專利名稱：一種gnas突變基因及其應(yīng)用的制作方法
一種GNAS突變基因及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、白血病學(xué)領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及骨纖 維結(jié)構(gòu)不良患者中GNAS基因一個(gè)新的突變位點(diǎn)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
纖維結(jié)構(gòu)不良(fibrous dysplasia, FD)是一種非遺傳性疾病，占所有骨腫瘤的 2.5%,良性骨腫瘤的5 % -7 %，最初由Lichtenstein在1938年報(bào)道。臨床分為單骨型和多 骨型，以單骨型多見(jiàn)，但多骨型病變范圍較廣，對(duì)患者影響較嚴(yán)重。多骨型FD同時(shí)伴有皮膚 色素斑、內(nèi)分泌亢進(jìn)(如腦垂體功能障礙引起的巨人癥和肢端肥大癥，甲狀腺功能亢進(jìn)，甲 狀旁腺增大，男子乳房發(fā)育，腎上腺皮質(zhì)功能亢進(jìn)等)和性早熟(女性兒童提前發(fā)生月經(jīng)伴 陰毛、腋毛和乳房提前發(fā)育)，稱為McCune-Albright綜合征(McCune-Albright syndrome, MAS)。FD 或 MAS 合并肌內(nèi)黏液瘤稱為 Mazabraud 綜合征(Mazabraud syndrome，MS)。FD臨床癥狀主要有骨痛、骨畸形、疲勞性骨折、病理性骨折。單骨型病人因癥狀輕 微，常因其他原因做影像學(xué)檢查時(shí)偶爾發(fā)現(xiàn)，但當(dāng)患骨因受力而發(fā)生疲勞性骨折可出現(xiàn)定 位性骨痛。以往病理學(xué)的經(jīng)典著作將FD列為非腫瘤性瘤樣病變，認(rèn)為它是骨組織的發(fā)育不 良。并假定由二個(gè)原因造成第一，原始骨向成熟板層骨發(fā)育重建過(guò)程中的成熟障礙；第 二，骨組織不能根據(jù)受力作用方向而重新整合。但近年來(lái)的研究表明無(wú)論多骨或單骨型FD 都存在GNAS1基因激活性突變，染色體克隆性異常、畸變，c-fos原癌基因的過(guò)度表達(dá)等。 2002版WHO軟組織和骨腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)，將其列為性質(zhì)未定的腫瘤性病變。其中GNAS1編碼的G蛋白(鳥苷酸結(jié)合蛋白)是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，由a、3和 Y亞基構(gòu)成，介導(dǎo)胞外信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)，在G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)傳導(dǎo)通路中具有關(guān)鍵作用， 調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化以及凋亡。G蛋白基因突變分為激活性突變和抑制性突變(主要是編碼 a亞基的基因GNAS1基因突變)。激活性突變可導(dǎo)致很多疾病，如功能性垂體腺瘤、功能性 甲狀腺腺瘤、嬰兒Cushing綜合征、腎上腺皮質(zhì)腺瘤、MAS、肢端肥大癥、FD、肌內(nèi)黏液瘤以及 MS ；Albright hereditary osteodystrophy (AH0)。有證據(jù)表明FD與GNAS1基因激活性突變有關(guān)。GNAS1基因位于20號(hào)染色體長(zhǎng) 臂13. 2-13. 3，突變是體細(xì)胞核基因組基因突變。3個(gè)相鄰堿基組成1個(gè)三聯(lián)體密碼子，負(fù) 責(zé)編碼1個(gè)氨基酸，因此堿基突變可引起氨基酸類型的改變。已知位于GNAS1基因第8外 顯子的第201位密碼子(CGT)負(fù)責(zé)編碼精氨酸(Arg)，因此該位點(diǎn)(R201)的堿基突變導(dǎo)致 Arg改變?yōu)槠渌被?。Candeliere等證實(shí)在FD中，由于R201突變導(dǎo)致Arg改變?yōu)榻M氨 酸(CGT-CAT，Arg-His，R201H)或半胱氨酸(CGT-TGT，Arg-Cys，R201C)。少數(shù)病例，精氨酸 也可改變?yōu)榻z氨酸，谷氨酸或亮氨酸。突變后的GNAS1基因視為gsp原癌基因。由突變基 因編碼的Gsct亞基為GTP酶的內(nèi)源性抑制劑，導(dǎo)致GTP不能轉(zhuǎn)換為GDP而被鎖定在活化狀 態(tài)，引起腺苷酸環(huán)化酶不斷被激活，催化產(chǎn)生大量環(huán)磷酸腺苷(cAMP)，使依cAMP的蛋白激 酶A(PKA)具有持續(xù)活性，引起下游底物蛋白的磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生一系列異常生理生化
