專利名稱：一種攜帶外源基因在包裝細(xì)胞中高效生產(chǎn)的重組病毒載體、其構(gòu)建方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及重組病毒載體。更具體地說，本發(fā)明涉及一類攜帶外源基因在
包裝細(xì)胞中高效生產(chǎn)的的重組病毒載體、其構(gòu)建方法及其用途。
背景技術(shù)：
病毒對特定細(xì)胞感染率高，可高效地將外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，并長時間 表達(dá)，常作為基因轉(zhuǎn)移的工具介導(dǎo)外源基因在靶細(xì)胞中的超量表達(dá)，通過功能獲得 (gain-of-fimction)的方式研究基因的功能。另一方面，病毒也是基因治療最常用的載體， 截止2008年9月，世界上已有1472個基因治療方案用于臨床試驗，其中共1006項臨床試驗 采用不同種類的病毒作為載體，占總數(shù)的68. 3% (參見數(shù)據(jù)庫http:〃www. wiley. co. uk/ ge歷ed/clinica1/)。 重組病毒的包裝與擴(kuò)增需要合適的包裝細(xì)胞系，如293細(xì)胞，即含有5型腺病毒E1 區(qū)的人胚腎細(xì)胞，常用于重組腺病毒、腺相關(guān)病毒的包裝與生產(chǎn)；293T及293FT細(xì)胞(293T 的快速生長變種)，由293細(xì)胞派生，同時表達(dá)SV40大T抗原，常用于重組慢病毒的包裝與 生產(chǎn)；GP293細(xì)胞，由293細(xì)胞派生，同時表達(dá)Gag-po1蛋白，常用于逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝與 生產(chǎn)。攜帶外源基因的重組病毒可在包裝細(xì)胞中組裝或復(fù)制增殖，促使重組病毒基因組中 包含的外源基因大量擴(kuò)增與表達(dá)。然而， 一方面過量表達(dá)的外源基因?qū)?xì)胞具有一定的毒 性，尤其是自殺基因，細(xì)胞凋亡基因，細(xì)胞周期相關(guān)基因等，導(dǎo)致病毒包裝細(xì)胞提早死亡，縮 短了重組病毒各功能基因在包裝細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄與翻譯的時機(jī)，并導(dǎo)致部分病毒顆粒來不及組 裝；另一方面，外源基因的大量轉(zhuǎn)錄與翻譯也會占用細(xì)胞過多的RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯相關(guān) 的酶類與資源，從而間接抑制了重組病毒各功能基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯。兩個方面的影響降低 了重組病毒在包裝細(xì)胞中的生產(chǎn)效率，無法獲得足夠的病毒滴度。 因此，為使攜帶外源基因的重組病毒獲得較高的病毒滴度，非常需要能在包裝細(xì) 胞中進(jìn)行高效生產(chǎn)重組病毒的方法。 微小RNA (microRNA)是生物體內(nèi)源的小片段RNA，通過與靶基因成熟mRNA的3'非 翻譯區(qū)中的靶位點核苷酸序列結(jié)合，抑制靶基因蛋白的翻譯。微小RNA具有高度的組織特 異性和時序性，在不同類型的細(xì)胞中表達(dá)水平差異大，因而可借助微小RNA的調(diào)控機(jī)制以 及表達(dá)組織特異性，利用病毒包裝細(xì)胞高水平表達(dá)而靶細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)的微小RNA 調(diào)控外源基因的表達(dá)，使外源基因在包裝細(xì)胞中不表達(dá)，提高病毒生產(chǎn)效率和滴度，而在靶 細(xì)胞中不降低外源基因的表達(dá)水平，保持原有的治療效果或通過功能獲得的方式研究外源 基因功能。
發(fā)明概述 本發(fā)明提供了一種重組病毒載體，其特征在于該病毒可操作地連接的外源基因的 3'非翻譯區(qū)中插入至少一個下述微小RNA(microRNA)的耙位點核苷酸序列，所述微小RNA 在病毒包裝細(xì)胞中高水平表達(dá)而靶細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)。
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在一個實施方案中，所述病毒選自腺病毒(Adenovirus)、腺相關(guān)病毒 (Adeno-associated virus)、反轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus)、慢病毒(Lentivirus)、痘苗病 毒(Vaccinia virus)、牛痘病毒(Poxvirus)、單純皰疹病毒(Herpes simplex virus)、 艾巴氏病毒(Epstein-Barr virus)、人乳突狀瘤病毒(Human Papillomavirus)、桿狀 病毒(Baculoviruses)、黃病毒(Flavivirus)、麻疹病毒(Measlesvirus)、新城疫病毒 (Newcastle disease virus) 、 Semliki森林病毒(Semliki forest virus)、仙臺病毒 (Sendai virus)、猿猴病毒40 (Simian virus 40)禾口 a-病毒(Alphaviruses)中的至少一 種。所述病毒優(yōu)選選自腺病毒、腺相關(guān)病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、痘苗病毒，更優(yōu)選所述病 毒選自腺病毒。 在一個實施方案中，所述病毒可操作地連接的外源基因選自細(xì)胞凋亡基因、前藥 轉(zhuǎn)換酶基因、細(xì)胞周期相關(guān)基因、細(xì)胞因子基因、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因、轉(zhuǎn)錄因子基因、癌基因、抑 癌基因、血管抑制基因、抗體基因(包括全長抗體、嵌合抗體、Fab片段、Fv片段)、疫苗基因 中的至少一種。優(yōu)選所述基因選自細(xì)胞凋亡基因、前藥轉(zhuǎn)換酶基因、抑癌基因、血管抑制基 因、抗體基因、疫苗基因，更優(yōu)選所述基因選自細(xì)胞凋亡基因與抗體基因。
