專利名稱：海水蛭弧菌微生態(tài)制劑的制備與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及
中水質凈化和細菌性疾病的防治。
種海水微生態(tài)制劑的制備，用于海水養(yǎng)殖過程
背景技術：
20世紀80年代以來，我國海水養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，不僅養(yǎng)殖品種豐富，而且均具較 高的經濟價值。但是一些不利于養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的現象也接踵而至，如單一品種的無 序發(fā)展，盲目提高養(yǎng)殖密度等均導致水質惡化及養(yǎng)殖病害的暴發(fā)。1993年以來對蝦、大黃魚 等養(yǎng)殖品種細菌性疾病的頻繁發(fā)生，給我國海水養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經濟損失，同時養(yǎng)殖 品種的集約化生產方式，在一定程度上更加劇了疾病的流行速度。目前清除養(yǎng)殖過程中出 現的致病菌采用藥物療法，但抗生素的盲目使用、濫用，引發(fā)了細菌抗藥性、藥物殘留等一 系列問題。 蛭弧菌(Bdellovibrio)是1962年發(fā)現的一類以攻擊和裂解其它細菌來完成自 身生長、繁殖的寄生菌。它廣泛存在于自然水體、土壤，以及人類與動物的糞便中，能裂解 大多數科、屬的革蘭氏陰性菌，尤其對水產動物常見致病菌都有良好的裂解活性。蛭弧菌 對污水中的沙門氏菌屬的細菌有重要的清除作用。在滅菌的自來水、湖水及模擬自然條件 下的河水中，蛭弧菌對大腸桿菌、沙門氏菌、痢疾桿菌、霍亂弧菌等清除效率達90%以上，甚 至100%。所以蛭弧菌在水質凈化和細菌性疾病的生物防治方面被認為有著良好的應用前 景。目前雖然國內外已有一些關于蛭弧菌制劑產品，但它們基本來源于淡水，并不適合海水 養(yǎng)殖過程，而且效價方面也有待進一步提高。 海水蛭弧菌制劑可改良海水養(yǎng)殖池的微生態(tài)環(huán)境，抑制弧菌等致病菌的繁殖，減 少或避免化學消毒劑引起的水環(huán)境生態(tài)平衡的破壞，以及濫用抗生素引起的細菌抗藥性、 藥物殘留問題，提高育苗的存活率，使用更加安全。它作為一種"活性抗生素"有著廣闊的 發(fā)展空間。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種適合于海水養(yǎng)殖用的蛭弧菌制劑的制備及應用方法。
本發(fā)明的技術方案由以下步驟組成制備宿主菌懸液；蛭弧菌的分離、純化；蛭弧 菌增殖培養(yǎng)，其特征是將非致病性施氏假單胞菌接斜面活化后，在試管中加入2ml左右的 生理鹽水制得菌懸液，然后用營養(yǎng)肉湯增殖培養(yǎng)18-24h，在所得菌液中加入絮凝劑，搖勻后 靜置2-5h，收集沉淀，加入生理鹽水即得到1012cfu/mL的宿主菌懸液；采用雙層瓊脂平板法 對采集的海水和底泥樣品進行蛭弧菌的分離和純化，將含有宿主菌懸液和采集樣品的培養(yǎng) 基混勻后倒入預先制備的下層海水瓊脂上培養(yǎng)6 7天，在含宿主菌的雙層平板出現噬菌 斑，根據噬菌斑的大小形態(tài)、清晰度和色素對分離得到的噬菌斑進行分類，采用單斑傳代， 挑取不斷擴大的單斑重復三次以上，至形成形狀、大小、透明度均一致的噬菌斑為止，即得 蛭弧菌純菌株；將宿主菌和分離得到的蛭弧菌加入到滅菌天然海水中，用滅菌紗布封口 ，搖
