專利名稱：：體外刺激樹突狀細(xì)胞成熟的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及用膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣抗原體外刺激樹突狀細(xì)胞成熟的方法。另外，本發(fā)明還涉及由此制備的成熟的樹突狀細(xì)胞在治療藥物方面的應(yīng)用、以及膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣抗原的制備方法和其應(yīng)用等。二，
背景技術(shù)：
：膠質(zhì)瘤(glioma)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤，其中惡性者(WHOin、IV級(jí))治愈率低，復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差。由于大多數(shù)膠質(zhì)瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，與正常組織無明顯分界，所以單靠手術(shù)無法根治。雖然術(shù)后輔助化療、放療，但效果仍不理想，惡性膠質(zhì)瘤的中位生存期僅51周，需要進(jìn)一步研究尋找更有效的治療方案。，以往認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)是免疫豁免區(qū)，但近年來的研究表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)不但存在著樹突狀細(xì)胞(dendriticcell)，而且抗瘤效果明顯，尤其是小膠質(zhì)細(xì)胞在其中發(fā)揮了重要作用。例如，F(xiàn)ischer等人將小鼠的腦組織與GM-CSF—起培養(yǎng)，從中得到了依賴于星形細(xì)胞的具有良好的抗原提呈功能的樹突狀細(xì)胞。肖保國(guó)等人發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細(xì)胞在GM-CSF的刺激下可以轉(zhuǎn)變?yōu)闃渫粻罴?xì)胞樣細(xì)胞。樹突狀細(xì)胞是目前已知最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，具有啟動(dòng)初次免疫應(yīng)答的能力，在抗腫瘤免疫治療中具有重要地位。中國(guó)專利申請(qǐng)CN101090633A公開了用未成熟的樹突狀細(xì)胞來治療腫瘤的方法，但是更多的報(bào)道是用成熟的樹突狀細(xì)胞來用于治療。例如，中國(guó)專利申請(qǐng)CN1462195A公開了用成熟的樹突狀細(xì)胞治療I型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫疾病，其中成熟的樹突狀細(xì)胞是通過IFN-gamma、TNF-alfa、TGF-beta、IL-10等細(xì)胞因子體外刺激未成熟的樹突狀細(xì)胞而制備得到的。中國(guó)專利申請(qǐng)CN1738619A也公開了用體外部分成熟的樹突狀細(xì)胞治療患者結(jié)腸癌等腫瘤的方法，其中樹突狀細(xì)胞的部分成熟是在卡介苗、干擾素、脂多糖、腫瘤壞死因子等細(xì)胞成熟劑的刺激下完成的，在其實(shí)施例1中僅披露了與PKH67-A549腫瘤細(xì)胞，而不是與腫瘤相關(guān)抗原混合孵育。中國(guó)專利CN1141975C公開了一種腫瘤相關(guān)抗原的制備方法，包括破碎、滅活腫瘤細(xì)胞，然后提取可溶性抗原蛋白，其中沒有提示要使用X射線來處理腫瘤細(xì)胞抗原的步驟，也沒有提示將其用于體外剌激未成熟的樹突狀細(xì)胞成熟而進(jìn)行治療。中國(guó)專利CN100392074C公開了電穿孔導(dǎo)入針對(duì)肝癌等的腫瘤抗原mRNA來刺激樹突狀細(xì)胞成熟的方法，該方法沒有提示使用X射線來處理腫瘤相關(guān)抗原，相反還優(yōu)選提示對(duì)成熟的樹突狀細(xì)胞進(jìn)行滅活。中國(guó)專利申請(qǐng)CN1471575A公開了一種冷藏成熟的樹突狀細(xì)胞的方法，優(yōu)選未成熟的樹突狀細(xì)胞是從CD14+或CD34+細(xì)胞制備的，但是沒有提示處理腫瘤相關(guān)抗原的步驟。目前國(guó)內(nèi)外研究的焦點(diǎn)絕大多數(shù)還集中在非干細(xì)胞樣抗原。Pellegatta等人提出了一種制備腫瘤相關(guān)抗原的方法(CancerRes.2006,66(21):10247-10252),但是沒有提出分選諸如CD133+或A2B5+等干細(xì)胞樣細(xì)胞的步驟，更沒有提示包括X射線處理腫瘤相關(guān)抗原的步驟。然而，膠質(zhì)瘤具有一定的免疫逃避特性是目前膠質(zhì)瘤免疫治療效果不滿意的主要根源。究其原因，我們認(rèn)為與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞(stem-likecell)有因果關(guān)系。