在一個實施方案中，所述病毒靶細(xì)胞可以選自心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、成纖維細(xì) 胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞、腫瘤 細(xì)胞中的至少一種。所述靶細(xì)胞優(yōu)選選自肝細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞。 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述微小RNA耙位點序列由1個或多個以上相同的 微小RNA耙位點序列以串聯(lián)重復(fù)的方式構(gòu)成。其中，微小RNA耙位點序列的單元個數(shù)為100、 90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2或者1個。優(yōu)選1-3個，1-5個，1-7個， 1-9個，1-11個，1-15個，1-20個。 在一個實施方案中，所述微小RNA耙位點序列由1個或多個以上不同的微小RNA 靶位點序列以連續(xù)串聯(lián)或間隔串聯(lián)的方式構(gòu)成。其中，微小RNA靶位點序列的單元個數(shù)分 別為100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2或者1個。優(yōu)選1-3個，1-5個， 1-7個，1-9個，1-11個，1-15個，1-20個。在一個實施方案中，所述病毒包裝細(xì)胞選自293，293T，293FT，293E，293ET，293KB， 293Eco， GP293和FIP293中的至少一種。所述包裝細(xì)胞優(yōu)選選自293，293FT。
在一個實施方案中，所述微小RNA靶位點序列選自miR-15a， miR_16， miR_17， miR-18a，miR-19b和miR-196a中的至少一種。所述微小RNA耙位點序列優(yōu)選選自miR-15a， miR-18a， miR-16。 在本發(fā)明的一個實施方案中，所選用的病毒為人類腺病毒載體，其包括A、 B、 C、 D、 E及F6個亞屬。 在本發(fā)明的一個實施方案中，所選用的腺病毒載體來源于人類C亞屬5型的腺病毒。
在一個實施方案中，本發(fā)明還涉及重組病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于在所述 病毒載體可操作地連接的外源基因的3'非翻譯區(qū)中插入了至少一個下述微小RNA的靶位 點核苷酸序列，所述微小RNA在病毒包裝細(xì)胞中高水平表達(dá)而靶細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)。
在一個實施方案中，所述的重組病毒用于使重組病毒可操作地連接的外源基因不 在病毒包裝細(xì)胞中表達(dá)，而在靶細(xì)胞中正常表達(dá)。在一個實施方案中，所述重組病毒用于抑] 附圖簡述

圖1 :pPE3-Fll的載體圖譜。主要由pBHGlox(delta)El，3Cre改造而成，El區(qū) 缺失，可與包含腺病毒左臂的質(zhì)粒胞內(nèi)同源重組，獲得有感染能力的腺病毒；包含來源于 pBHGE3的E3區(qū)，其5型纖毛蛋白基因被5/11 fiber替換。 圖2 :表示病毒載體Adll-RTX與Adll-RTX-15T在HEK293細(xì)胞中的復(fù)制能力比較結(jié)果。 圖3 :表示Rituxan在HEK293與L02細(xì)胞中的表達(dá)量分析結(jié)果。
圖4 :表示對照組與治療組小鼠不同時間段移植瘤體積統(tǒng)計分析結(jié)果。
發(fā)明詳述 如上文所述，本發(fā)明涉及一種重組病毒載體，其特征在于該病毒可操作地連接的 外源基因的3'非翻譯區(qū)中至少包含一個病毒包裝細(xì)胞中高水平表達(dá)而靶細(xì)胞中不表達(dá)或 低表達(dá)的微小RNA(microRNA)的耙位點核苷酸序列。 微小RNA(microRNA， miRNA)是生物體內(nèi)源，長度約為19_25個核苷酸的非編碼小 RNA，它通過與耙基因mRNA上的耙序列互補(bǔ)配對結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因的表達(dá)進(jìn)行 負(fù)調(diào)控，導(dǎo)致mRNA的降解或翻譯抑制(Lai，2002)。據(jù)估計，在人類基因組中存在約1000個 miRNAs，大多數(shù)微小RNA位于基因間隔區(qū)或蛋白編碼基因的內(nèi)含子區(qū)，少數(shù)位于外顯子區(qū) 或者mRNA非翻譯區(qū)。大部分微小RNA單獨存在，部分微小RNA聚集在一起，成為一個微小 RNA基因簇。生物信息學(xué)數(shù)據(jù)顯示，人類約1/3的蛋白編碼基因受微小RNA的調(diào)控，每個微 小RNA可以調(diào)節(jié)100-200個耙基因，而多個微小RNA可調(diào)節(jié)同一個基因，組成了一個復(fù)雜的 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(Berezikov et al. ，2006)。 微小RNA在物種進(jìn)化中相當(dāng)保守，只在特定的組織和發(fā)育階段表達(dá)，具有高度的 組織特異性和時序性。