3床培養(yǎng)一周，至蛭弧菌濃度為108 1(fpfu/mL，備用。將蛭弧菌濃縮液與牛奶蔗糖穩(wěn)定劑 混合，混合比例為1 : 5，置于_40"條件下預凍3小時，然后在2 7mTorr真空度條件下 進行冷凍干燥18 24h，即獲得蛭弧菌凍干制劑。在海水養(yǎng)殖水體中加入蛭弧菌制劑應用 濃度范圍為10 104pfu/mL。 本發(fā)明具有在不同生境下再殖能力較強特點，保證了蛭弧菌的裂解活性，能較好 地裂解絕大多數水產致病菌，提高了水產病害防治效果。所采用的宿主菌——施氏假單胞 菌為非致病菌，避免了環(huán)境污染，使用起來更加安全。在海水養(yǎng)殖水體中加入蛭弧菌制劑 應用濃度范圍為10 104pfu/mL不僅可以凈化水質，在養(yǎng)殖過程中還可起到病害防治的作 用。養(yǎng)殖水體添加蛭弧菌后細菌增長受到抑制，細菌總數和弧菌數均降低了 1 2個數量 級。在鋸緣青蟹育苗過程中添加蛭弧菌，不僅水質得到凈化，各期幼體的變態(tài)率和成活率也 明顯提高。
具體實施方式

實施例一 海水蛭弧菌的分離、純化及其濃縮液的制備
1、宿主菌懸液的制備 將施氏假單胞菌(中國科學院微生物所提供)接斜面活化、培養(yǎng)18 24h，在試 管中加入2ml左右的生理鹽水制得菌懸液，再接到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，3(TC下用搖床液體 培養(yǎng)18 24h。在所得菌液中加入1%的低聚殼聚糖作為絮凝劑，以150r/min速度攪拌均 勻，然后采用多層聚酯高效過濾袋過濾，收集沉淀。最后加入生理鹽水即得到10 fu/mL的 宿主菌懸液，可在fC下可保存10d。
2、蛭弧菌的分離、純化 采用雙層瓊脂平板法對采集的海水、底泥樣品進行蛭弧菌的分離和純化，方法是 取5mL上層培養(yǎng)基滅菌后45t:保溫，加入200 y L的宿主菌懸液和500 y L的樣品液，混勻 后傾注于預先制備的下層海水瓊脂上，凝固后2『C倒置培養(yǎng)，連續(xù)觀察6 7d。根據噬菌 斑的大小形態(tài)、清晰度和色素對分離得到的噬菌斑進行分類，采用單斑傳代，將噬菌斑從平 板上挖出置入裝有1/10YP浸出液的試管中溫浴8h，然后用浸出液再倒雙層平板培養(yǎng)，至少 重復三次，直到平板上出現大小、形態(tài)、透明度一致的噬菌斑為止，將得到的蛭弧菌純菌株 Bdh5221樣品置于4。C保藏。
3、蛭弧菌增殖培養(yǎng) 分離所得蛭弧菌的液體增殖是在裝有95mL的滅菌天然海水的錐形瓶中加入 0. 2mL施氏假單胞菌菌懸液和5mL蛭弧菌浸出液混勻，用八層滅菌紗布封口，于28°C、 pH 7. 4 7. 6、110r/min轉速下搖床培養(yǎng)，連續(xù)觀察一周，至濃度為108 109pfu/mL的蛭弧菌 濃縮液待用。蛭弧菌計數采用雙層瓊脂平板上噬菌斑計數法。
實施過程中所涉及的培養(yǎng)基配方如下 宿主培養(yǎng)基宿主培養(yǎng)用培養(yǎng)基為營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，即牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯 化鈉15g，蒸餾水或天然海水1000ml (鹽度為30%。左右)，121。C滅菌30min。
營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基牛肉膏粉3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂粉14g，蒸餾水或天然 海水1000ml (鹽度為30左右)，121。C滅菌30min。
4
雙層培養(yǎng)基蛭弧菌篩選、分離和純化用培養(yǎng)基均為雙層瓊脂，下層為1. 0%瓊脂 的海水瓊脂，上層用0. 5%瓊脂的天然海水瓊脂，12rC滅菌30min。 浸出液S卩1/10YP浸出液，為酵母膏0. 03g，蛋白胨0. 006g，天然陳海水1000ml，
