專利名稱：一種纖維堆囊菌生產(chǎn)埃坡霉素b的發(fā)酵方法及發(fā)酵培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種纖維堆囊菌生產(chǎn)埃坡霉素B的發(fā)酵方法及發(fā)酵培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
埃坡霉素B作為粘細(xì)菌纖維堆囊菌的次級代謝產(chǎn)物，是一種微管超穩(wěn)定的新型抗 腫瘤活性物質(zhì)。埃坡霉素B的作用機(jī)制與紫杉醇相同，但其在抗腫瘤譜、抗腫瘤活性、安全 性、水溶性及合成方法等方面均優(yōu)于紫杉醇，是一類前景廣闊的新型抗腫瘤藥物。為了進(jìn)行埃坡霉素的大規(guī)模生產(chǎn)，生物發(fā)酵是理想的途徑。埃坡霉素B —般由粘 細(xì)菌纖維堆囊菌Sorangium cellulosum 90發(fā)酵生產(chǎn)。專利W093/10121中報(bào)道，在含碳 源、氮源和無機(jī)鹽的介質(zhì)中培養(yǎng)纖維堆囊菌的菌株，并在培養(yǎng)過程中加入吸附性樹脂，可生 產(chǎn)得到低產(chǎn)量的埃坡霉素B。文獻(xiàn)《纖維堆囊菌的代謝產(chǎn)物及其生物學(xué)活性分析》(李越 中，微生物學(xué)報(bào)，2001，41 (6))，文獻(xiàn)《粘細(xì)菌纖維堆囊菌降解纖維素多酶復(fù)合體的確證和性 質(zhì)分析》(侯配斌，博士畢業(yè)論文，山東大學(xué))，以及文獻(xiàn)《Mutation and ahigh-throughput screening method for improving the production of Epothilonesof Sorangium》 (Guo-li Gong, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2007,34 :615_623)均報(bào)道，使用 M26 培養(yǎng)基 發(fā)酵粘細(xì)菌纖維堆囊菌，也可獲得低產(chǎn)量的埃坡霉素B。盡管使用M26培養(yǎng)基發(fā)酵粘細(xì)菌纖維堆囊菌可以生產(chǎn)埃坡霉素B，但產(chǎn)量較低；若 采用誘變篩選，又由于粘細(xì)菌纖維堆囊菌難以培養(yǎng)，誘變篩選難度又很大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供了一種纖維堆囊菌發(fā)酵培養(yǎng)基，其用于發(fā)酵培 養(yǎng)纖維堆囊菌制備埃坡霉素B時(shí)，菌株性能穩(wěn)定，生長快速，產(chǎn)品埃坡霉素B的產(chǎn)量明顯提 高。本發(fā)明還提供了一種纖維堆囊菌生產(chǎn)埃坡霉素B的發(fā)酵方法。本發(fā)明提供了一種纖維堆囊菌發(fā)酵培養(yǎng)基，其包括碳源、氮源、無機(jī)鹽、大孔吸附 樹脂和水，還包括氨基酸。其中，所述的氨基酸較佳的選自賴氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸。其中，所述的氨基酸的含量較佳的為0. l_500mg/L，更佳的為1-lOmg/L。其中，所述的纖維堆囊菌發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值較佳的為3-9，更佳的為5-8。其中，所述的纖維堆囊菌較佳的為Sorangium cellulosum 90。其中，所述的碳源為本領(lǐng)域常規(guī)使用的碳源，較佳的為0. 2_2襯％的土豆淀粉或玉 米淀粉或麥芽糊精或土豆糊精，以及0.的葡萄糖。其中，所述的氮源為本領(lǐng)域常規(guī)使用的氮源，較佳的為0. 05-0. 5wt %的大豆蛋白 胨或胰胨，以及0.的酵母膏。其中，所述的無機(jī)鹽為本領(lǐng)域常規(guī)使用的無機(jī)鹽，較佳的為0. 05-0. 5wt %的 MgS04 '7H20,0. 05-0.CaCl2 *2H20,以及0. 5_5ml/L的微量元素液。所述的微量元素 液為本領(lǐng)域常規(guī)使用的微量元素液，較佳的參考Reichenbach H. , Dworkin M.等人的《TheMyxobacteria. The Prokaryote》(2nded. 1992. 3418-3487)中相關(guān)內(nèi)容配制，標(biāo)準(zhǔn)微量元 素液(1L 體系):MnCl2 4H20 lOOmg, CoCl2 20mg, CuS04 lOmg, Na2Mo04 2H20 lOmg, ZnCl2 20mg, LiCl 5mg, SnCl2 2H20 5mg, H3B03 lOmg, KBr 20mg, KI 20mg, EDTANa_Fe3+8g0其中，所述的大孔吸附樹脂較佳的為非極性大孔吸附樹脂，鑒于其用于發(fā)酵，為使 之不易破碎，考慮其機(jī)械強(qiáng)度，更佳的選擇使用XAD-16大孔吸附樹脂。