如miR-1和miR-133在心臟和骨骼肌組織中特異表達(dá)，miR-1可調(diào) 控心肌細(xì)胞在分化與增殖之間的平衡，而miR-133可調(diào)控肌肉細(xì)胞的分化，其表達(dá)下降可 以促進(jìn)斑馬魚魚鰭的再生；miR-122在人和小鼠的肝臟中高量特異表達(dá)，其含量可占肝臟 所有miRNA的70% ;miR_126在心、肺內(nèi)皮細(xì)胞中特異表達(dá)，可抑制淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的 相互作用，防止血管炎癥的發(fā)生；miR-142、 miR-181、 miR-223在造血組織中特異表達(dá)，其中 miR-181在小鼠胸腺細(xì)胞發(fā)育的CD4+CD8+雙陽性期特異性表達(dá)，調(diào)控B細(xì)胞的成熟，miR-223 在骨髓中表達(dá)高，可調(diào)控粒細(xì)胞的成熟；miR-143在脂肪組織中特異表達(dá)，能調(diào)控脂肪細(xì)胞 的分化，敲除miR-143將導(dǎo)致甘油三酯的累積;miR-371-373簇(包括miR-271， miR_272， miR-273)在人的胚胎中特異表達(dá)，而mir-290-295簇(包括miR-290， miR_291， miR_292， miR-293，miR-294，miR-295)則在小鼠的胚胎中特異表達(dá)，它們在胚胎干細(xì)胞的分化過程中 起重要作用；miR-375在鼠胰島細(xì)胞中特異表達(dá)，調(diào)控胰島細(xì)胞發(fā)育和胰島素分泌，另外， miR-375還在斑馬魚腦下垂體高效表達(dá)，調(diào)節(jié)其他激素和神經(jīng)內(nèi)分泌產(chǎn)物的分泌(參見綜 述Landgraf et al. ，2007)。 在293系列細(xì)胞中表達(dá)水平較高的微小RNA有miR-15a， miR_16， miR_17， miR-18a， miR-19b， miR-196a(參見微小RNA數(shù)據(jù)庫http://www. microrna. org/microrna/ get ExprForTissues. do tissue = hsa_Kidney_embryo_HEK293+)。 其中miR-15a與 miR-16緊密相鄰，位于人基因組13ql4區(qū)，屬于同一微小RNA簇；miR_17、 miR-18a與
5miR-19b緊密相鄰，位于人基因組13q31區(qū)，屬于miR-17-92簇；miR-196a在人基因組中有 兩個拷貝，其中miR-196a-l位于第17染色體，而miR-196a_2位于第12染色體。除在293 系列細(xì)胞中較高水平表達(dá)外，miR-15a與miR-16在多種T細(xì)胞、B細(xì)胞中也有較高的表達(dá) 量，而在65X的B細(xì)胞慢性淋巴型白血病(CLL)病人，50%的套細(xì)胞淋巴瘤病人，16-40%的 骨髓瘤病人，60%的前列腺癌病人中均有13ql4區(qū)的缺失，導(dǎo)致miR-15a與miR-16基因的 喪失(Calin et al. ，2005) ;miR-17、miR-18a與miR-19b所在的基因組13q31區(qū)在散布的 B細(xì)胞淋巴瘤、濾泡型淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤等腫瘤中常發(fā)生位點的擴(kuò)增，導(dǎo)致其表達(dá)異常 上調(diào)(He et al. ，2005) ;miR-196a在乳腺癌細(xì)胞系MCF7中表達(dá)水平較高。以上微小RNA 在心、肺、肝、脾、卵巢、子宮、前列腺、甲狀腺等器官組織中表達(dá)水平水平較低或不表達(dá)。
在本發(fā)明應(yīng)用包裝細(xì)胞中高水平表達(dá)而靶細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)的微小RNA的 耙位點核苷酸序列插入重組病毒基因組中包含的外源基因的3'非翻譯區(qū)，從而使外源基因 不能在包裝細(xì)胞內(nèi)合成蛋白，并不影響重組病毒在包裝細(xì)胞中的正常包裝與增殖，從而提 高重組病毒的生產(chǎn)效率，提高病毒滴度。而在靶細(xì)胞中不降低外源基因的表達(dá)水平，保持原 有的治療效果或通過功能獲得研究外源基因功能。 "重組病毒，，包括腺病毒(Adenovirus)、腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus)、 反轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus)、慢病毒(Lentivirus)、痘苗病毒(Vacciniavirus)、牛痘病毒 (Poxvirus)、單純皰疹病毒(Herpes simplexvirus)、艾巴氏病毒(Epstein-Barrvirus)、 人乳突狀瘤病毒(Human Papillomavirus)、桿狀病毒(Baculoviruses)、黃病毒 (Flavivirus)、麻疹病毒(Measles virus)、新城疫病毒(Neweastle disease virus)、 Semliki森林病毒(Semlikiforest virus)、仙臺病毒(Sendai virus)、猿猴病毒 40(Simianvirus 40)禾P a -病毒(Alphaviruses)。"包裝細(xì)胞"是指用于病毒重組、擴(kuò)增的 細(xì)胞系，它可以是從天然細(xì)胞中培育出的可穩(wěn)定傳代的細(xì)胞系，也可以是經(jīng)改造的其基因 組中包含病毒包裝必需基因的細(xì)胞系。如293細(xì)胞可用于腺病毒的重組與擴(kuò)增。
"靶細(xì)胞"是指重組病毒的目標(biāo)感染細(xì)胞，既可以是功能缺損或紊亂，需重組病毒 攜帶外源基因進(jìn)行校正的細(xì)胞，也可以是功能正常，適宜于重組病毒感染后表達(dá)外源基因， 研究外源基因功能的細(xì)胞。"包裝細(xì)胞中高水平表達(dá)而耙細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)的微小RNA"是指在包裝細(xì) 胞與靶細(xì)胞之間表達(dá)水平差異大的微小RNA，即在包裝細(xì)胞表達(dá)水平高，而在靶細(xì)胞表達(dá)水 平低或無。如miR-15a，它在293細(xì)胞中表達(dá)水平高，而在正常人肝細(xì)胞系L02表達(dá)水平極 低。通常，所述的"低表達(dá)"是指與包裝細(xì)胞相比，耙細(xì)胞中微小RNA表達(dá)量不足包裝細(xì)胞 的1/3。"微小RNA的靶位點核苷酸序列"是指微小RNA可與之結(jié)合從而發(fā)揮調(diào)控作用的