12rC滅菌30min，用于將蛭弧菌從雙層平板中浸出。 實施例二 海水蛭弧菌的保存 將蛭弧菌濃縮液與牛奶蔗糖穩(wěn)定劑按1 : 5的比例混合均勻，得到待凍干的混合 液。牛奶蔗糖穩(wěn)定劑組成5%蔗糖+10%脫脂奶粉+85%去離子水。穩(wěn)定劑需經過高壓滅 菌處理，無菌檢查合格后備用。 將上述混合液分裝，在_401:條件下先預凍3小時，然后用凍干機于_80°C、2 7mTorr真空度條件下對其進行冷凍干燥18 24h，即獲得蛭弧菌凍干制劑。
實施例三 蛭弧菌在凈化海水養(yǎng)殖池水中的應用 為研究蛭弧菌在凈化海水養(yǎng)殖池水中的應用，本發(fā)明用蛭弧菌Bdh5221對南美 白對蝦養(yǎng)殖池水進行了處理。試驗容器為125mL的水族箱，水溫25t:，試驗用水為未處 理過的對蝦養(yǎng)殖池水，每個水族箱內投放南美白對蝦IO尾，蛭弧菌的添加濃度分別為 1. 5 X 10丄pfu/mL (試驗組一 )、1. 5 X 102pfu/mL (試驗組二 ) 、 1. 5 X 103pfu/mL (試驗組三)， 并設置不添加蛭弧菌Bdh5221的對照組，采用24h曝氣，連續(xù)培養(yǎng)一周。實驗期間記錄細菌 總菌、弧菌數和蛭弧菌數，并不時觀察對蝦成活情況，結果見表1。
表1.蛭弧菌處理后對蝦養(yǎng)殖池水中微生物數量的檢測結果
細菌總數對照組3,6xl06l,4x:106l.lx:1069.9 :IO51.1>:IO5
(cfu /mL)試驗組一3.6x:1067,65:<1051.5>2.5>(1048.75:xlO3
試驗組二3.6x1067.05:<1051,7>2.9>-1049.0 :103
試驗組三3.6x1067,25:<1051.1>-1052,45:xlO48.6x:IO3
弧菌數對照組2,39:<1051.25:<1059.5>7,5>:1046.75:xlO4
(cfu /mL )試驗組一2.39:<1056,35-<1043.1>-1045》:IO35.4》:102
試驗組二2.39:<1057.6x1042.85xlO46.5>:IO3:102
試驗組三2,39:<1057,3xIO41.2xl045》:1035》:102
蛭弧菌數對照組2.3〉<107.6:XlO9.9: 108.7:<10
(pfu/mL)試驗組一1.5x1.38:xlO21.3>3》2.6>:IO3
試驗組二1.5x:1026.0:1021.6xl032.0>3.0>
試驗組三l》:IO33,4》:1021.2><1033.0〉<1042,2>⑨3 從表1可看出，各試驗組的細菌總數和弧菌數與對照組相比均顯著下降，而且相 差近1 2個數量級，蛭弧菌的數量上升也較為明顯，即使是最低的蛭弧菌接種濃度也能達 到較好的增殖生長效果，說明該蛭弧菌具有較強的再殖能力。從有效性和池塘應用的經濟 成本考慮，選擇添加1. 5X 1(^pfu/mL海水蛭弧菌株即可。就對4下成活率而言，與對照組沒 有差別。上述結果不僅說明了本海水菌株Bdh5221的安全性，也證實了將蛭弧菌應用于凈 化海水養(yǎng)殖池水是可行的。