其中，所述的大孔吸附樹脂的用量較佳的為體積百分比2%。其中，所述的水較佳的為去離子水；所述水的用量較佳的為補(bǔ)足質(zhì)量百分比 100%。其中，更佳地，碳源、氮源、無機(jī)鹽和大孔吸附樹脂的優(yōu)選組合為M26培養(yǎng)基，即指 0. 8wt%土豆淀粉、0. 2wt%大豆蛋白胨、0. 2界卞％葡萄糖、0. 2界1%酵母膏、0. lwt%MgS04 *7H20、 0. lwt% CaCl2 2H20、lml/L微量元素液和2% (V V)的XAD-16大孔吸附樹脂。本發(fā)明的纖維堆囊菌發(fā)酵培養(yǎng)基由下述方法制得將上述成分簡單均勻混合，用 水補(bǔ)足含量至質(zhì)量百分比100%，按照本領(lǐng)域常規(guī)方式殺菌消毒，即可。本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基特別適合纖維堆囊菌的發(fā)酵培養(yǎng)，本發(fā)明還提供了一種纖維 堆囊菌生產(chǎn)埃坡霉素B的發(fā)酵方法，其步驟包括在本發(fā)明的纖維堆囊菌發(fā)酵培養(yǎng)基中接 種纖維堆囊菌，培養(yǎng)，生產(chǎn)埃坡霉素B。其中，所述的纖維堆囊菌較佳的為Sorangium cellulosum 90。其中，所述的纖維堆囊菌的接種量為本領(lǐng)域常規(guī)使用接種量，較佳的為 5% -50%，更佳的為10% -30%，百分比為質(zhì)量百分比。其中，所述的培養(yǎng)的溫度較佳的為20_40°C，更佳的為25-30°C。其中，所述的培養(yǎng)的pH值較佳的為3-9，更佳的為5-8。其中，所述的接種使用的種子為經(jīng)過二級培養(yǎng)的本領(lǐng)域常規(guī)使用的粘細(xì)菌纖維 堆囊菌種子。其中，所述的二級培養(yǎng)為本領(lǐng)域常規(guī)方法培養(yǎng)，包括斜面菌種培養(yǎng)和種子培 養(yǎng)。所述的斜面菌種培養(yǎng)為現(xiàn)有技術(shù)常規(guī)方法培養(yǎng)，即使用VY/2斜面培養(yǎng)基在30°C條件 下，培養(yǎng)箱培養(yǎng)3-7天。所述的種子培養(yǎng)為現(xiàn)有技術(shù)常規(guī)方法培養(yǎng)，即使用M7種子培養(yǎng)基， 30°C、200rpm 培養(yǎng) 2-5 天。所述的 VY/2 培養(yǎng)基含有鮮酵母 0. 5wt% ；CaCl2 2H20 0. lwt% ； VB120. 00005wt%;瓊脂1. 5wt%;ffi 3mol/L的K0H調(diào)pH至7. 2。所述的M7種子培養(yǎng)基含有 蛋白胨 0. 3wt% ；胰胨 0. 3wt% ；淀粉 0. 5wt% ；葡萄糖 0. 2wt% ；酵母膏 0. lwt% ;MgS04 7H20 0. lwt% ；CaCl2 2H20 0. lwt% ；VB120. 00001wt% ；用 3mol/L 的 K0H 調(diào) pH 至 7. 2。本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。本發(fā)明中，上述的各技術(shù)特征的優(yōu)選條件可以任意組合，得到較佳的技術(shù)方案用
于生產(chǎn)高產(chǎn)量的發(fā)酵埃坡霉素B。本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于本發(fā)明提供了一種纖維堆囊菌發(fā)酵培養(yǎng)基及其生產(chǎn) 埃坡霉素B的發(fā)酵方法。使用本發(fā)明纖維堆囊菌發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株時(shí)，菌株性能穩(wěn)定，生 長快速，制備埃坡霉素B相較于使用常規(guī)發(fā)酵培養(yǎng)基M26，在制備埃坡霉素B時(shí)的產(chǎn)量明顯 提高50-100%，效果顯著。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。實(shí)施例中的百分比，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分比。實(shí)施例1-4表1給出了本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基實(shí)施例1 4的配方，按表1中所列組分及其含 量(百分比均為質(zhì)量百分比)簡單混合均勻，用去離子水補(bǔ)足含量至質(zhì)量百分比100%，殺 菌消毒，即制得各發(fā)酵培養(yǎng)基。其中，微量元素液配制(1L體系):MnCl2 4H20 lOOmg, CoCl220mg, CuS0410mg, Na2Mo04 2H20 lOmg, ZnCl220mg, LiCl 5mg, SnCl2 2H205mg, H3B03 lOmg, KBr 20mg, KI 20mg, EDTA Na-Fe3+8g。