DNA序列。它既可以是與成熟微小RNA完全反向互補(bǔ)配對的DNA序列，也可以是已知的微小
RNA耙基因中與微小RNA結(jié)合，與微小RNA不完全反向互補(bǔ)配對的DNA序列。"外源基因"是指重組病毒基因組中包含的但不屬于野生型病毒基因組的蛋白編
碼基因，它可以是人類或其它物種的天然蛋白編碼基因，也可以是人工合成的蛋白編碼基因。"外源基因的3'非翻譯區(qū)"是指外源基因成熟mRNA中編碼序列下游不翻譯的區(qū) 域，它位于外源基因終止密碼子和polyA尾之間。
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"相同微小RNA耙位點序列的串聯(lián)重復(fù)"是指2個以上相同微小RNA耙位點序列不 間隔的首尾相連，或者2個以上相同微小RNA靶位點序列首尾相連但中間相隔若干個核苷 酸序列。"不同微小RNA靶位點序列連續(xù)串聯(lián)"是指一種微小RNA靶位點序列串聯(lián)重復(fù)后連 接另一種微小RNA靶位點序列的串聯(lián)重復(fù)。不同微小RNA靶位點序列間隔串聯(lián)是指一種微 小RNA靶位點序列后連接另一種微小RNA靶位點序列，并以此為單元重復(fù)2次以上。
在本發(fā)明的一個實施方案中，包裝細(xì)胞選自人腎胚HEK293細(xì)胞系，及從HEK293中 衍生培育出的其它細(xì)胞系，如293T， 293FT，293E，293ET， 293KB, 293Eco， GP293, FIP293等。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述微小RNA耙位點核苷酸序列可以選自293系列 細(xì)胞中高水平表達(dá)的miR-15a， miR_16， miR_17， miR-18a， miR-19b， miR-196a中的至少一 種。 在本發(fā)明中中還例示性地公開了采用本發(fā)明的設(shè)計策略的重組腺病毒載體、其構(gòu) 建方法以及所述重組腺病毒的實際用途。例如通過在攜帶全長美羅華Rituxan全長抗體 基因的的3'非翻譯區(qū)插入5個拷貝miR-15a靶位點序列的DNA片段，使該含有外源基因 美羅華的重組腺病毒在包裝細(xì)胞293中獲得高滴度，而且通過該方法擴(kuò)增的病毒感染靶細(xì) 胞_肝細(xì)胞后，可以有效地在肝細(xì)胞中表達(dá)有活性的Rituxan抗體，并使之分泌到細(xì)胞外， 最終作用于CD20陽性的腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。 在本發(fā)明中還例示性地公開了采用本發(fā)明的設(shè)計策略的重組慢病毒載體、其構(gòu)建 方法以及所述重組慢病毒的實際用途。例如通過在重組慢病毒可操作地連接的人P53基因 的3'非翻譯區(qū)插入4個拷貝miR-15a靶位點序列的DNA片段，使之在包裝細(xì)胞293FT細(xì)胞 中獲得了高滴度的重組慢病毒。 與現(xiàn)有重組病毒載體相比，本發(fā)明具有如下有益效果 本發(fā)明在重組病毒載體可操作地連接的外源基因的3'非翻譯區(qū)中插入至少一 個包裝細(xì)胞中高水平表達(dá)而靶細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)的微小RNA的靶位點核苷酸序列， 使外源基因不能在包裝系列細(xì)胞中隨著病毒的復(fù)制而大量表達(dá)，避免了外源基因過量表 達(dá)造成的細(xì)胞毒性及對細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、翻譯相關(guān)酶類和資源的競爭，提高了重組病毒的生產(chǎn)效 率和病毒滴度。而在靶細(xì)胞中不降低外源基因的表達(dá)水平，保持原有的治療效果或通過 gain-of-function研究外源基因功能。 本發(fā)明中的實施例僅用于例示性說明本發(fā)明的具體實施方案，其不限制本申請的 保護(hù)范圍，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行的等價的改良都包含在本申請的保 護(hù)范圍之內(nèi)。
具體實施例方式
— .實施例1 :攜帶美羅華(Rituxan)基因并可在293細(xì)胞中高效生產(chǎn)的重組腺 病毒載體的構(gòu)建 1.攜帶美羅華(Rituxan)基因的復(fù)制缺陷型腺病毒載體的構(gòu)建
pDC315載體購于力B拿大Microbix Biosystem Inc. (Toronto)，含有5型腺病毒左 臂El區(qū)1417至2344bp序列片段，及反向末端重復(fù)序列(ITR)，可以與包含腺病毒右臂的 骨架質(zhì)粒發(fā)生同源重組，獲得復(fù)制缺陷型腺病毒。pDC315載體經(jīng)酶切改造，替換mCMV啟動子，連接EFla (eukaryotic translation elongation factor 1 alpha)啟動子及內(nèi)含子、 新的多克隆位點，保留原有的SV40 PolyA信號序列，命名該載體為pDC338。應(yīng)用多聚酶鏈 反應(yīng)(PCR)技術(shù)分別擴(kuò)增美羅華(Rituxan)基因輕鏈、重鏈基因序列，并用核糖體進(jìn)入位點 序列(IRES)連接輕重鏈基因，命名為pDC338-RTX。
NO :1) 引物2 :TGCGTCGACTTATCAACACTCTCCCCTGTTGAA(SEQ ID NO :2) NO :3) 引物4 :CCCGCTAGCTTACTATTTACCCGGAGACAGGGA(SEQ ID NO :4)
應(yīng)用引物3和引物4擴(kuò)增，獲得720bp的輕鏈基因，首尾分別加入EcoRI和Sail 酶切位點，應(yīng)用引物5和引物6擴(kuò)增，獲得1431bp的重鏈基因，首尾分別加入BamHI和Nhel 酶切位點。EFla啟動子至SV40 PolyA信號之間序列的測序結(jié)果(5' -3')如下<image>image see original document page 9</image>