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞免疫原性弱，遺傳性狀高度不穩(wěn)定，可通過突變而喪失腫瘤抗原，或通過腫瘤細(xì)胞等位基因缺失或表達(dá)下調(diào)而降低腫瘤抗原量，從而抑制了腫瘤細(xì)胞表面抗原的遞呈。因此，上述現(xiàn)有技術(shù)會(huì)受困于膠質(zhì)瘤的免疫逃避特性而效果不理想。針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，經(jīng)過長(zhǎng)期艱苦的研究，本發(fā)明人提出了一種新的體外刺激能用于治療膠質(zhì)瘤的樹突狀細(xì)胞成熟的方法，其中未成熟的樹突狀細(xì)胞與由膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞經(jīng)X射線處理制備得到的相應(yīng)腫瘤相關(guān)抗原一起孵育，由此制得的樹突狀細(xì)胞能夠顯著提高其介導(dǎo)的CTL殺傷效果，從而提高膠質(zhì)瘤的治療效果；另外，本發(fā)明人優(yōu)選出其中膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)和收集方法，收集的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞(如CD133+或A2B5+細(xì)胞)制備而成的相應(yīng)腫瘤相關(guān)抗原，最終也能通過與樹突狀細(xì)胞孵育，而進(jìn)一步提高CTL殺傷效果。除了膠質(zhì)瘤療夢(mèng)改進(jìn)之外,本發(fā)明還具有操作簡(jiǎn)便易行、成本較低、質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。三，
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供了用膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣抗原體外刺激樹突狀細(xì)胞成熟的方法，其中用X射線輻照膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)物制備的膠質(zhì)瘤相關(guān)抗原，從而能顯著提高成熟的樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的CTL殺傷效果。而且，本發(fā)明的目的還在于在體外刺激樹突狀細(xì)胞成熟的方法中提供培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的優(yōu)選方案，也能進(jìn)一步提高成熟的樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的CTL殺傷效果。另外，本發(fā)明還提供了由此制備的成熟的樹突狀細(xì)胞在治療藥物方面的應(yīng)用、以及膠質(zhì)瘤相關(guān)抗原的制備方法和其應(yīng)用等。具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了體外刺激樹突狀細(xì)胞成熟的方法，其包括(1)培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，并收集分選CD133+或A2B5+干細(xì)胞樣細(xì)胞；(2)用X射線輻照步驟(1)所收集的細(xì)胞，制成膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣抗原；(3)未成熟的樹突狀細(xì)胞在樹突狀細(xì)胞成熟劑存在的條件下成熟，其中所述樹突狀細(xì)胞成熟劑包括步驟(2)制成的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣抗原。以上過程均在體外進(jìn)行，獲得成熟的樹突狀細(xì)胞。本發(fā)明人經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，通過X射線輻照使步驟(1)所收集的細(xì)胞凋亡而制備的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣抗原能取得更好的效果，因此制備膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣抗原的步驟(2)中采用X射線輻照處理。其中，X射線輻照的強(qiáng)度可以為7-9Gray，優(yōu)選為6Gray。經(jīng)X射線輻照使細(xì)胞凋亡后，可以簡(jiǎn)單地收集凋亡的細(xì)胞，例如反復(fù)吹打凋亡的細(xì)胞后高速離心收集蛋白混合物，即制成膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣抗原。該抗原可于-2(TC凍存。