專利名稱：：一種酶法制備¹³C、¹⁵N雙標(biāo)記L-絲氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物、醫(yī)藥、化工領(lǐng)域，具體涉及一種酶法制備13C、"N雙標(biāo)記L-絲氨酸的方法。
背景技術(shù)：
：L-絲氨酸(L-serine)，分子式C3H7N03，無色晶體，分子量105.09，熔點(diǎn)228°C(分解)。屬于非必需的氨基酸，是一種重要的生化試劑和藥劑，已被廣泛用于氨基酸輸液、食品和飼料添加劑以及化妝品行業(yè)等領(lǐng)域。13C、"N-L-絲氨酸是L-絲氨酸的同位素標(biāo)記化合物，可作為示蹤劑，用于生物體以及藥物代謝等研究。"C和"N雙標(biāo)記的L-絲氨酸市場上已有銷售，其合成的文獻(xiàn)卻鮮有報(bào)道。相關(guān)的"C或"N標(biāo)記L-絲氨酸產(chǎn)品主要采用酶法和化學(xué)法合成。如酶法中，MaedaHidekatsu等以MethylobacteriumextorquensJCM2804為出發(fā)菌株，利用甘氨酸和["C]甲醛合成[3"C]絲氨酸，絲氨酸濃度9mg/mL(MaedaHidekatsu,TakataKohhei,ToyodaAtsushi，NiitsuTakashi,IwakuraMasanori,ShibataKunihiko.ProductionofL-[3-13C]serinefrom[13C]formaldehydeandglycineusinganenzymesystemcombinedwithtetrahydrofolateregeneration[J].JFermentBioeng,1997,83(1):113-115);JohnHanners等以假單胞細(xì)菌AMl(ATCC14718)為出發(fā)菌株，^C]甲醇為碳源，[2-13C]甘氨酸為前體物，利用甲基脫氫酶和羥甲基轉(zhuǎn)移酶，合成了0.84-1.05g/L的L-[2，3-13(22]絲氨酸(JohnHanners,RowenaGibson,KarenVelarde,JudyHammer,MarkAlvarez,JanetGriego,CliffordJUnkefer.Steroselectivesynthesisofstableisotope-labeledL-a-amino:Biosynthesisof2H-，13C-，and15N-LabledL-serines[J].JournalofLabeledCompoundsandRadiopharmaceuticals,1991，29(7):781-790)。化學(xué)法中，GaniDavid等利用標(biāo)記的天門冬氨酸6步合成標(biāo)記的絲氨酸(GaniDavid,YoungDouglasW.SynthesisofL-serinestereospecificallylabeledatC-3withdeuterium[J],JChemSocPerkinTrans,1983，1(10):2393-2398)，楊飛等以"N-乙酰氨基丙二酸二乙酯為原料，合成"NL-絲氨酸。但是上述方法制備的"C和"N雙標(biāo)記的L-絲氨酸同位素原料轉(zhuǎn)化率都很低。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種高純度以及高豐度的酶法制備13C、"N雙標(biāo)記L-絲氨酸的方法。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種酶法制備"C、"N雙標(biāo)記L-絲氨酸的方法，其特征在于，該方法是將1.0100mg/ml干菌體、0.10.5M緩沖液以及5100mg/ml同位素原料、5100mg/ml甘氨酸混合，混合物在3040°C、120260r/min下反應(yīng)1096h，得到的酶促反應(yīng)液進(jìn)行樹脂分離、濃縮、過濾、結(jié)晶，得到"C、"N雙標(biāo)記L-絲氨酸產(chǎn)品。所述的干菌體內(nèi)含絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶。所述的緩沖液選自磷酸鹽、碳酸鹽或Tris-HCl中的一種，其pH為7.09.0。所述的同位素原料選自"C-甲醛、甲醇、甲酸中的一種。