3反應(yīng)，最終表現(xiàn)為細(xì)胞整體生物學(xué)效應(yīng)的改變。Marie等證實(shí)由于G蛋白突變而導(dǎo)致cAMP 不需誘導(dǎo)即可表達(dá)，使骨母細(xì)胞異常增殖及分化不良而導(dǎo)致FD。Idowu等在FD中檢測(cè)到GNAS1第9外顯子的第227位密碼子也可發(fā)生堿基突變， 引起谷氨酸改變?yōu)榱涟彼?Q227L)，而Q227L也會(huì)引起cAMP濃度持續(xù)增高。體外試驗(yàn)證實(shí) Q227L突變比R201突變更具活力。由于GNAS1基因突變所致疾病的臨床特征具有多樣性，推測(cè)突變發(fā)生于體細(xì)胞， 且突變細(xì)胞與正常細(xì)胞在體內(nèi)呈嵌合式分布。臨床特征與突變發(fā)生的時(shí)間及部位均有密切 關(guān)系。由Bianco等構(gòu)建的FD體外模型證實(shí)，單一突變細(xì)胞不能引發(fā)FD，而突變細(xì)胞與正常 細(xì)胞并存，才會(huì)發(fā)生FD。目前對(duì)FD的分子診斷依據(jù)是GNAS1基因的突變位點(diǎn)R201C，R201H和Q227L。但 是關(guān)于其它基因的突變位點(diǎn)，目前還未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種GNAS新的突變基因。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種檢測(cè)骨纖維結(jié)構(gòu)不良疾病的主效基因之一 GNAS 突變基因的試劑盒。本發(fā)明的另一的目的是，提供一種GNAS新的突變基因的用途。本發(fā)明的另一的目的是，提供一種試劑盒的用途為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種GNAS突變基因，其中，所述GNAS 突變基因的突變位點(diǎn)位于所述GNAS基因中從5’端起的第600個(gè)核苷酸，突變結(jié)果是由T 突變?yōu)镃。所述GNAS突變基因的突變位點(diǎn)位于所述GNAS基因中從5’端起的第603個(gè)核苷 酸，突變結(jié)果是由C突變?yōu)門。所述的GNAS突變基因，其編碼氨基酸突變位點(diǎn)位于第200個(gè)氨基酸，突變結(jié)果是 由C突變?yōu)镽。所述的GNAS突變基因，其編碼氨基酸突變位點(diǎn)位于第201個(gè)氨基酸，突變結(jié)果是 由R突變?yōu)镃。為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種檢測(cè)骨纖維結(jié)構(gòu)不良 疾病的主效基因之一 GNAS突變基因的試劑盒，其包括擴(kuò)增引物，用于PCR反應(yīng)的DNA 聚合酶及其緩沖液的一種或多種，所述擴(kuò)增引物選自GNAS-C200R-1、GNAS-C200R-2、 GNAS-R201C-3、GNAS-R201C-4，擴(kuò)增引物GNAS-C200R-1，上游引物5，-ATTATTACTGTTTCGGTTGG-3，，(見(jiàn)SEQ ID NO. 3)下游引物5，-CACCTGGAACTTGGTCTC-3，；(見(jiàn)SEQ ID NO. 4)擴(kuò)增弓丨物GNAS-C200R-2，上游引物5，-GTTTCAGGACCTGCTTCCCC-3，，(見(jiàn)SEQ ID NO. 5)下游引物5，-TCTTGCTTGTTGAGGAACAG-3，；(見(jiàn)SEQ ID NO. 6)擴(kuò)增引物GNAS-R201C-3，上游引物5，-CAGGACCTGCTTCGCTCCT-3，，(見(jiàn)SEQ ID NO. 7)
下游引物5，-TCTTGCTTGTTGAGGAACAG-3，；(見(jiàn)SEQ ID NO. 8)擴(kuò)增引物GNAS-R201C-4，上游引物5，-ATTATTACTGTTTCGGTTGG-3，，(見(jiàn)SEQ ID NO. 9)下游引物5，-CACCTGGAACTTGGTCTC-3，。(見(jiàn)SEQ ID NO. 10)為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是所述的GNAS突變基因在制備 檢測(cè)骨纖維結(jié)構(gòu)不良疾病藥物中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述第四個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是所述的試劑盒在制備檢測(cè)骨 纖維結(jié)構(gòu)不良疾病藥物中的應(yīng)用。需要說(shuō)明的是GNAS基因序列見(jiàn)SEQ ID NO. 1所示。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于一，為FD的產(chǎn)前篩查提供新的靶點(diǎn)產(chǎn)前篩查又稱出生前診斷或?qū)m內(nèi)診斷，是指在胎兒出生前應(yīng)用各種方法了解胎兒 的外表結(jié)構(gòu)、對(duì)胎兒的染色體進(jìn)行核型分析、檢測(cè)胎兒細(xì)胞的生化成分或?qū)ζ溥M(jìn)行基因分 析。從而對(duì)某些胎兒先天性畸形或遺傳性疾病及時(shí)作出診斷，防止具有嚴(yán)重遺傳病、智力障 礙以及先天畸形胎兒的出生。業(yè)已證明，F(xiàn)D是一種主要由GNAS1基因激活性突變所引發(fā)的 疾病，分為先天性和后天性兩種。其中前者是GNAS1基因的激活性突變發(fā)生于胎兒時(shí)期的 胚胎干細(xì)胞，此患兒出生后可發(fā)生機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)、多種組織的病變，如性早熟、腺瘤、皮膚色 素沉著和多發(fā)性骨纖維結(jié)構(gòu)不良等。顯然，對(duì)孕婦進(jìn)行有效的產(chǎn)前篩查可以防止GNAS1基 因激活性突變的患兒出生，從而在根本上防止了 FD的發(fā)生。而FD的產(chǎn)前篩查靶點(diǎn)主要是 針對(duì)GNAS1基因突變點(diǎn)，因此透徹、全面地了解FD中GNAS1基因的突變點(diǎn)位置、突變類型是 對(duì)FD進(jìn)行產(chǎn)前篩查有效與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前文獻(xiàn)報(bào)道的FD中GNAS1基因的經(jīng)典突變位 點(diǎn)為R201C和R201H，亦有過(guò)Q227L的報(bào)道。