合成包含5個拷貝miR-15a靶位點序列的DNA片段(5XmiR-15T)，并在5'-末端 與3'-末端分別加入Nhel和Spel的酶切位點，該DNA片段由上海生工生物工程技術(shù)有限公 司進(jìn)行全長基因合成。經(jīng)測序正確，命名為pUC57-miR-15T，其核苷酸序列如下(5' -3'):CCATTATGTGCTGCTAACTAGT(SEQ ID NO :6) 利用Nhel和Spel雙酶切pUC57-miR-15T質(zhì)粒，回收146bp的5XmiR-15T片段， 將其插入pDC338-RTX載體的美羅華基因的3'非翻譯區(qū)(重鏈基因后，SV40 Poly A加尾 信號前)，命名為pDC338-RTX-15T。 3.攜帶美羅華(Rituxan)基因并受miR-15a調(diào)控的復(fù)制缺陷型腺病毒的重組
HEK293細(xì)胞株購于加拿大Microbix Biosystem Inc. (Toronto)，是由剪切的5型 腺病毒DNA轉(zhuǎn)化人胚胎腎細(xì)胞而成，它含有及表達(dá)5型腺病毒El區(qū)，腺病毒DNA對其具有 高轉(zhuǎn)染率。將含有5型腺病毒左臂的質(zhì)粒聯(lián)合含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì) 胞，通過同源重組可產(chǎn)生具有感染力的腺病毒。我們將pDC338-RTX和pDC338_RTX_15T分 別與含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒pPE3-F11通過Lipofectamine共轉(zhuǎn)染至293細(xì)株，其具 體方法參見GIBC0 BRL公司的操作說明。pPE3-F11由pBHGlox (delta) El， 3Cre改造而成， El區(qū)缺失，可與包含腺病毒左臂的穿梭質(zhì)粒胞內(nèi)同源重組，獲得有感染能力的腺病毒，含有 來源于pBHGE3的E3區(qū)，其5型纖毛蛋白基因被5/11fiber替換，具體載體圖譜見附圖1。 pBHGlox (delta) El ， 3Cre與pBHGE3購于加拿大Microbix Biosystems Inc. (Ontario)。共 轉(zhuǎn)染后9-14天出現(xiàn)腺病毒空斑，經(jīng)過三次腺病毒空斑純化，即得攜帶Rituxan全長抗體基 因的重組腺病毒和攜帶Rituxan全長抗體基因并受miR-15a調(diào)控的重組腺病毒，分別命名 為Adll-RTX和Adll-RTX-15T(CCTCC-V200813，2009年1月9日，中國典型培養(yǎng)物保藏中 心)。 腺病毒在HEK293細(xì)胞中大量繁殖，應(yīng)用氯化銫梯度離心的方法大量純化腺病毒。
4.攜帶Rituxan基因的重組腺病毒和攜帶Rituxan基因并受miR-15a調(diào)控的重組 腺病毒在HEK293細(xì)胞中的復(fù)制能力比較 將HEK293細(xì)胞株按5X 105細(xì)胞/孔鋪在6_孔板中，在37。C孵箱5% C02培養(yǎng)，第 二天換無血清培養(yǎng)基lml，然后，分別加入重組腺病毒Adll-RTX、 Adll-RTX-15T，其腺病毒 量為MOI = 5，培養(yǎng)90分鐘后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗兩次，將腺病毒洗去，并加入5%胎 牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)，分別在0小時及48小時收集，凍融三次，用TCID50法來檢測腺病毒 滴度(方法參見美國Qbiogene公司的AdEasyTM操作手冊)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在HEK293中的腺病 毒復(fù)制能力Adll-RTX-15T是Adll-RTX的100倍(見圖2)。表明miR-15aT靶位點核苷酸 序列的插入可顯著提高重組腺病毒的生產(chǎn)效率。 5.攜帶Rituxan基因的重組腺病毒和攜帶Rituxan基因并受miR-15a調(diào)控的重組 腺病毒在HEK293細(xì)胞中表達(dá)Rituxan的能力比較 將HEK293細(xì)胞按1 X 105細(xì)胞/孔鋪在24-孔板中，在37 。C孵箱5 % C02培養(yǎng)。 第二天分別加入重組腺病毒Adll-RTX、 Adll-RTX-15T，其腺病毒量為M01 = 5，兩小時后 洗去病毒。分別在3天與7天后收集細(xì)胞，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbentassay， ELISA)檢測上清中Rituxan抗體的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在第3
天，Adll-RTX與Adll-RTX-15T感染HEK293細(xì)胞后抗體的濃度分別為2. 19±0. g/ ml，O. 31±0. liig/ml。在第7天，Adll-RTX與Adll-RTX_15T感染后抗體的濃度分別為 3. 43±0. 3ii g/ml，0. 39±0. 2 ii g/ml?？梢娫诟鱾€時間段，Adll-RTX與Adll-RTX_15T感染 HEK293細(xì)胞后Rituxan蛋白的表達(dá)水平Adl l-RTX-15T均遠(yuǎn)低于Adl l-RTX，分別降低了 7. 0 倍和8. 8倍(見圖3)。表明miR-15a靶位點核苷酸序列的插入可使外源基因在病毒包裝細(xì) 胞293中的表達(dá)變化顯著下降。 6.攜帶Rituxan基因的重組腺病毒和攜帶Rituxan基因并受miR-15a調(diào)控的重組 腺病毒在正常肝細(xì)胞中表達(dá)抗體效率比較 人正常肝細(xì)胞株L02 miR-15a表達(dá)陰性，將其按1乂105細(xì)胞/孔鋪在24-孔板 中，在37"孵箱5% C02培養(yǎng)。