在本發(fā)明中，膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以是原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞系或膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株，優(yōu)選是來自人的原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞系或膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株。例如，膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以是外科手術(shù)中獲得的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，如在本發(fā)明具體實(shí)施方式中所用的SHG62或SHG66(可參見中國(guó)臨床神經(jīng)科學(xué)，200816(6):565-571，其作者可以在知情同意時(shí)發(fā)放，用于非商業(yè)目的)；膠質(zhì)瘤細(xì)胞也可以是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，如本發(fā)明具體實(shí)施方式中所用的U87或U251(購自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所)。本發(fā)明的具體實(shí)施方式特別優(yōu)選膠質(zhì)瘤細(xì)胞是膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87。步驟(1)中培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基優(yōu)選為無血清培養(yǎng)基，尤其優(yōu)選本發(fā)明實(shí)施例中所使用的無血清培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱為SFM)，其是DMEM/F12培養(yǎng)基，其中添加有20ng/ml堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)、20pg/ml表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和2(Vg/mlB27。這樣培養(yǎng)出的細(xì)胞較少分化，保留有腫瘤干細(xì)胞樣特性。由于即使使用上述無血清培養(yǎng)基，其中大部分為干細(xì)胞樣細(xì)胞，仍舊會(huì)有少量細(xì)胞會(huì)分化，因此優(yōu)選步驟(1)中收集培養(yǎng)出的細(xì)胞的步驟包括分選00133+或A2B5+干細(xì)胞樣細(xì)胞的過程。這樣，步驟(1)中收集的細(xì)胞為CD133+或A2B5+干細(xì)胞樣細(xì)胞。由于CD133+細(xì)胞是目前公認(rèn)的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞(Nature,2004，432:396-401)，因此更優(yōu)選步驟(1)中收集培養(yǎng)出的細(xì)胞的步驟包括分選CD133+細(xì)胞的過程。這樣，步驟(1)中收集的細(xì)胞為CD133+干細(xì)胞樣細(xì)胞。這樣便能夠保留腫瘤干細(xì)胞樣特性。這樣培養(yǎng)分選出的干細(xì)胞獲得的抗原比在含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)出的細(xì)胞抗原效果更好。因此，本發(fā)明的步驟(1)中培養(yǎng)出的細(xì)胞優(yōu)選為CD133+細(xì)胞，也優(yōu)選為A2B5+細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞。由此，步驟(1)中收集培養(yǎng)出的細(xì)胞的步驟優(yōu)選包括分選CD133+細(xì)胞的過程。即可以在步驟(1)收集培養(yǎng)出的細(xì)胞的過程中，包括分選出CD133+細(xì)胞的步驟。分選的方法可以采用磁化抗體來分離，例如可使用抗CD133的磁化抗體(購自Miltenyibiotec)來分選出CD133+細(xì)胞。使用步驟(2)制備出的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣抗原刺激未成熟的樹突狀細(xì)胞成熟。未成熟的樹突狀細(xì)胞的制備方法是現(xiàn)有已知的，如本文
背景技術(shù)：
部分所列舉的文獻(xiàn)所述的，也優(yōu)選使用本文實(shí)施例的制備方法，從外周血單核細(xì)胞制備出未成熟的樹突狀細(xì)胞。刺激未成熟的樹突狀細(xì)胞成熟的樹突狀細(xì)胞成熟劑優(yōu)選還包括現(xiàn)有技術(shù)中常用的細(xì)胞成熟劑，如本文
背景技術(shù)：