實(shí)施例5粘細(xì)菌纖維堆囊菌種子美國菌種保藏中心ATCC購買，保存號為ATCC15384，種子 的保存狀態(tài)為甘油管保存或凍干管保存均可。微量元素液配制(1L體系):MnCl2 4H20 lOOmg, CoCl220mg, CuS0410mg, Na2Mo04 2H20 lOmg, ZnCl2 20mg, LiCl 5mg, SnCl2 2H20 5mg, H3B03 lOmg, KBr 20mg, KI 20mg, EDTANa-Fe3+8g。
1、孢子培養(yǎng)將粘細(xì)菌纖維堆囊菌接到VY/2固體斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)上培養(yǎng)5-7天， 待形成成片擴(kuò)散狀菌落，作為種子使用。VY/2培養(yǎng)基組成成分為0. 5襯％鮮酵母、0. lwt% CaCl2 2H20、0. 5mg/L VB12、1. 5wt%瓊月旨，用 KOH 調(diào) pH 至 7. 2，121°C滅菌 20min。2、種子培養(yǎng)i、用接種針在長好的粘細(xì)菌纖維堆囊菌VY/2斜面上刮取少許菌落接到M7液體 種子培養(yǎng)基中，裝瓶量為20ml/250ml，30°C、200rpm搖床培養(yǎng)5-7天。M7培養(yǎng)基組成成分 為0. 3襯％蛋白胨、0. 3wt%胰胨、0. 5wt%淀粉、0. 2 丨％葡萄糖、0.母膏、0. lwt% MgS04 7H20、0. lwt% CaCl2 H20、0. 00001wt% VB12，用 KOH 調(diào) pH 至 7. 2，121°C 滅菌 20min。ii、按20wt%的接種量取培養(yǎng)好的M7種子重新接到新的M7種子培養(yǎng)基中，裝瓶 量為80ml/500ml，3(TC、200rpm搖床培養(yǎng)2-4天。M7培養(yǎng)基組成成分為0. 3 丨％蛋白胨、 0. 胨、0. 5wt%淀粉、0. 2界卞％葡萄糖、0.母膏、0. lwt% MgS04 7H20、0. lwt% CaC12 .2H20、0. 00001wt% VB12，用 KOH 調(diào) pH 至 7. 2，加入 10-15 顆玻璃珠，121°C滅菌 20min。3、發(fā)酵培養(yǎng)按20wt%的接種量取培養(yǎng)好的M7種子接到本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基中， 裝瓶量為20ml/250ml，30°C、200rpm搖床培養(yǎng)7天。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分為0. 8wt%土豆 淀粉、0. 2wt%大豆蛋白胨、0. 2界卞％葡萄糖、0. 2界1%酵母膏、0. lwt% MgS04 7H20、0. lwt% CaCl2 d^OUml/L微量元素液、2% (V V)的 XAD-16 樹脂、2-lOmg/L賴氨酸；pH值為 7. 0。結(jié)果分析培養(yǎng)7天后，收集發(fā)酵液中的樹脂，用甲醇浸泡2小時(shí)，取浸泡液進(jìn)行 HPLC分析埃坡霉素B的產(chǎn)量，如下表所示。其中HPLC條件為柱型Hypersil BDS C18 5um 4. 6mmXI50mm、流動相為乙腈水=50 50、流速為lml/min、檢測波長250nm、柱溫30°C。 實(shí)施例6除使用的發(fā)酵培養(yǎng)基以外，孢子培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、以及結(jié)果分析的操作步驟和條件 同實(shí)施例5。其中，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分為0. 8wt%土豆淀粉、0. 2wt%大豆蛋白胨、0. 2wt% 葡萄糖、0. 2界1%酵母膏、0. lwt% MgS04 7H20、0. lwt% CaCl2 2H20、lml/L 微量元素液、2% (V V)的XAD-16樹脂和2-10mg/L蘇氨酸；pH值為7. 0。