第二天分別加入重組腺病毒Adll-RTX、 Adll-RTX-15T，其腺 病毒量為MOI = 5，兩小時后洗去病毒。分別在第3天和第7天收集細(xì)胞，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸 附劑測定(enzymelinked immunosorbent assay, ELISA)檢測抗體的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 在第3天，Adll-RTX與Adll-RTX-15T感染L02細(xì)胞后抗體的濃度分別為1. 55±0. 1 y g/ ml，1.67士0. 2iig/ml。在第7天，Adll-RTX與Adll-RTX-15T感染后抗體的濃度分別為 3. 21±0. 4ii g/ml，3. 35±0. 2 ii g/ml?？梢娫诟鱾€時間段，Adll-RTX與Adll-RTX-15T感染 肝細(xì)胞L02后Rituxan蛋白的表達(dá)水平相似(見圖3)。表明miR-15a靶位點核苷酸序列的 插入未引起外源基因在靶細(xì)胞中的表達(dá)變化。 7.攜帶Rituxan基因并受miR-15a調(diào)控的重組腺病毒在裸鼠體內(nèi)治療移植腫瘤
將4-5周齡的SCID小鼠皮下接種CD20陽性的Raji細(xì)胞株1 X 107，兩周后， 一次 給予荷瘤小鼠尾靜脈注射攜帶Rituxan基因的重組腺病毒Adll-RTX，以及攜帶Rituxan基 因并受miR-15a調(diào)控的重組腺病毒Adll-RTX-15T，劑量各為5 X 108pfu，統(tǒng)計腫瘤體積的隨 時間的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其未治療組3周后腫瘤體積增加3倍以上，而治療組可顯著縮 小腫瘤的大小，且重組腺病毒Adll-RTX與Adll-RTX-15T抑制腫瘤生長的作用無顯著差異 (見圖4)。表明在動物體內(nèi)miR-15a靶位點核苷酸序列的插入未降低治療效果。
二 .實施例2 :攜帶人P53基因并可在293FT細(xì)胞中高效生產(chǎn)的重組慢病毒的構(gòu) 建 1.包含人P53基因的慢病毒包裝用表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 pKCDNA-CMV—EFla-GFP質(zhì)粒購于康成生物公司，它含有EFla啟動子控制下的 GFP基因的表達(dá)盒，外源基因可以在CMV啟動子的控制下表達(dá)。提取人總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄 酶合成單鏈cDNA，并應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)從單鏈cDNA文庫中擴(kuò)增出人P53基因的 開放閱讀框。命名為pKCDNA-P53。 引物5 :CCGTCTAGAACCATGGAGGAGCCGCAGTCAGA(SEQ ID NO : 7)
引物6 :TGCGAATTCTCAGTCTGAGTCAGGCCC(SEQ ID NO :8) 引物5與引物6擴(kuò)增獲得1197bp的P53基因的編碼區(qū)序列，首尾分別加入Xbal 和NheI酶切位點。其測序結(jié)果(5' -3')見下::0144]:0145]:0146]:0147]:0148]:0149]
:0150]:0151]
:0152]:0153]:0154]:0155]:0156]:0157]:0158]ACTCAGACTGAGCTAGC(SEQ ID NO :9) 2.包含人P53基因并受miR-15a調(diào)控的慢病毒包裝用表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
合成包含4個拷貝miR-15a靶位點序列的DNA片段(4XmiR-15T)，并在5，-末端與3'-末端分別加入Nhel和EcoRI的酶切位點，該DNA片段由上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行全長基因合成，并經(jīng)測序驗證正確。將4XmiR-15T片段插入pKCDNA-P53載體的人P53基因的3'非翻譯區(qū)(終止密碼子后，SV40 Poly A加尾信號前)，命名為pKCDNA-P53-15T。 4XmiR-15T片段的核苷酸序列如下(5， -3， ) :GCTAGCCACAAACCATTATGT
TGCTGCTAGAATTC(SEQID NO :10) 3.包含人P53基因并受miR-15a調(diào)控的慢病毒的包裝重組 將293FT細(xì)胞按7. 5X1()5鋪在10cm dish上，5 % C02培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。第二天將10 % DMEM培養(yǎng)基換成2 %的DMEM培養(yǎng)基，4小時后將20 y g表達(dá)質(zhì)粒(pKCDNA-P53與pKCDNA-P53-15T) ， 10 y g包裝質(zhì)粒pCMVdelta8. 91與5 y g包裝質(zhì)粒pMD. G混合，加無菌水至250 ii 1，震蕩混勻。向上述混合液中依次加入250 iil的0. 5MCaCl2，而后向上述混合液中逐滴加入500 ii 1的2XHBS，邊加邊震蕩。靜置30分鐘，將上述混合液均勻加入細(xì)胞培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染后12小時，倒掉2XDMEM培養(yǎng)基，PBS清洗兩遍，換回10% DMEM培養(yǎng)基，分別在36小時，60小時后收取細(xì)胞培養(yǎng)基。將收集含有病毒顆粒的細(xì)胞培養(yǎng)基以4000g離心10min，收集上清液，并用0. 45 ii m濾器過濾，濾過的液體置于40mL超速離心管中，4°C ， 25000r/min離心20分鐘，使用500ul冰PBS液重懸病毒沉淀。包裝獲得的攜帶人P53基因的慢病毒，以及攜帶人P53基因并受miR-15a調(diào)控的慢病毒分別命名為Le_P53和Le-P53-15T。