部分所列舉的文獻(xiàn)所述的那些。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，所述樹突狀細(xì)胞成熟劑優(yōu)選包括GM-GSF和IL-4。經(jīng)過樹突狀細(xì)胞成熟劑處理后，優(yōu)選還可以包括檢測(cè)樹突狀細(xì)胞成熟的步驟，收集成熟的樹突狀細(xì)胞。檢測(cè)樹突狀細(xì)胞成熟的技術(shù)是現(xiàn)有已知的，例如可以通過檢測(cè)樹突狀細(xì)胞表面的HLA-A、HLA-DR及CD80、CD86等相關(guān)分子來進(jìn)行，由此收集成熟的樹突狀細(xì)胞。在第二方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面的方法刺激成熟的樹突狀細(xì)胞。本發(fā)明的成熟的樹突狀細(xì)胞由于優(yōu)選了刺激方法中所用的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣抗原，因而使其具能誘導(dǎo)出更優(yōu)良的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)的細(xì)胞毒性。該成熟的樹突狀細(xì)胞可用于誘導(dǎo)CTL的殺傷能力，因而可用于臨床治療。本發(fā)明的成熟的樹突狀細(xì)胞可以采用任何適于給藥的劑型和方式進(jìn)行給藥，優(yōu)選配制成注射劑進(jìn)行給藥。例如，該成熟的樹突狀細(xì)胞可與藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合，通過注射器、導(dǎo)管或插管或皮下等給藥。因此，在第三方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第二方面的成熟的樹突狀細(xì)胞在制備治療膠質(zhì)瘤的藥物中的應(yīng)用。成熟的樹突狀細(xì)胞可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法與藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑、緩沖液或稀釋劑一起配制成藥物，用于治療患者的膠質(zhì)瘤。成熟的樹突狀細(xì)胞也可作為藥物，直接給與需要治療的膠質(zhì)瘤患者。例如，成熟的樹突狀細(xì)胞可直接注射入患者腫瘤內(nèi)、腫瘤近旁或鄰近腫瘤的血管或淋巴管內(nèi)或皮下。例如，向膠質(zhì)瘤患者注射成熟的樹突狀細(xì)胞，如每隔1周皮下注射2~4><106個(gè)成熟的樹突狀細(xì)胞，共進(jìn)行3周。本發(fā)明的成熟的樹突狀細(xì)胞可用于單獨(dú)給藥進(jìn)行治療。此外，本發(fā)明的成熟的樹突狀細(xì)胞也可以與其他腫瘤治療方法組合使用來治療膠質(zhì)瘤。例如，本發(fā)明的成熟的樹突狀細(xì)胞可與腫瘤外科手術(shù)、化療(細(xì)胞毒性藥物，凋亡試劑，抗體等等)-、放射療法、冷凍療法、近距療法和其他免疫療法(如，給藥其他抗原特異性成熟的活化樹突細(xì)胞、NK細(xì)胞，腫瘤抗原特異性抗體、添加佐劑等)之一種或多種來組合使用。組合使用時(shí)，不同的療法可以同時(shí)或依次進(jìn)行。除了涉及成熟的樹突狀細(xì)胞的發(fā)明外，本發(fā)明還涉及以下幾個(gè)方面。在第四方面，本發(fā)明提供了制備膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣抗原的方法，其包括-(1)培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，并收集分選培養(yǎng)出的細(xì)胞；(2)用X射線輻照步驟(1)所收集的細(xì)胞，制成膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣抗原。以上方法中的具體特征如本發(fā)明第一方面所述。例如其中，X射線輻照的強(qiáng)度特別優(yōu)選為6Gray。又如其中，膠質(zhì)瘤細(xì)胞特別優(yōu)選是膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87。在第五方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第四方面的方法制備的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣抗原。用其刺激成熟的樹突狀細(xì)胞具有更好的誘導(dǎo)特性。因而，在第六方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第五方面的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣抗原在體外剌激樹突狀細(xì)胞成熟的方法中的應(yīng)用。例如，該膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣抗原在本發(fā)明第一方面的方法中的應(yīng)用。為了便于理解，以下將通過具體的附圖、實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對(duì)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的。另外，本發(fā)明引用了公開文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)是為了更清楚地描述本7發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本文中重復(fù)敘述過一樣。