實施例四 蛭弧菌在鋸緣青蟹種苗培育中的應用 首先進行了蛭弧菌Bdh5221對鋸緣青蟹潘狀幼體的安全性試驗，在添加蛭弧菌濃 度為2. OX 101、2. OX 102、2. OX 103、2. OX 104pfu/mL后，觀察鋸緣青蟹各個時期的成活率 和變態(tài)率與對照組相差不大，未出現明顯下降，甚至部分試驗組的更高，表明海水蛭弧菌 Bdh5221可以進一步應用于鋸緣青蟹種苗培育。 培育實驗容器為0. 5m3黑色玻璃鋼水槽，每個水槽放置兩個充氣石；水槽內青蟹潘 狀I期幼體的放養(yǎng)量均為3. 5萬個；育苗用水經5X10—e次氯酸鈉消毒處理12h后，用硫代硫酸鈉除去余氯的沙濾海水，鹽度30%。，培育水溫27. 5 30. 5t:，光照度1000 100001ux。 設試驗組和對照組，試驗組在幼體放入后及每次蟹苗變態(tài)前添加蛭弧菌Bdh5221，使培育水 中的蛭弧菌數量達到2. 5X 1(^pfu/mL，對照組俺常規(guī)育苗方法在幼體放入后及每次蟹苗變 態(tài)前添加抗生素(恩諾沙星、氟苯尼考等，添加濃度為1.5X10—6)。試驗期間檢測指標包括 細菌總數、弧菌數量、蛭弧菌數量、pH、 N02-N、 N03-N、 NH4-N、 COD等。并在蟹苗變態(tài)當天夜間 用容量法取樣技術，測算蟹苗變態(tài)、成活率。其結果如下 表2.蛭弧菌應用于鋸緣青蟹育苗期間微生物數量及水質指標檢測結果
蟹苗發(fā)育天數(d) 1 5 9 11 13 15
細菌總數對照組3.0X1041.9X1067.3 X1071.2 X1089.6 XIO72.6 X 108
(cfu/L)試驗組3.0 X1044.1 X1056.3 X1076.0 X1065.6 XIO68.5 XIO6
弧菌數對照組2.2 X1024.0 X1039.1 X1051.1 xio75.39 X 10s1.6X107
(cfu/L)試驗組2.2 X1023.5X1034.9 X1055.0X1055.3 XIO56.5 XIO5
蛭弧菌數對照組—9.2 X101i.oxio28.2X10'1.3 XIO20.8 XIO2
(pfo/L)試驗組2.5 X1012.2X1037.0 X1039,6 XIO33.0X1041.2X104
對照組8.298.008.058.107.287.84
pH
試驗組8.297.978,068.107.287.84
NOrN對照組0.0000390.00220.01100.01980.01780.0185
(mg/L)試驗組0.0000390.00220.00970.01590.01470,0181
NOrN對照組0,002110.00210,04790.03320.04430,0345
(mg/L)試驗組0.002110.02080.03200.03360.03320.0208
NH4-N對照組0.00840.30921.86672.4292.7713.024
(mg/L)試驗組0細40.30791.74022.1852.6632.681
COD對照組5.2115.1044.71742.8433.6152.873
(mg-CVL)試驗組5,2115.1414,72162,8703.6892.822 從表2結果可以看出，添加蛭弧菌Bdh5221試驗組的弧菌數在青蟹潘狀幼體進入 V階段后基本維持在一個水平不再上升，比對照組降低了 1 2個數量級，細菌總數的消長 表現出了與弧菌數量同樣的變化趨勢。另外水質檢測結果顯示，試驗組和對照組的N02-N、 NOfN、NH廠N含量在育苗初期相差不大，都處于較低水平，但是隨著時間推移，試驗組三者的 含量明顯要比對照組上升慢，尤其是NH4-N檢測值比對照組低0. 11 0. 34mg/L。可見海水 蛭弧菌Bdh5221不僅對養(yǎng)殖水體中弧菌數有抑制作用，而且還能使整個水體的水質有所改
8善。 表3.鋸緣青蟹幼體各期成活、變態(tài)率的比較
成活率0/。 變態(tài)率％
對照組 試驗組 對照組 試驗組
潘狀I期訓100一一
潘狀II期61,464,360.563.8
潘狀III期42.947.239.645.8
潘狀rv期38.147.636.245.5
潘狀v期18.325.110.413.6