4.包含人P53基因并受miR-15a調(diào)控的慢病毒的滴度測定 在六孔板中按2x107孔鋪Hela細(xì)胞，使用10% DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于5% C02培養(yǎng)箱過夜。將待測病毒(Le-P53和Le-P53-15T)梯度稀釋為10—2_10—6倍，將每個濃度的病
12毒液稀釋于2XDMEM培養(yǎng)基，終體積為lml。稀釋完成后，將六孔板中原先的培養(yǎng)基倒掉，換成加入病毒稀釋液的培養(yǎng)基，置于5% (A培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。第二天將含有病毒的2%DMEM培養(yǎng)基換成10% DMEM培養(yǎng)基，感染后第四到五天，用PBS清洗細(xì)胞，消化后重懸，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測熒光表達(dá)情況，計算公式病毒滴度(TU/mL)=細(xì)胞數(shù)量1熒光陽性細(xì)胞的百分比/病毒液體積(ml)。流式細(xì)胞儀測定表明Le-P53-15T的病毒滴度為8. 75xl09TU/mL，而Le-P53的病毒滴度為1. 37xl08TU/mL，Le-P53-15T的病毒滴度是Le_P53的64倍。表明miR-15a靶位點核苷酸序列的插入可顯著提供重組慢病毒在包裝細(xì)胞293FT的病毒滴度。
5.包含人P53基因并受miR-15a調(diào)控的慢病毒在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)P53的水平測定
肝癌細(xì)胞株H印3B，肺癌細(xì)胞株A549，乳腺癌細(xì)胞株MCF7購于ATCC，miR-15a表達(dá)均為陰性。將上述腫瘤細(xì)胞按5X 104細(xì)胞/孔鋪在24-孔板中，在37t:孵箱5% C02培養(yǎng)過夜。第二天分別加入重組慢病毒Le-P53、Le-P53-15T，M01值為10。分別在第1、2、3天，提取總RNA，應(yīng)用引物7與引物8，通過實時定量RT-PCR的方法檢測P53的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在各個時間段，Le-P53與Le-P53-15T表達(dá)P53的水平無顯著差異。表明miR-15a靶位點核苷酸序列的插入未引起靶細(xì)胞中外源P53的表達(dá)量變化。
引物7 :GCGCACAGAGGAAGAGAATC(SEQ ID NO : 11)
引物8 :CAAGGCCTCATTCAGCTCTC(SEQ ID NO :12) 通過上述試驗證明，本發(fā)明的重組病毒在包裝細(xì)胞中具有更高的增殖效率或生產(chǎn)
效率，而在靶細(xì)胞中不影響外源基因的表達(dá)水平。 參考文獻(xiàn): 1. Lai EC. MicroRNAs are complementary to 3' UTR sequencemotifs thatmediate negative post-transcriptional regulation. Nat Genet. 2002 ;30 (4) :363-4
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2401
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肌gttC3肌g gC肌ggCC3C 3ttg3CtgC3 g3C3肌tCCtCC3gC3C3gC Ct3C3tgC3g
ctcagcagcc tgacatctga ggactctgcg gtctattact gtgcaagatc gacttactac
ggcggtgact ggtacttcaa tgtctggggc gcagggacca cggtcaccgt ctctgcagcc
tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac
3tctgC肌Cg tg肌tC3C肌 gCCC3gC肌C 3CC肌ggtgg 3C肌g肌3gt tgagccc肌3
tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg
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aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatag taagctagca ctagtctcga cttcgagcaa3541 cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa 3601 taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta 3661 tcatgtctgg atcgtctagc atcgaagatc c 3691 〈210〉6 〈211〉140 〈212>DNA 〈213>pUC57-miR-15T 〈400>6 gctagccaca aaccattatg tgctgctaga tccacaaacc attatgtgct gctaacgatc 60 acaaaccatt atgtgctgct actccacaaa ccattatgtg ctgctacgat cgcacaaacc 120 attatgtgct gctaactagt 140 〈210〉7 <211>32 〈212>DNA 〈213〉引物5 〈400〉7 ccgtctagaa ccatggagga gccgcagtca ga 32 <210>8 〈211〉27 〈212〉DNA 〈213〉引物6 〈400>8 tgcgaattct cagtctgagt caggccc 27 〈210〉9 〈211>1197 〈212>DNA 〈213>P53 〈400〉9 tctagaacca tggaggagcc gcagtcagat cctagcgtcg agccccctct gagtcaggaa 60