四，圖1:誘導(dǎo)前(SFM中培養(yǎng))的膠質(zhì)瘤細(xì)胞球表達(dá)CD133和Nestin;Vimentin在細(xì)胞球和血清誘導(dǎo)分化的細(xì)胞均表達(dá)；膠質(zhì)瘤細(xì)胞在血清誘導(dǎo)分化后可表達(dá)GFAP、CNPase禾口0-tubulin。五，具體實(shí)施例方式以下本文將通過具體的實(shí)施例來描述發(fā)明。如未特別指明之處，可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的《分子可隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)(ColdSpringHarborlaboratoryPress)、《細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社，北京，中國(guó)，2001年)、《RNA實(shí)驗(yàn)歿術(shù)手冊(cè)》(科學(xué)出版社,北京，中國(guó)，2004年)、《免疫檢測(cè)技術(shù)》(科學(xué)出版社,北京，中國(guó)，1991)等實(shí)驗(yàn)手冊(cè)以及本文所引用的參考文獻(xiàn)中所列方法來實(shí)施。實(shí)施例l，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)和分選膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG62和SHG66分別是來源于神經(jīng)外科手術(shù)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(可參見-中國(guó)臨床神經(jīng)科學(xué)，200816(6):565-571，其作者可以在知情同意時(shí)發(fā)放用于非商業(yè)目的)；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87可購自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所。以上細(xì)胞分別以lx105個(gè)細(xì)胞/mL的濃度在含血清的培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱為SCM)和無血清培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱為SFM)中各自培養(yǎng)。SCM是添加了10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；SFM是DMEM/F12培養(yǎng)基，其中添加有20嗎/ml堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)、20^ig/ml表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和20ng/mlB27添加因子。細(xì)胞培養(yǎng)條件為37'C、95%空氣、5"/。C02和100%濕度，并且每周傳代兩次。SHG62、SHG66和U87細(xì)胞都能在SCM和SFM中穩(wěn)定傳代。通過顯微鏡檢査發(fā)現(xiàn)，SCM中培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁分化為梭形，帶有突出；而SFM中培養(yǎng)的細(xì)胞傾向于懸浮生長(zhǎng)形成神經(jīng)球樣(以下稱為腫瘤球)，僅有小部分分化，傳代時(shí)棄去分化的細(xì)胞。分別用抗CD133(購自Miltenyibiotec)、抗Nestin(購自Chemicon)的小鼠抗人抗體等作為一抗，將FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體作為二抗，通過細(xì)胞免疫組織化學(xué)分析生長(zhǎng)形成腫瘤球的細(xì)胞的表面標(biāo)記。結(jié)果如圖1所示。生長(zhǎng)形成腫瘤球的細(xì)胞為CD133和Nestin陽性。然后，對(duì)SFM中培養(yǎng)的細(xì)胞使用流式細(xì)胞儀分選，其過程為將SFM中培養(yǎng)的干細(xì)胞樣細(xì)胞用0.2S膠原酶IV37'C消化5分鐘，再用400目鋼篩過濾，制備單細(xì)胞懸液，然后根據(jù)廠商說明書記載，用CD133/1-PE(MiltenyiBiotech)標(biāo)記后用流式細(xì)胞儀分選，收集陽性細(xì)胞，即分選出CD133+千細(xì)胞樣細(xì)胞。或者，代替使用流式細(xì)胞儀分選，可以對(duì)SFM中培養(yǎng)的細(xì)胞使用磁珠分選方法分選，其過程為同上制備單細(xì)胞懸液，然后根據(jù)廠商說明書記載，用CD133/1磁珠抗體(MiltenyiBiotech)標(biāo)記后在磁場(chǎng)中過柱(相應(yīng)廠商的配套專用柱)，撤除磁場(chǎng)后用1XPBS洗脫黏附于柱上的陽性細(xì)胞，即分選出CD133+干細(xì)胞樣細(xì)胞。