所述的甘氨酸選自1-13C，"N-甘氨酸、2-13C，"N-甘氨酸、13C2，"N-甘氨酸、"N-甘氨酸中的一種。所述的酶促反應(yīng)液的上柱液pH為24。所述的樹脂分離采用732樹脂柱吸附，0.1N0.5N氨水洗脫，分別收集絲氨酸、甘氨酸以及甘氨酸和絲氨酸混合物的洗脫液。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用1-13C，"N-甘氨酸、2-13C，"N-甘氨酸、13C2，"N-甘氨酸、"N-甘氨酸的一種和"C-甲醛、甲醇或甲酸的一種作為同位素原料，經(jīng)酶反應(yīng)獲得13。"N-L-絲氨酸，再經(jīng)樹脂分離，濃縮、結(jié)晶，得到豐度和純度大于98%的13C、"N-L-絲氨酸產(chǎn)品。此工藝簡單，原料來源容易，可獲得高豐度和純度的"C、"N-L-絲氨酸產(chǎn)品。具體實(shí)施方式'下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。一種酶法制備"C、"N-L-絲氨酸，具體方法如下將500mg干菌體、0.1M的磷酸鹽緩沖液、198mg(6mmol)"C-甲醇、456mg(6mmo1)"N-甘氨酸加入到裝有20ml酶轉(zhuǎn)化液的500ml錐形瓶中，用稀氨水調(diào)pH為8.5，混合物在37°C、180r/min下培養(yǎng)48h。將酶促反應(yīng)液用HC1調(diào)pH為3.0，過濾，732樹脂柱吸附，0.2N氨水洗脫，分別收集3-"C、"N-L-絲氨酸、"N-甘氨酸以及"N-甘氨酸和3-13C，"N-絲氮酸混合物的洗脫液，再經(jīng)濃縮、無水乙醇結(jié)晶，得到218.88mg(2.88mmol)15N-甘氨酸和179.76mg(L68mmo1)3-13C、"N-L-絲氨酸。純度不少于98%，豐度大于98%。實(shí)施例2一種酶法制備"C、"N-L-絲氨酸，具體方法如下將400mg干菌體、0.5M的Tris-HCl緩沖液、373mg(12mmo1)"C-甲醛、1.82g(24mmol)1-13C，"N-甘氨酸加入到裝有40ml酶轉(zhuǎn)化液的500ml錐形瓶中，用稀氨水調(diào)pH為8.0，混合物在30。C、120r/min下培養(yǎng)24h。將酶促反應(yīng)液用HC1調(diào)pH為2.4，過濾，732樹脂柱吸附，0.5N氨水洗脫，分別收集1，3-13C、"N-L-絲氨酸、1-13C、"N-甘氨酸以及1-13C、"N-甘氨酸和1，3-13C、"N-絲氨酸混合物的洗脫液，再經(jīng)濃縮、無水乙醇結(jié)晶，得到1.43g(18.6mmo1)"N-甘氨酸和272.16mg(2.52mmo1)1，3-13C、"N-L陽絲氨酸。純度不少于98%，豐度大于98%。實(shí)施例3一種酶法制備"C、"N-L-絲氨酸，具體方法如下將3600mg干菌體、0.2M的碳酸鈉緩沖液、5.64g(120mmo1)130甲酸、4.56g(60mmol)2-13C、"N-甘氨酸加入到裝有60ml酶轉(zhuǎn)化液的500ml錐形瓶中，用稀氨水調(diào)pH為7.0，混合物在40"C、150r/min下培養(yǎng)96h。將酶促反應(yīng)液用HC1調(diào)pH為3.8，過濾，732樹脂柱吸附，0.4N氨水洗脫，分別收集2，3-13C、"N-絲氨酸、2-13C、"N-甘氨酸以及2-"C、"N-甘氨酸和2，3-13C、"N-絲氨酸混合物的洗脫液，再經(jīng)濃縮、無水乙醇結(jié)晶，得到2.95g(37.8mmol)2-13C、"N-甘氨酸和0.84g(8.1mmol)2，3-13C、"N-L-絲氨酸。純5度不少于98%，豐度大于98%。實(shí)施例4一種酶法制備"C、"N-L-絲氨酸，具體方法如下將3000mg干菌體、0.5M的Tris-HCl緩沖液、495mg(15mmo1)"C-甲醇、3g(39.5mmol)13C2-151^-甘氨酸加入到裝有30ml酶轉(zhuǎn)化液的500ml錐形瓶中，用稀氨水調(diào)pH為9.0，混合物在33t:、260r/min下培養(yǎng)96h。將酶促反應(yīng)液用HCl調(diào)pH為3.4，過濾，732樹脂柱吸附，0.15N氨水洗脫，分別收集絲氨酸、13C2、"N-甘氨酸以及13C2、"N-甘氨酸和絲氨酸混合物的洗脫液，再經(jīng)濃縮、無水乙醇結(jié)晶，得到2.25g(28.8mmol)13C2、"N-甘氨酸和294.3mg(2.7mmol)13C3、"N-L-絲氨酸產(chǎn)品。