGlyTrpLeuAlaTrpSerTrpLysGlyAsnSer245250255gccgaatgggattatttagaccttteagaagattgggetggtaaccat816AlaGluTrpAspTyrLeuAspLeuSerGluAspTrpAlaGlyAsnHis260265270ttaactgattggggaaataggattgtccacggggcaaatggcttgcag864LeuThrAspTrpGlyAsnArglieValHisGlyAlaAsnGlyLeuGin275280285gaaacctecaaaccatecaccgtatttaca894GluThrSerL>ysProSerThrValPheThr290295<210〉2<211〉298<212〉PRT<213>Artificial<400〉2SerSerGlyPheTyrValAspGlyAsnThrLeuTyrAspAlaAsnGly151015GinProPheValMetLysGlylieAsnHisGlyHisAlaTrpTyrLys202530AspThrAlaSerThrAlalieProAlalieAlaGluGinGlyAlaAsn354045ThrlieArglieValLeuSerAspGlyGlyGinTrpGluLysAspAsp505560lieA印ThrValArgGluVallieGluLeuAlaGluGinAsnLysMet65707580ValAlaValValGluValHisAspAlaThrGlyArgAspSerArgSer859095AspLeuAspArgAlaValAspTyrTrplieGluMetLysAspAlaLeu100105110lieGlyLysGluAspThrVallielieAsnlieAlaAsnGluTrpTyr115120125GlySerTrpAspGlyAlaAlaTrpAlaAspGlyTyrlieAspVallie130135140ProLysLeuArgAspAlaGlyLeuThrHisThrLeuMetValAspAla145150155160AlaGlyTrpGlyGinTyrProGinSerlieHisAspTyrGlyGinAsp165170175ValPheAsnAlaAspProLeuLysAsnThrliePheSerlieHisMet180185190TyrGluTyrAlaGlyGlyAspAlaAsnThrValArgSerAsnlieAsp195200205ArgVallieAspGinAspLeuAlaLeuVallieGlyGluPheGlyHis210215220ArgHisThrAspGlyAspValAspGluAspThrlieLeuSerTyrSer225230235240GluGluThrGlyThrGlyTrpLeuAlaTrpSerTrpLysGlyAsnSer245250255AlaGluTrpAspTyrLeuAspLeuSerGluAspTrpAlaGlyAsnHis260265270LeuThrAspTrpGlyAsnArglieValHisGlyAlaAsnGlyLeuGin275280285GluThrSerLysProSerThrValPheThr290295<210〉3<211>33<212>DNA<213>Artificial<400〉3ggactagttcttctggtttctacgttgatggca33<210〉4<211>28<212〉腿<213〉A(chǔ)rtificial〈400〉4cagcggccgcctatgtaaatacggtgga28權(quán)利要求1.一種用于制備堿性甘露聚糖酶的酵母基因工程菌株，其特征在于，該酵母基因工程菌株含有堿性甘露聚糖酶的突變體，該突變體的核苷酸編碼序列如SEQIDNO1所示；該酵母基因工程菌的宿主菌是鷹嘴豆胞克魯維酵母菌株Y179U，保藏號為CCTCCNo.M202031。2.如權(quán)利要求l所述的酵母基因工程菌株，其特征在于，所述堿性甘露聚糖酶的突變體的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。3.—種堿性甘露聚糖酶突變體的生產(chǎn)方法，其特征是，取權(quán)利要求1所述的基因工程菌株，在28-32'C條件下發(fā)酵2-8天，然后去除菌體，即得；發(fā)酵液初始菌濃度為0D6。。=0.4-0.6;發(fā)酵液pH值為5.0-7.0;發(fā)酵液中含有質(zhì)量體積比為0.5-3%的酵母粉和質(zhì)量體積比不低于2%的碳源。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征是，采用搖瓶發(fā)酵方式，發(fā)酵時間為3-4天。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征是，發(fā)酵液pH值為5.5-7.0。6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征是，發(fā)酵液中含有質(zhì)量體積比為0.5-2%的酵母粉。7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征是，碳源為菊粉或者葡萄糖。8.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征是，菊粉的濃度為4%-6%，質(zhì)量體積比。9.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征是，葡萄糖的濃度為2%-4%，質(zhì)量體積比。全文摘要本發(fā)明屬于遺傳工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域。本發(fā)明將堿性甘露聚糖酶基因的突變體MAN330克隆到分泌表達載體pUKDS上，并轉(zhuǎn)化鷹嘴豆胞克魯維酵母Y179U，形成分泌表達堿性甘露聚糖酶的鷹嘴豆胞克魯維酵母基因工程菌株。該酵母基因工程菌株在80世代內(nèi)保持穩(wěn)定。發(fā)酵時，取上述酵母基因工程菌株在常溫常壓下發(fā)酵，然后去除菌體即可。用本發(fā)明提供的方法制備獲得的堿性甘露聚糖酶，活性可達1000U/ml以上，發(fā)酵產(chǎn)量高，發(fā)酵周期短，發(fā)酵成本低，適用于推廣至工業(yè)化生產(chǎn)。文檔編號C12N1/19GK101475915SQ20091004539公開日2009年7月8日申請日期2009年1月15日優(yōu)先權(quán)日2009年1月15日發(fā)明者紅呂,賢潘,艾田,袁漢英,馬延和申請人:復(fù)旦大學(xué)