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了 FD患者GNAS1基因的一個(gè)新突 變位點(diǎn)C200R，它為FD的產(chǎn)前篩查提供了新的靶點(diǎn)。二、為FD的分子診斷提供新的靶點(diǎn)目前臨床上對(duì)FD的診斷主要依據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)特征和病變組織的顯微鏡下 觀察。FD的臨床表現(xiàn)主要有骨痛、骨畸形、疲勞性骨折、病理性骨折。影像學(xué)特征主要有X 線平片中呈典型的均質(zhì)、淡灰色毛玻璃樣改變，而顯微鏡下病變組織主要呈現(xiàn)為骨小梁纖 細(xì)，排列不規(guī)則，無(wú)極性，呈字母形，豆點(diǎn)狀，被大量纖維組織分割而缺乏連接。盡管如此，還 是由于缺乏最顯著的特征而導(dǎo)致FD在臨床上與骨化性纖維瘤、腦膜瘤和髓內(nèi)高分化骨肉 瘤的鑒別診斷存在困難。業(yè)已證明，F(xiàn)D是一種主要由GNAS1基因激活性突變所引發(fā)的疾病， 因此以GNAS1基因突變位點(diǎn)為基礎(chǔ)的FD分子診斷無(wú)疑成為確定診斷FD的一個(gè)非常重要的 部分。目前文獻(xiàn)報(bào)道的FD中GNAS1基因的經(jīng)典突變位點(diǎn)為R201C和R201H，亦有過(guò)Q227L 的報(bào)道。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了 FD患者GNAS1基因的一個(gè)新突變位點(diǎn)C200R，它為FD的分子診斷提 供了新的靶點(diǎn)。三、為FD的基因治療提供新的靶點(diǎn)目前臨床上尚缺乏根治FD的有效治療手段，只能對(duì)癥地從兩方面進(jìn)行治療。首先 是藥物治療，主要采用諸如帕米膦酸二鈉的雙膦酸鹽化合物，可以抑制骨吸收，消除骨的礦 化障礙。其次是手術(shù)治療，可以矯正畸形、預(yù)防病理性骨折，清除有臨床癥狀的病灶。但以 上兩種方法均不能根治FD。業(yè)已證明，F(xiàn)D是一種主要由GNAS1基因激活性突變所引發(fā)的疾
5病，因此基于FD中GNAS1突變位點(diǎn)的基因治療有望實(shí)現(xiàn)FD分子水平上的根治。而前提是 充分掃描FD中GNAS1基因的突變點(diǎn)。目前文獻(xiàn)報(bào)道的FD中GNAS1基因的經(jīng)典突變位點(diǎn)為 R201C和R201H，亦有過(guò)Q227L的報(bào)道。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了 FD患者GNAS1基因的一個(gè)新突變位 點(diǎn)C200R，它為FD的基因治療提供了新的靶點(diǎn)。


圖1 患者X線攝片。
圖2:患者病變組織切片H&E染色。
圖3:患者病變組織核基因組DNA瓊脂糖電泳。
圖4 等位基因特異PCR原理示意圖。
圖5:患者病變組織等位基因PCR結(jié)果。
圖6 測(cè)序PCR原理示意圖。
圖7:患者病變組織測(cè)序PCR結(jié)果。
圖8 患者血液中分離的間充質(zhì)干細(xì)胞。
圖9 患者血液中分離的間充質(zhì)干細(xì)胞核基因組測(cè)序PCR結(jié)果。
圖10患者血液中分離的間充質(zhì)干細(xì)胞核基因組等位基因特異PCR結(jié)果
具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的一種GNAS突變基因及其應(yīng)用的具體實(shí)施方式
作詳 細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1骨纖維結(jié)構(gòu)不良患者中GNAS基因一個(gè)新的突變位點(diǎn)C200R的發(fā)現(xiàn)過(guò)程(1)患者FD的大體診斷患者因脛骨骨折入院就診，根據(jù)以往病史、患者主訴、臨床癥狀和患者體征，結(jié)合X 線攝片(圖1)，初步診斷為FD，但尚不能完全排除骨化性纖維瘤和髓內(nèi)高分化骨肉瘤等疾病。(2)患者FD的鏡下診斷最終該患者接受手術(shù)治療，目的是清除有臨床癥狀的病灶，矯正畸形，預(yù)防病理性 骨折。術(shù)中我們收集清除下來(lái)的病變組織，將其置于4%多聚甲醛中進(jìn)行固定，之后用石蠟 包埋，用組織切片機(jī)制成病變組織的病理切片，然后將此切片進(jìn)行H&E染色，于顯微鏡下觀 察。結(jié)果如圖2顯示，病變組織主要由梭形纖維母細(xì)胞和不成熟編織骨兩種成分構(gòu)成，典型 編織狀骨小梁周邊無(wú)增生骨母細(xì)胞圍繞，編織骨直接由纖維組織化生形成，并有成熟障礙， 很少形成板層骨，骨小梁纖細(xì)，排列不規(guī)則，無(wú)極性，呈字母形，豆點(diǎn)狀，被大量纖維組織分 割而缺乏連接。以上表現(xiàn)使我們高度懷疑此疾病為FD。(3)患者FD的分子診斷將術(shù)中收集來(lái)的病變組織置于裂解緩沖液(lOmmol/L Tris-HCl (pH8. 0)，0. lmol/ L EDTA(pH8. 0)，0. 5% (w/v) SDS)中，37°C水浴1小時(shí)，之后加入終濃度為100 u g/ml的蛋 白酶K，充分倒置混勻，50°C水浴3小時(shí)，冷卻至室溫，加入等體積的酚氯仿，充分混勻以形 成均一乳濁液，室溫5000g離心15分鐘以分離兩相，用寬口吸頭將水相轉(zhuǎn)移備用，用酚氯仿再抽提兩次，收集水相，向水相中加入0. 2倍體積的10M醋酸鈉和2倍體積的無(wú)水乙醇，充 分混勻，室溫5000g離心5分鐘收集DNA沉淀，用70%乙醇清洗DNA沉淀兩次，空氣干燥， 用50 100 ill TE溶解DNA。