純度不少于98%，豐度大于98%。實(shí)施例5一種酶法制備^C、"N-L-絲氨酸，具體方法如下將lg干菌體、0.45M的磷酸鹽緩沖液、20g(0.43mol)130甲酸、1.52g(20mmo1)"N-甘氨酸加入到裝有200ml酶轉(zhuǎn)化液的500ml錐形瓶中，用稀氨水調(diào)pH為8.4，混合物在32°C、200r/min下培養(yǎng)60h。將酶促反應(yīng)液用HC1調(diào)pH為4.0，過濾，732樹脂柱吸附，0.42N氨水洗脫，分別收集3"C、"N-L-絲氨酸、"N-甘氨酸以及"N-甘氨酸和3-13C、15N-L-絲氨酸混合物的洗脫液，再經(jīng)濃縮、無水乙醇結(jié)晶，得到1.03g(13.5mmol)15N-甘氨酸和257.87mg(2.41mmol)3-13C、"N-L-絲氨酸。純度不少于98%，豐度大于98%。權(quán)利要求1.一種酶法制備13C、15N雙標(biāo)記L-絲氨酸的方法，其特征在于，該方法是將1.0～100mg/ml干菌體、0.1～0.5M緩沖液以及5～100mg/ml同位素原料、5～100mg/ml甘氨酸混合，混合物在30～40℃、120～260r/min下反應(yīng)10～96h，得到的酶促反應(yīng)液進(jìn)行樹脂分離、濃縮、過濾、結(jié)晶，得到13C、15N雙標(biāo)記L-絲氨酸產(chǎn)品。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶法制備13C、"N雙標(biāo)記L-絲氨酸的方法，其特征在于，所述的干菌體內(nèi)含絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶法制備13C、"N雙標(biāo)記L-絲氨酸的方法，其特征在于，所述的緩沖液選自磷酸鹽、碳酸鹽或Tris-HCl中的一種，其pH為7.09.0。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶法制備13C、"N雙標(biāo)記L-絲氨酸的方法，其特征在于，所述的同位素原料選自"C-甲醛、甲醇、甲酸中的一種。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶法制備13C、"N雙標(biāo)記L-絲氨酸的方法，其特征在于，所述的甘氨酸選自1-13C，"N-甘氨酸、2-13C，"N-甘氨酸、13C2，"N-甘氨酸、"N-甘氨酸中的一種。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶法制備13C、"N雙標(biāo)記L-絲氨酸的方法，其特征在于，所述的酶促反應(yīng)液的上柱液pH為24。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶法制備13C、"N雙標(biāo)記L-絲氨酸的方法，其特征在于，所述的樹脂分離采用732樹脂柱吸附，0.1N0.5N氨水洗脫，分別收集絲氨酸、甘氨酸以及甘氨酸和絲氨酸混合物的洗脫液。全文摘要本發(fā)明涉及一種酶法制備¹³C、¹⁵N雙標(biāo)記L-絲氨酸的方法，該方法是將1.0～100mg/ml干菌體、0.1～0.5M緩沖液以及5～100mg/ml同位素原料、5～100mg/ml甘氨酸混合，混合物在30～40℃、120～260r/min下反應(yīng)10～96h，得到的酶促反應(yīng)液進(jìn)行樹脂分離、濃縮、過濾、結(jié)晶，得到¹³C、¹⁵N雙標(biāo)記L-絲氨酸產(chǎn)品。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有工藝簡單，原料來源容易，可獲得高豐度和純度的¹³C、¹⁵N-L-絲氨酸產(chǎn)品等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)C12P13/06GK101503717SQ200910047388公開日2009年8月12日申請(qǐng)日期2009年3月11日優(yōu)先權(quán)日2009年3月11日發(fā)明者劉占峰,孫建春,宋明鳴,徐建飛,李良君,杜曉寧,梅叢笑,剛王申請(qǐng)人:上海化工研究院