大眼幼體3.29,82.99.2 表3結果可看出，試驗組在幼體各期的存活、變態(tài)率與對照組存在明顯的差異，均 高于對照組。海水蛭弧菌Bdh5221的加入，使水體微生態(tài)環(huán)境得到調節(jié)、保持平衡，到大眼 幼體的存活率和變態(tài)率分別比對照組提高了 6. 6%、6. 3%。
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權利要求
海水蛭弧菌微生態(tài)制劑的制備與應用，由以下步驟組成制備宿主菌懸液；蛭弧菌的分離、純化；蛭弧菌增殖培養(yǎng)，其特征是將非致病性施氏假單胞菌接斜面活化后，在試管中加入2ml左右的生理鹽水制得菌懸液，然后用營養(yǎng)肉湯增殖培養(yǎng)18-24h，在所得菌液中加入絮凝劑，搖勻后靜置2-5h，收集沉淀，加入生理鹽水即得到1012cfu/mL的宿主菌懸液；采用雙層瓊脂平板法對采集的海水和底泥樣品進行蛭弧菌的分離和純化，將含有宿主菌懸液和采集樣品的培養(yǎng)基混勻后倒入預先制備的下層海水瓊脂上培養(yǎng)6～7天，在含宿主菌的雙層平板出現噬菌斑，根據噬菌斑的大小形態(tài)、清晰度和色素對分離得到的噬菌斑進行分類，采用單斑傳代，挑取不斷擴大的單斑重復三次以上，至形成形狀、大小、透明度均一致的噬菌斑為止，所得即蛭弧菌純菌株；將宿主菌和分離得到的蛭弧菌加入到滅菌天然海水中，用滅菌紗布封口，搖床培養(yǎng)一周，至蛭弧菌濃度為108～109pfu/mL。
2. 根據權利要求1所述的海水蛭弧菌微生態(tài)制劑的制備與應用，其特征是絮凝劑為低 聚殼聚糖，用量為1%。
3. 根據權利要求1所述的海水蛭弧菌微生態(tài)制劑的制備與應用，其特征是分離和純 化采用的雙層瓊脂下層為1. 0%瓊脂的海水瓊脂，上層用0. 5%瓊脂的天然海水瓊脂，鹽度 30%。左右，121。C滅菌30min。
4. 根據權利要求1所述的海水蛭弧菌微生態(tài)制劑的制備與應用，其特征是將蛭弧菌濃 縮液與牛奶蔗糖穩(wěn)定劑按l : 5的比例混合均勻，得到待凍干的混合液；牛奶蔗糖穩(wěn)定劑組 成5%蔗糖+10%脫脂奶粉+85%去離子水。
5. 根據權利要求4所述的海水蛭弧菌微生態(tài)制劑的制備與應用，其特征是將蛭弧菌濃 縮液與牛奶蔗糖穩(wěn)定劑混合后待凍干的混合液置于_401:條件下預凍3小時，然后在凍干 機于-80°C、2 7mTorr真空度條件下進行冷凍干燥18 24h，即獲得蛭弧菌凍干制劑。
6. 根據權利要求1或2或3或4或5所述的海水蛭弧菌微生態(tài)制劑的制備與應用，其 特征是在海水養(yǎng)殖水體中加入蛭弧菌的應用濃度范圍為10 104pfu/mL。
全文摘要
海水蛭弧菌微生態(tài)制劑的制備與應用，涉及一種海水微生態(tài)制劑，需要提供適合于海水養(yǎng)殖用的蛭弧菌制劑的制備方法。本發(fā)明由以下步驟組成制備宿主菌懸液；蛭弧菌的分離、純化；蛭弧菌增殖培養(yǎng)，其特征是將施氏假單胞菌接斜面活化后，在試管中加入生理鹽水制得菌懸液，然后用營養(yǎng)肉湯增殖培養(yǎng)，在所得菌液中加入絮凝劑，搖勻后靜置沉淀，加入生理鹽水得到1012cfu/mL的宿主菌懸液；用雙層瓊脂平板法對采集的海水和底泥樣品進行蛭弧菌的分離和純化，將含有宿主菌懸液和采集樣品的培養(yǎng)基混勻后倒入下層海水瓊脂上培養(yǎng)，將宿主菌和分離得到的蛭弧菌加入到滅菌天然海水中培養(yǎng)至蛭弧菌濃度為108～109pfu/mL，備用。
文檔編號C12N1/20GK101781627SQ20091004551
公開日2010年7月21日 申請日期2009年1月19日 優(yōu)先權日2009年1月19日
發(fā)明者周帥, 房文紅, 胡琳琳, 謝群英 申請人:中國水產科學研究院東海水產研究所