紫外分光測(cè)定DNA的濃度和純度，配制0. 6 %瓊脂糖凝膠進(jìn) 行電泳。電泳結(jié)果如圖3。以上述提取的患者病變組織的核基因組DNA為模板，根據(jù)文獻(xiàn)上已報(bào)道的FD 患者GNAS1基因中的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異引物，進(jìn)行等位基因特異的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (allele-specific PCR)。原理如圖4，簡(jiǎn)述如下將已知的突變位點(diǎn)置于引物的3’端， 用此引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，如果模板中含有這種突變，即可產(chǎn)生固定長(zhǎng)度的DNA雙鏈，反之 則不會(huì)產(chǎn)生此DNA雙鏈。引物序列如下上游引物野生型5’ -GACCTGCTTCGCTGGCG-3’， R201H :5，-GGACCTGCTTCGCTGGCA-3，，R201C :5，-CAGGACCTGCTTCGCTCCT-3，；下游引物 5，-TCTTGCTTGTTGAGGAACAG-3，。PCR 反應(yīng)體系如下H20+2 ii 110XBuffer+l. 6 u 1 2. 5mM dNTP+0. 5 u 1 20mM上游引物+0. 5 u 1 20mM下游引物+1 u 1 DNA+0. 5 u 1 rTaq ；反應(yīng)程序如 下:94°C 5分鐘+(94°C 1分鐘+60°C 30秒鐘+72°C 1. 5分鐘)X28循環(huán)+72V 10分鐘，將 PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，結(jié)果如圖5。結(jié)果顯示，用R201C引物進(jìn)行的PCR反應(yīng)產(chǎn)生了 預(yù)計(jì)的DNA雙鏈，說(shuō)明患者病變區(qū)組織中核基因組GNAS1基因含有R201C突變。為了更確定上述PCR結(jié)果，我們隨之又采用了另外一種更精確的方法——測(cè)序 PCR。原理如圖6，簡(jiǎn)述如下設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，位于文獻(xiàn)報(bào)道的GNAS1經(jīng)典突變位點(diǎn)上 游和下游，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，將得到的產(chǎn)物克隆于質(zhì)粒載體中進(jìn)行DNA測(cè)序，將測(cè)序得到 的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的GNAS1序列相比對(duì)，得到突變位點(diǎn)。引物序列如下上游引物 5，-ATTATTACTGTTTCGGTTGG-3，；下游引物5，-CACCTGGAACTTGGTCTC-3，。PCR 反應(yīng)體系如 下H20+2ii 110XBuffer+l. 6ii 1 2. 5mM dNTP+0. 5 u 1 20mM 上游引物+0. 5 ii 1 20mM 下游 引物+1 u 1 DNA+0. 5 u 1 rTaq ；反應(yīng)程序如下94°C 5分鐘+(94°C 1分鐘+60°C 30秒鐘 +72V 1.5分鐘)X28循環(huán)+72°C 10分鐘，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖電泳，凝膠回收目的 條帶，回收產(chǎn)物克隆于PMD-19T質(zhì)粒載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，將此細(xì)菌過(guò)夜培養(yǎng)，次日 挑取100個(gè)克隆送至上海英駿生物科技公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)提供的GNAS1 序列相比對(duì)，得到突變位點(diǎn)。結(jié)果如圖7顯示，患者病變區(qū)組織中核基因組GNAS1基因的確 含有R201C突變。至此，從大體、影像學(xué)、鏡下和分子四個(gè)層次共同將此疾病診斷為FD。(4)此患者血液中間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)采集患者5ml血液，與肝素化的低糖a -MEM完全培養(yǎng)基混勻，接種于培養(yǎng)皿上， 置于37°C、5% C02培養(yǎng)箱孵育，3天后半量換液，一周后完全換液，以后每周更換培養(yǎng)基2 次，約于第12天，貼壁細(xì)胞近90 %匯合，吸凈培養(yǎng)基，以PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2次，加入1ml 0. 05 %胰蛋白酶，置于37°C、5 % C02培養(yǎng)箱孵育2分鐘，加入9ml低糖a -MEM完全培養(yǎng)基以 中和胰蛋白酶的活性，用移液管輕輕吹打細(xì)胞使之成單細(xì)胞懸液，按1 3進(jìn)行傳代培養(yǎng)。 細(xì)胞形態(tài)如圖8。(5)骨纖維結(jié)構(gòu)不良患者中GNAS基因一個(gè)新的突變位點(diǎn)C200R的發(fā)現(xiàn)將上述從病人血液中得到的間充質(zhì)干細(xì)胞置于37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至匯 合率 95% 時(shí)，用裂解緩沖液(10mmol/L Tris-HCl (pH8. 0),0. lmol/L EDTA (pH8. 0), 0. 