通過CD133/2-PE(MiltenyiBiotech)標(biāo)記后流式細(xì)胞儀檢測(cè)其純度。實(shí)施例2，膠質(zhì)瘤腫瘤相關(guān)抗原的制備#實(shí)施例1中用SCM培養(yǎng)的細(xì)胞和SFM培養(yǎng)以及經(jīng)CD133分選出的細(xì)胞分別制備成腫瘤相關(guān)抗原。分別通過以下兩種方法進(jìn)行制備(1)凍融法取lxl(^個(gè)培養(yǎng)的細(xì)胞重懸于30(HilPBS中，將其置于液氮中5分鐘，然后取出立刻置于水浴中以37。C溫浴5分鐘，然后如此反復(fù)凍結(jié)和熔融，共進(jìn)行三次，5000rpm離心，用吸管反復(fù)吹打后得到的混合物即為腫瘤相關(guān)抗原溶液。(2)輻照法取lxl(^個(gè)培養(yǎng)的細(xì)胞用X射線以6Gray的強(qiáng)度照射3分鐘，取樣通過臺(tái)盼藍(lán)(trypanblue)染色確定大部分細(xì)胞死亡后，將輻照過的細(xì)胞收集后5(X]0rpm離心r棄去上清,沉淀重懸于300nlPBS中，用吸管反復(fù)吹打后得到的混合物即為腫瘤相關(guān)抗原溶液。以上兩種方法制備的溶液分別通過Bradfrod蛋白質(zhì)濃度測(cè)定法確定其蛋白濃度，然后用pH7.2的PBS將腫瘤相關(guān)抗原溶液調(diào)節(jié)為lpg/nl的蛋白濃度，并置于液氮保存。實(shí)施例3，樹突狀細(xì)胞的成熟根據(jù)Jonuleit等(GeneTher.200310(3):243-250)所述的方法，由外周血單核細(xì)胞(PBMC)制備樹突狀細(xì)胞。簡(jiǎn)而言之，通過Ficoll-Hypaque密度梯度離心分離PBMC,然后將PBMC以2.5~5xl07個(gè)細(xì)胞/孔的量接種于含每孔3mlRPMI1640培養(yǎng)基的六孔板(Corning/Costar,Bodenheim)的孔中，在37°C、5%C02的條件下孵育90分鐘。加入添加有10%胎牛血清、5mg/ml谷氨酰胺、800U/mlGM-CSF和1000U/mlIL-4(R&DSystems)的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)貼壁的細(xì)胞，于7天后收集未成熟的樹突狀細(xì)胞。用lxPBS洗未成熟的樹突狀細(xì)胞兩次，然后收集、計(jì)數(shù)。將未成熟的樹突狀細(xì)胞以2xl()S個(gè)細(xì)胞/mL的量重懸于RPMI1640培養(yǎng)基中，并于37'C孵育18小時(shí)，其中該RPMI1640培養(yǎng)基含5ng/mLGM-CSF和5ng/mlIL-4以及150pg4il實(shí)施例2制備的腫瘤相關(guān)抗原。由此，腫瘤相關(guān)抗原完成刺激樹突狀細(xì)胞成熟的過程。用JAM測(cè)試(CancerRes.2006,66(21):10247-10252)檢測(cè)由不同培養(yǎng)基并用不同抗原制備方法得到的腫瘤相關(guān)抗原刺激的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞毒性，其結(jié)果如表l所示?？瞻讓?duì)照是未使用腫瘤相關(guān)抗原刺激的樹突狀細(xì)胞。結(jié)果表明—，用腫瘤相關(guān)抗原刺激的樹突狀細(xì)胞更能誘導(dǎo)CTL細(xì)胞毒性。其中，使用無血清培養(yǎng)基中的干細(xì)胞樣細(xì)胞制備的腫瘤相關(guān)抗原比使用使血清培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞最終能產(chǎn)生更好的CTL細(xì)胞毒性；使用磁珠分選后的陽性細(xì)胞制備的腫瘤相關(guān)抗原較分選前細(xì)胞制備的抗原最終能產(chǎn)生更好的CTL細(xì)胞毒性；使用輻照法制備的腫瘤相關(guān)抗原比使用凍融法制備的能最終產(chǎn)生更好的CTL細(xì)胞毒性。表l不同腫瘤相關(guān)抗原刺激的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的CTL對(duì)相應(yīng)腫瘤靶細(xì)胞的殺傷率<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)施例4，膠質(zhì)瘤的臨床應(yīng)用試驗(yàn)應(yīng)用上述描述的方法，本發(fā)明人針對(duì)復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤病人首先采用了樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)免疫療法來治療膠質(zhì)瘤(已通過相關(guān)倫理審批)，方法簡(jiǎn)述如下經(jīng)病理證實(shí)的惡性膠質(zhì)瘤患者(ni或IV級(jí))符合入選標(biāo)準(zhǔn)的再次手術(shù)時(shí)取25g腫瘤標(biāo)本在體外培養(yǎng)擴(kuò)增；采用實(shí)施例1中無血清培養(yǎng)基和CD133流式分選；釆用實(shí)施例2中的輻照法制備腫瘤相關(guān)抗原。