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tcccgccata aaaaactcat gttcaagaca gaagggcctg actcagactg agctagc
〈210〉10
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〈211〉112〈212>DNA〈213〉4XmiR-15T〈400〉10gctagccaca aaccattatg
60acaaaccatt atgtgctg
112〈210〉11〈211〉20〈212>DNA〈213〉引物7〈400〉11g C g C 3 C 3
20〈210〉12〈211>20〈212>DNA〈213〉引物8〈400>12caaggcctca ttcagc tctc
gaagagaatc
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權(quán)利要求
一種重組病毒載體，該載體可操作地連接有外源基因和微小RNA的靶位點核苷酸序列，其特征在于在該病毒載體可操作地連接的外源基因的3’非翻譯區(qū)中插入有至少一個下述微小RNA的靶位點核苷酸序列，所述微小RNA在病毒包裝細(xì)胞中高水平表達(dá)而靶細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述重組病毒載體，其特征在于所述病毒選自腺病毒 (Adenovirus)、腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus)、反轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus)、 慢病毒(Lentivirus)、痘苗病毒(Vacciniavirus)、牛痘病毒(Poxvirus)、單純皰疹 病毒(Herpes simplexvirus)、艾巴氏病毒(Epstein-Barr virus)、人乳突狀瘤病毒 (HumanPapillomavirus)、桿狀病毒(Baculoviruses)、黃病毒(Flavivirus)、麻疹病毒 (Measles virus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus) 、 Semliki森林病毒(Semliki forest virus)、仙臺病毒(Sendai virus)、猿猴病毒40 (Simian virus 40)禾口a-病毒 (Alphaviruses)中的至少一禾中。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述重組病毒載體，其特征在于所述病毒可操作地連接的外源基因 是編碼選自細(xì)胞凋亡基因、前藥轉(zhuǎn)換酶基因、細(xì)胞周期相關(guān)基因、細(xì)胞因子基因、信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 基因、轉(zhuǎn)錄因子基因、癌基因、抑癌基因、血管抑制基因、抗體基因、疫苗基因中的至少一種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述重組病毒載體，其特征在于所述病毒載體包裝細(xì)胞選自293， 293T，293FT，293E，293ET，293KB，293Eco， GP293和FIP293中的至少一種。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組病毒載體，其特征在于所述微小RNA靶位點序列選自 miR-15a， miR_16， miR_17， miR-18a， miR-19b和miR-196a中的至少一種。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組病毒載體，其特征在于所述微小RNA靶位點序列由1個 或多個相同的微小RNA靶位點序列以串聯(lián)重復(fù)的方式構(gòu)成。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組病毒載體，其特征在于所述微小RNA靶位點序列由1個 或多個不同的微小RNA靶位點序列以連續(xù)串聯(lián)或間隔串聯(lián)的方式構(gòu)成。
8. 權(quán)利要求1所述重組病毒載體的用途，其用于使重組病毒可操作地連接的外源基因 不在病毒包裝細(xì)胞中表達(dá)，而在靶細(xì)胞中正常表達(dá)。
9. 權(quán)利要求8的重組病毒載體用途，其特征在于所述病毒載體的靶細(xì)胞選自心肌細(xì) 胞、骨骼肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、胚胎 干細(xì)胞、成體干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明提供一種攜帶外源基因在包裝細(xì)胞中高效生產(chǎn)的重組病毒載體、其構(gòu)建方法及其用途。其特征在于在該病毒可操作地連接的外源基因的3’非翻譯區(qū)中插入有至少一個下述微小RNA的靶位點核苷酸序列所述微小RNA在病毒包裝細(xì)胞中高水平表達(dá)而靶細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)。從而實現(xiàn)選擇性地抑制外源基因在病毒包裝細(xì)胞中的表達(dá)，避免外源基因?qū)Σ《景b與生產(chǎn)的負(fù)面影響，提高病毒的生產(chǎn)效率和滴度，同時在靶細(xì)胞中不降低外源基因的表達(dá)水平，不影響治療效果或研究外源基因的功能。
文檔編號C12R1/93GK101787373SQ20091004599
公開日2010年7月28日 申請日期2009年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月23日
發(fā)明者呂賽群, 吳孟超, 李琳芳, 金華君, 錢其軍 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院