5 % (w/v)SDS)將細(xì)胞裂解，37°C水浴1小時(shí)，之后加入終濃度為lOOy g/ml的蛋白酶K，充分倒 置混勻，50°C水浴3小時(shí)，冷卻至室溫，加入等體積的酚氯仿，充分混勻以形成均一乳濁液，室溫5000g離心15分鐘以分離兩相，用寬口吸頭將水相轉(zhuǎn)移備用，用酚氯仿再抽提兩次， 收集水相，向水相中加入0. 2倍體積的10M醋酸鈉和2倍體積的無(wú)水乙醇，充分混勻，室溫 5000g離心5分鐘收集DNA沉淀，用70%乙醇清洗DNA沉淀兩次，空氣干燥，用50 100 yl TE溶解DNA。紫外分光測(cè)定DNA的濃度和純度，配制0. 6%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。以上述提取的核基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行針對(duì)GNAS1的 測(cè)序PCR。引物序列如下上游引物5，-ATTATTACTGTTTCGGTTGG-3，；下游引物: 5，-CACCTGGAACTTGGTCTC-3，。PCR 反應(yīng)體系如下H20+2 u 110XBuffer+l. 6 u 1 2. 5mM dNTP+0. 5 u 1 20mM上游引物+0. 5 u 1 20mM下游引物+1 u 1 DNA+0. 5 u 1 rTaq ；反應(yīng)程序如 下:94°C 5分鐘+(94°C 1分鐘+60°C 30秒鐘+72°C 1. 5分鐘)X28循環(huán)+72V 10分鐘，將 PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖電泳，凝膠回收目的條帶，回收產(chǎn)物克隆于PMD-19T質(zhì)粒載體中，轉(zhuǎn) 化大腸桿菌DH5 a，將此細(xì)菌過(guò)夜培養(yǎng)，次日挑取100個(gè)克隆送至上海英駿生物科技公司測(cè) 序。測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)提供的GNAS1序列相比對(duì)，得到突變位點(diǎn)。如圖9顯示，在患 者血液中間充質(zhì)干細(xì)胞核基因組中GNAS1基因存在C200R的突變。為了更確切地驗(yàn)證這個(gè)新發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)，我們以上述提取的核基因組DNA為模 板，設(shè)計(jì)特異性引物，針對(duì)這個(gè)新突變位點(diǎn)進(jìn)行等位基因特異的PCR。引物序列如下上游 引物5，-GTTTCAGGACCTGCTTCCCC-3，，下游引物5，-TCTTGCTTGTTGAGGAACAG-3，。PCR 反應(yīng) 體系如下H20+2ii 110XBuffer+l. 6u 1 2. 5mM dNTP+0. 5 u 1 20mM 上游引物+0. 5 ii 1 20mM 下游引物+1 U 1 DNA+0. 5 u 1 rTaq ；反應(yīng)程序如下94°C 5分鐘+(94°C 1分鐘+60°C 30秒 鐘+72°C 1. 5分鐘)X 28循環(huán)+72°C 10分鐘，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖電泳，結(jié)果與測(cè)序 PCR結(jié)果相符合(圖10)。實(shí)施例2C200R生物學(xué)功能的實(shí)驗(yàn)一、pcDNA3. 1 (+) -c-myc-GNASl 表達(dá)載體的構(gòu)建人類MSCs置于低糖0-|^11完全培養(yǎng)基、371和5%0)2培養(yǎng)箱孵育。于95%匯合 率時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，用冰預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞兩次。將細(xì)胞刮入PBS中，4°C 300g離心5分鐘 收集細(xì)胞，棄上清，加入lml Trizol充分裂解細(xì)胞至澄清。室溫靜置5分鐘，每lml Trizol 加入氯仿0. 2ml，劇烈晃動(dòng)15秒鐘，室溫靜置2 3分鐘，4°C 12000g離心15分鐘。之后可 見(jiàn)樣品分相，將最上層的水相轉(zhuǎn)移備用。每lml Trizol加入0. 5ml異丙醇，混勻，室溫靜置 10分鐘，4°C 12000g離心10分鐘，棄上清，每lml Trizol加入lml 75%乙醇清洗RNA沉淀， 4°C 7500g離心5分鐘。棄上清，空氣干燥5 10分鐘，加入DEPC處理過(guò)的ddH20，55°C 60°C孵育10分鐘。紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度，最后進(jìn)行變性瓊脂糖電泳。RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的體系和程序如下0. 5 ii g 5 ii g RNA+1 u 1 500 u g/ ml01igo-dT+ddH20 = 10 u 1，70°C 5 分鐘，置于冰上，加入 4 ii 1 5XRT Buffer+5 u 1 2. 5mM dNTP，37°C 5分鐘，置于冰上，加入1 P 1逆轉(zhuǎn)錄酶，42°C 60分鐘，70°C 5分鐘。設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增GNAS1的編碼序列并在5’端與c-myc標(biāo)簽蛋白相融合(序 列見(jiàn)序列表)，引物序列為上游引物5，-ATGGTACCATGGAACAAAAACTTATTTCTGAAGAAGATCT GATGGTACCATGGGCTGCCTCGGGAACAG-3，，下游引物5’ -CATTCTAGATTAGAGCAGCTCGTACTGAC-3，。