專利名稱：米氏凱倫藻鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及為赤潮預(yù)防預(yù)測(cè)提供參考的藻類鑒定。
背景技術(shù)：
目前用于鑒別赤潮藻類的引物通常為通用型引物，如利用微藻的核糖體5. 8S rDNA、18S rDNA、28S rDNA、ITS區(qū)的基因序列相對(duì)保守區(qū)域所設(shè)計(jì)的引物，這種引物能夠 適用于真核生物或者甲藻門藻類，范圍比較大，作為初次鑒定較為方便，但由于其專一性不 強(qiáng)，無法一次性定位到具體的藻種，因此難以達(dá)到赤潮藻鑒定的要求。而且采用通用引物經(jīng) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)實(shí)驗(yàn)后，獲得產(chǎn)物序列需通過基因測(cè)序，分析后方能明確其所屬種 類。這種方法過程步驟較多，耗時(shí)、耗費(fèi)大量的費(fèi)用，且無法適用在缺乏測(cè)序條件之時(shí)。因 此，開發(fā)針對(duì)性較強(qiáng)的引物是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，查閱最新發(fā)表的研究報(bào)告，已有專家利用核 糖體18S rDNA、葉綠體rbcl等基因序列設(shè)計(jì)出鑒別單類藻種的引物探針，一次性PCR擴(kuò)增 就能鑒定到位，無需測(cè)序，大大縮短了鑒定周期，同時(shí)節(jié)省了大量費(fèi)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的問題是提供米氏凱倫藻聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒定特異性引物。本發(fā)明通過藻種培養(yǎng)、總DNA提取，其特征是利用Primer 5. 0軟件對(duì)米氏凱倫藻 (Karenia mikimotoi)核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS區(qū))設(shè)計(jì)了專一性鑒定引物KilF3和KilB3，引物序列為 Ki 1F3 CAACTTGAATTCATTGTGAACC ；Κ 1Β3 :ATGTGAATCAAACATGTGGT ；基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，有擴(kuò)增條帶為米氏凱倫藻。本發(fā)明專門用于鑒定米氏凱倫藻，對(duì)其他藻種則是陰性，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，無需基因 測(cè)序，直接通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，便能確定為米氏凱倫藻。該發(fā)明操作簡(jiǎn)單，特別適合 于在具有普通PCR儀的一般實(shí)驗(yàn)室里操作。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)驗(yàn)按以下步驟進(jìn)行(1)藻種培養(yǎng)研究對(duì)象是米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)。對(duì)照藻有環(huán)狀異 巾冒藻(Heterocapsa circularisquama)，塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)，鏈 狀亞歷山大藻(A. catenella)，微小亞歷山大藻(A. minutum)，海洋原甲藻(Prorocentrum micans)，利瑪原甲藻(Prorocentrum lima)。培養(yǎng)基采用天然海水，按照不含硅酸鹽的f/2 配方配制，其中氮、磷濃度按實(shí)驗(yàn)要求另加。培養(yǎng)基經(jīng)121°C高壓蒸汽滅菌20min后備用。 培養(yǎng)溫度為(25士 1)°C，以日光燈為光源，光照強(qiáng)度為ΙΟΟΙχ，光暗比為12h 12h。(2)總DNA提取離心收集處于指數(shù)生長(zhǎng)期藻細(xì)胞，用改良CTAB法提取基因組總 DNA，酚、氯仿抽提純化。(3)引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中米氏凱倫藻的ITS基因序列(AF183473)，對(duì)照不同屬、科、目、綱的多種其他藻種ITS區(qū)序列，找尋特征性基因序列，利用Primer軟件5. O設(shè) 計(jì)，篩選出多對(duì)引物，通過PCR實(shí)驗(yàn)，確定最佳引物為KilF3 CAACTTGAATTCATTGTGAACC禾口 Ki 1B3 :ATGTGAATCAAACATGTGGT。(4) PCR擴(kuò)增采用設(shè)計(jì)引物對(duì)米氏凱倫藻和多種對(duì)照藻種基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94°C變性45s，58°C退火 45s，72°C延伸45s，最后于72°C延伸10min，4°C保存。(5)電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照，檢驗(yàn) 條帶 結(jié)果是否具有專一性。結(jié)果可知，只有米氏凱倫藻有擴(kuò)增條帶，其他藻類均沒有擴(kuò)增。
權(quán)利要求
米氏凱倫藻鑒別方法，通過藻種培養(yǎng)、總DNA提取，其特征是利用Primer 5.0軟件對(duì)米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS區(qū)設(shè)計(jì)了專一性鑒定引物Ki1F3和Ki1B3，引物序列為Ki 1F3CAACTTGAATTCATTGTGAACC；Ki1B3ATGTGAATCAAACATGTGGT；基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，有擴(kuò)增條帶者為米氏凱倫藻。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的米氏凱倫藻鑒別方法，其特征是DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件 為95°C預(yù)變性5min后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94°C變性45s，58°C退火45s，72°C延 伸45s，最后于72°C延伸10min，4°C保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的米氏凱倫藻鑒別方法，其特征是PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂 糖凝膠上電泳來檢測(cè)擴(kuò)增特異性。
全文摘要
米氏凱倫藻鑒別方法，涉及藻類的特異性分子鑒定，需要解決的技術(shù)問題是提供米氏凱倫藻聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒定特異性引物，本發(fā)明通過藻種培養(yǎng)、總DNA提取，其特征是利用Primer 5.0軟件對(duì)米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS區(qū)設(shè)計(jì)了專一性鑒定引物Ki 1F3和Ki 1B3，引物序列為Ki 1F3CAACTTGAATTCATTGTGAACC；Ki1B3ATGTGAATCAAACATGTGGT；基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，米氏凱倫藻基因組DNA有擴(kuò)增條帶。本發(fā)明用于赤潮預(yù)防預(yù)測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101845483SQ20091004812
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2009年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月24日
發(fā)明者張凊漪, 張鳳英, 張永, 楊柯, 石彥紅, 蔣科技, 鄭俊斌, 馬凌波, 馬春艷 申請(qǐng)人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所