另外采集病人靜脈血20毫升/次，共3次(術(shù)后1個(gè)月開始每周1次)，按實(shí)施例3中描述分離單核細(xì)胞，誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞；采用實(shí)施例3種方法刺激樹突狀細(xì)胞成熟。成熟的樹突狀細(xì)胞用PBS洗滌后調(diào)整體積為0.5~0.8ml，三角肌皮下注射3次(每周1次)。目前已完成3例，正在隨訪觀察中，尚未發(fā)現(xiàn)明顯的并發(fā)癥，證實(shí)本方法安全可靠。權(quán)利要求1，體外刺激樹突狀細(xì)胞成熟的方法，其包括(1)培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，并收集培養(yǎng)出的細(xì)胞；(2)用X射線輻照步驟(1)所收集的細(xì)胞，制成膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣抗原；(3)未成熟的樹突狀細(xì)胞在樹突狀細(xì)胞成熟劑存在的條件下成熟，其中所述樹突狀細(xì)胞成熟劑包括步驟(2)制成的膠質(zhì)瘤相關(guān)抗原。2，權(quán)利要求l所述的方法，其中X射線輻照的強(qiáng)度為6Gray。3，權(quán)禾U要求1或2所述的方法，其中步驟(1)中培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基。4，權(quán)利要求3所述的方法，其中步驟(1)中收集培養(yǎng)出的細(xì)胞的步驟包括分選CD133+或A2B5+細(xì)胞的過程。5，權(quán)利要求4所述的方法，其中步驟(1)中收集的細(xì)胞為腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞。6，權(quán)利要求4所述的方法，其中步驟(1)中收集的細(xì)胞為CD133+或A2B5屮干細(xì)胞樣細(xì)胞。7，權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述樹突狀細(xì)胞成熟劑還包括GM-GSF和IL國(guó)4。8，權(quán)利要求1或2所述的方法，其中膠質(zhì)瘤細(xì)胞是膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87。9，權(quán)利要求l-8之任一所述的方法刺激成熟的樹突狀細(xì)胞。10，權(quán)利要求9所述的成熟的樹突狀細(xì)胞在制備治療膠質(zhì)瘤的藥物中的應(yīng)用。11，制備膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣抗原的方法，其包括(1)培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，并收集培養(yǎng)出的細(xì)胞；(2)用X射線輻照步驟(1)所收集的細(xì)胞，制成膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣抗原。12，權(quán)利要求ll所述的方法，其中X射線輻照的強(qiáng)度為6Gray。13,權(quán)利要求11或12所述的方法，其中膠質(zhì)瘤細(xì)胞是膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87。14，權(quán)利要求1143之任一所述的方法制備的膠質(zhì)瘤千細(xì)胞樣抗原。15，權(quán)利要求14所述的膠質(zhì)瘤相關(guān)抗原在體外刺激樹突狀細(xì)胞成熟的方法中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及用膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣抗原體外刺激樹突狀細(xì)胞成熟的方法，其中膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣抗原是用X射線輻照膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞而制備的。該方法制備的成熟的樹突狀細(xì)胞能夠顯著提高其介導(dǎo)的CTL殺傷效果，從而提高惡性膠質(zhì)瘤的治療效果。另外，本發(fā)明還涉及由此制備的成熟的樹突狀細(xì)胞在治療藥物方面的應(yīng)用、以及膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣抗原的制備方法和其應(yīng)用等。文檔編號(hào)C12N5/08GK101481677SQ200910045948公開日2009年7月15日申請(qǐng)日期2009年1月22日優(yōu)先權(quán)日2009年1月22日發(fā)明者周良輔,瑜姚,朱劍虹,穎毛,瑋花申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院