PCR 反應(yīng)體系如下H20+2 ii 1 10XBuffer+l. 6u 1 2. 5mM dNTP+0. 5 u 1 20mM 上游引物 +0. 5 ill 20mM 下游引物 +1 u 1 cDNA+0. 5 u 1 pfu ；反應(yīng)程序如下94°C 5 分鐘 +(94°C 1 分鐘+60°C 30秒鐘+72°C 2. 5分鐘)X28循環(huán)+72°C 10分鐘，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電 泳，凝膠回收目的條帶。Kpnl和Xbal雙酶切PCR回收產(chǎn)物和pcDNA3. 1 (+)載體，體系如下 H20+2 u 110XBuffer+l u g DNA+1 u 1 KpnI+1 u 1 Xbal ；37°C水浴 2 小時(shí)。將酶切產(chǎn)物進(jìn)行
瓊脂糖電泳，凝膠回收目的條帶。16°C過(guò)夜連接上述酶切DNA片斷和pcDNA3. 1(+)載體 片斷，次日將此連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，將此細(xì)菌過(guò)夜培養(yǎng)，次日挑取克隆送至公司 測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中人類GNAS1編碼序列相比對(duì)確認(rèn)克隆成功。二、pcDNA3. 1 (+) -c-myc-GNASl 載體 R201C 和 C200R 的體外誘變以上述構(gòu)建好的pcDNA3. 1⑴-C-myC-GNASl載體為模板，針對(duì)文獻(xiàn)中報(bào)道的FD中 GNAS1基因的經(jīng)典突變位點(diǎn)R201C和本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的新突變位點(diǎn)C200R設(shè)計(jì)特異性引物，序 列如下R201C :5，-GCTTCGCTGCTGTGTCCTGAC-3，，5，-GTCAGGACACAGCAGCGAAGC-3，；C200R 5，-CCTGCTTCGCCGCCGTGTCCT-3，，5，-AGGACACGGCGGCGAAGCAGG-3，。PCR 反應(yīng)體系如下 H20+2u 110XBuffer+l. 6u 1 2. 5mM dNTP+0. 5 u 1 20mM 上游引物+0. 5 ii 1 20mM 下游引物 +1 u 1 cDNA+0. 5 ill pfu ；反應(yīng)程序如下:94°C 5 分鐘 + (94°C 1 分鐘 +60 °C 30 秒鐘 +72 °C 13 分鐘)X 28循環(huán)+72°C 10分鐘。之后將此PCR產(chǎn)物用Dpnl酶切，37°C水浴3小時(shí)，將此酶 切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，將此細(xì)菌過(guò)夜培養(yǎng)，次日挑取克隆送至公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中人類GNAS1編碼序列相比對(duì)確認(rèn)誘變成功。三、pcDNA3.1 (+) -c-myc-GNASl, pcDNA3. 1 (+) -c-myc-GNASl (R201C)禾口 pcDNA3. 1 (+) -c-myc-GNASl (C200R)的過(guò)表達(dá)人類MSCs置于低糖a -MEM完全培養(yǎng)基、37°C和5% C02培養(yǎng)箱孵育。將上述構(gòu)建 好的三種質(zhì)粒載體 pcDNA3. 1(+)-c-myc-GNASl、pcDNA3. 1 (+) -c-myc-GNASl (R201C)和 pcDN A3. 1 (+) -c-myc-GNASl (C200R)0. 5u g分別與無(wú)血清培養(yǎng)基混合至50 u 1，輕柔混勻。用無(wú) 血清培養(yǎng)基稀釋一定量的1 ipofectamine2000至50 yl，輕柔混勻，室溫靜置5分鐘，將上述 DNA和lipofectamindOOO混合，輕柔混勻，室溫靜置20分鐘，之后將MSCs的培養(yǎng)基棄去， 加入上述混合物，置于37°C和5% C02培養(yǎng)箱孵育6小時(shí)，然后加入新鮮培養(yǎng)基。分別于轉(zhuǎn)染后的24、48、72和96小時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，用冰預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞兩 次，將細(xì)胞刮入PBS中，4°C 300g離心5分鐘收集細(xì)胞，棄上清，加入RIPA裂解液和蛋白酶 抑制齊U (10 y g/ml leupeptin, 10 u g/ml pepstatin A 禾口 10 li g/ml aprotinin)。反復(fù)吹 打至細(xì)胞裂解，冰上孵育30分鐘。4°C 12000g離心30分鐘，將上清轉(zhuǎn)移備用。用BCA法 測(cè)定蛋白濃度。向蛋白樣品中加入同體積2Xl0ading buffer，95°C孵育10分鐘，每孔上 樣30 ii g在1 X電泳緩沖液中電泳，先以80V恒壓電泳30分鐘，之后以120V恒壓電泳2 3小時(shí)。將凝膠、PVDF膜和濾紙按照一定順序疊好，置于IX轉(zhuǎn)膜緩沖液中轉(zhuǎn)膜，條件為 4°C 300mA恒流3小時(shí)，之后將PVDF膜置于5%脫脂奶粉中室溫封閉1小時(shí)，anti-c-myc — 抗(1 1000)和 anti-beta-actin(l 10000) 4°C孵育過(guò)夜。次日 TBST 室溫清洗 PVDF 膜 15分鐘X4次，HRP標(biāo)記的二抗(1 4000)室溫孵育1小時(shí)，TBST室溫清洗PVDF膜15分 鐘X4次，運(yùn)用ECL將PVDF膜對(duì)X光片進(jìn)行曝光。四、MSCs 過(guò)表達(dá) pcDNA3. 1 (+)-c-myc-GNASl、pcDNA3. 1 (+)-c-myc-GNASl (R201C) 或 pcDNA3. 1 (+) -c-myc-GNASl (C200R)后細(xì)胞 cAMP、PKA 和 IL-6 含量的檢測(cè)分別于轉(zhuǎn)染 pcDNA3. 1 (+) -c-myc-GNASl、pcDNA3. 1 (+) -c-myc-GNASl (R201C)或
9pcDNA3. 1 (+) -c-myc-GNASl (C200R)后的24、48、72和96小時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，用冰預(yù)冷的PBS 清洗細(xì)胞兩次，將細(xì)胞刮入PBS中，4°C 300g離心5分鐘收集細(xì)胞，棄上清，加入RIPA裂解 液禾口蛋白醇抑制齊[J (10u g/mlleup印tin, 10u g/ml p印statin A禾口 lOug/ml aprotinin)。 反復(fù)吹打至細(xì)胞裂解，冰上孵育30分鐘。4°C 12000g離心30分鐘，將上清轉(zhuǎn)移備用。用 BCA法測(cè)定蛋白濃度。向蛋白樣品中加入同體積2Xloading buffer，95°C孵育10分鐘，每孔上樣30 ii g 在1 X電泳緩沖液中電泳，先以80V恒壓電泳30分鐘，之后以120V恒壓電泳2 3小時(shí)。將 凝膠、PVDF膜和濾紙按照一定順序疊好，置于IX轉(zhuǎn)膜緩沖液中轉(zhuǎn)膜，條件為4°C 300mA恒 流3小時(shí)，之后將PVDF膜置于5%脫脂奶粉中室溫封閉1小時(shí)，anti-p-PKA—抗(1 1000) 和anti-beta-actin(l 10000) 4°C孵育過(guò)夜。次日TBST室溫清洗PVDF膜15分鐘X4次， HRP標(biāo)記的二抗(1 4000)室溫孵育1小時(shí)，TBST室溫清洗PVDF膜15分鐘X 4次，運(yùn)用 ECL將PVDF膜對(duì)X光片進(jìn)行曝光。最后用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞cAMP和IL-6的含量。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護(hù)范圍。SEQUENCE LISTING<110>上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院<120>—種GNAS突變基因及其應(yīng)用<130>/<160>9<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>1185<212>DNA<213> 智人(Homo sapiens)<400>1
0095]atgggctgcctcgggaacagtaagaccgaggaccagcgcaacgaggagaaggcgcagcgt600096]gaggccaacaaaaagatcgagaagcagctgcagaaggacaagcaggtctaccgggccacg1200097]caccgcctgctgctgctgggtgctggagaatctggtaaaagcaccattgtgaagcagatg1800098]aggatcctgcatgttaatgggtttaatggagagggcggcgaagaggacccgcaggctgca2400099]aggagcaacagcgatggtgagaaggcaaccaaagtgcaggQ.CQ.X^CQ.Q.Q.Q.0.caacctgaaa3000100]gaggcgattgaaaccattgtggccgccatgagcaacctggtgccccccgtggagctggcc3600101]aaccccgagaaccagttcagagtggactacatcctgagtgtgatgaacgtgcctgacttt4200102]gacttccctcccgaattctatgagcatgccaaggctctgtgggaggatgaaggagtgcgt4800103]gcctgctacgaacgctccaacgagtaccagctgattgactgtgcccagtacttcctggac5400104]aagatcgacgtgatcaagcaggctgactatgtgccgagcgatcaggacctgcttcgctgc6000105]cgtgtcctgacttctggaatctttgagaccaagttccaggtggacaaagtcaacttccac6600106]atgtttgacgtgggtggccagcgcgatgaacgccgcaagtggatccagtgcttcaacgat7200107]gtgactgccatcatcttcgtggtggccagcagcagctacaacatggtcatccgggaggac7800108]aaccagacca accgcctgcaggaggctctg0109]tggctgcgca ccatctctgtgatcctgttc0110]gtccttgctg ggaaatcgaagattgaggac 0111]cctgaggatg ctactcccgagcccggagag0112]attcgagatg agtttctgaggatcagcact0113]cctcatttca cctgcgctgtggacactgag0114]gacatcattc agcgcatgcaccttcgtcag0115]<210>20116]<211>200117]<212>DNA0118]<213>人工序列0119]<400>20120]attattactg tttcggttgg0121]<210>30122]<211>180123]<212>DNA0124]<213>人工序列0125]<400>30126]cacctggaac ttggtctc0127]<210>40128]<211>200129]<212>DNA0130]<213>人工序列0131]<400>40132]gtttcaggac ctgcttcccc0133]<210>50134]<211>200135]<212>DNA0136]<213>人工序列0137]<400>50138]tcttgcttgt tgaggaacag0139]<210>60140]<211>190141]<212>DNA0142]<213>人工序列0143]<400>60144]caggacctgc ttcgctcct0145]<210>70146]<211>20
aacctcttcaagagcatctggaacaacaga840ctcaacaagcaagatctgctcgctgagaaa900tactttccagaatttgctcgctacactact960gacccacgcgtgacccgggccaagtacttc1020gccagtggagatgggcgtcactactgctac1080aacatccgccgtgtgttcaacgactgccgt1140tacgagctgctctaa1185
20
18
20
20
19
<212>DNA<213〉人工序列<400>7tcttgcttgt tgaggaacag20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>8attattactg tttcggttgg20<210>9<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>9cacctggaac ttggtctc18
1權(quán)利要求
一種GNAS突變基因，其特征在于，所述GNAS突變基因的突變位點(diǎn)位于所述GNAS基因中從5’端起的第600個(gè)核苷酸，突變結(jié)果是由T突變?yōu)镃。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GNAS突變基因，其特征在于，所述GNAS突變基因的突變位點(diǎn) 位于所述GNAS基因中從5’端起的第603個(gè)核苷酸，突變結(jié)果是由C突變?yōu)門。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GNAS突變基因，其編碼氨基酸突變位點(diǎn)位于第200個(gè)氨基 酸，突變結(jié)果是由C突變?yōu)镽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GNAS突變基因，其編碼氨基酸突變位點(diǎn)位于第201個(gè)氨基 酸，突變結(jié)果是由R突變?yōu)镃。
5.一種檢測(cè)骨纖維結(jié)構(gòu)不良疾病的主效基因之一 GNAS突變基因的試劑盒，其包 括擴(kuò)增引物，用于PCR反應(yīng)的DNA聚合酶及其緩沖液的一種或多種，所述擴(kuò)增引物選自 GNAS-C200R-1、GNAS-C200R-2、GNAS-R201C-3、GNAS-R201C-4，擴(kuò)增引物 GNAS-C200R-1， 上游引物5，-ATTATTACTGTTTCGGTTGG-3’， 下游引物5，-CACCTGGAACTTGGTCTC-3，； 擴(kuò)增引物 GNAS-C200R-2， 上游引物5’ -GTTTCAGGACCTGCTTCCCC-3，， 下游引物5，-TCTTGCTTGTTGAGGAACAG-3，； 擴(kuò)增引物 GNAS-R201C-3， 上游引物5’ -CAGGACCTGCTTCGCTCCT-3，， 下游引物5，-TCTTGCTTGTTGAGGAACAG-3，； 擴(kuò)增引物 GNAS-R201C-4， 上游引物5，-ATTATTACTGTTTCGGTTGG-3’， 下游引物5，-CACCTGGAACTTGGTCTC-3，。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GNAS突變基因在制備檢測(cè)骨纖維結(jié)構(gòu)不良疾病藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒在制備檢測(cè)骨纖維結(jié)構(gòu)不良疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及骨纖維結(jié)構(gòu)不良患者中GNAS基因一個(gè)新的突變位點(diǎn)，所述GNAS突變基因的突變位點(diǎn)位于所述GNAS基因中從5’端起的第600個(gè)核苷酸，突變結(jié)果是由T突變?yōu)镃。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)骨纖維結(jié)構(gòu)不良疾病的主效基因之一GNAS突變基因的試劑盒，GNAS新突變基因的用途和試劑盒的用途。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于1.為FD的產(chǎn)前篩查提供新的靶點(diǎn)；2.為FD的分子診斷提供新的靶點(diǎn)；3.為FD的基因治療提供新的靶點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101824413SQ20091004702
公開日2010年9月8日 申請(qǐng)日期2009年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月4日 公開號(hào)200910047022.發(fā)明者岳冰, 湯亭亭, 范啟明 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院