結(jié)果分析埃坡霉素B的產(chǎn)量如下表所示 實(shí)施例7除使用的發(fā)酵培養(yǎng)基以外，孢子培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、以及結(jié)果分析的操作步驟和條件 同實(shí)施例5。其中，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分為0. 8wt%土豆淀粉、0. 2wt%大豆蛋白胨、0. 2wt% 葡萄糖、0. 2界1%酵母膏、0. lwt% MgS04 7H20、0. lwt% CaCl2 2H20、lml/L 微量元素液、2% (V V)的XAD-16樹脂、2-10mg/L甲硫氨酸；pH值為7. 0。結(jié)果分析埃坡霉素B的產(chǎn)量如下表所示 實(shí)施例8除使用的埃坡霉素B發(fā)酵培養(yǎng)的溫度條件為25-30°C以外，孢子培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、 以及結(jié)果分析的操作步驟和條件同實(shí)施例5，其中發(fā)酵培養(yǎng)基中的氨基酸含量為賴氨酸 8mg/L。結(jié)果分析埃坡霉素B的產(chǎn)量如下表所示 實(shí)施例9除使用的埃坡霉素B發(fā)酵培養(yǎng)的pH條件為3-9以外，孢子培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、以及結(jié) 果分析的操作步驟和條件同實(shí)施例5，其中發(fā)酵培養(yǎng)基中的氨基酸含量為賴氨酸8mg/L。結(jié)果分析埃坡霉素B的產(chǎn)量如下表所示 實(shí)施例10 孢子培養(yǎng)和種子培養(yǎng)的操作步驟和條件同實(shí)施例1。按20%的接種量取培養(yǎng)好 的M7種子接到本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝瓶量為20ml/250ml，30°C、200rpm搖床培養(yǎng)7天。 發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分為0. 2wt%玉米淀粉、0. 05wt%胰胨、1襯％葡萄糖、1襯％酵母膏、0. 05wt% MgS04 7H20、0. 05wt% CaCl2 2H20、5ml/L 微量元素液、2% (V V)的 XAD-16 樹 脂、10mg/L賴氨酸。培養(yǎng)7天后，收集發(fā)酵液中的樹脂，用甲醇浸泡2小時(shí)，提取埃坡霉素 B，即可。實(shí)施例11孢子培養(yǎng)和種子培養(yǎng)的操作步驟和條件同實(shí)施例1。按20%的接種量取培養(yǎng)好 的M7種子接到本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝瓶量為20ml/250ml，30°C、200rpm搖床培養(yǎng)7天。 發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分為2wt%麥芽糊精、0. 5wt%大豆蛋白胨、0. 1襯％葡萄糖、0. lwt% 酵母膏、0. 5wt% MgS04 7H20、0. 5wt% CaCl2 2H20、0. 5ml/L 微量元素液、2% (V V)的 XAD-16樹脂、10mg/L賴氨酸。培養(yǎng)7天后，收集發(fā)酵液中的樹脂，用甲醇浸泡2小時(shí)，提取 埃坡霉素B，即可。由上述實(shí)施例的分析結(jié)果表明當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中含有氨基酸時(shí)，發(fā)酵所得的菌體 量和埃坡霉素B顯著增多，其產(chǎn)量至少比不含有氨基酸時(shí)提高50 %，效果顯著。
權(quán)利要求
一種纖維堆囊菌發(fā)酵培養(yǎng)基，其包括碳源、氮源、無機(jī)鹽、大孔吸附樹脂和水，其特征在于其還包括氨基酸。
2.如權(quán)利要求1所述的纖維堆囊菌發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述的氨基酸選自賴氨 酸、蘇氨酸和甲硫氨酸。
3.如權(quán)利要求1所述的纖維堆囊菌發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述的氨基酸的含量為 0. l-500mg/L。
4.如權(quán)利要求3所述的纖維堆囊菌發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述的氨基酸的含量 l-10mg/L。
5.如權(quán)利要求1所述的纖維堆囊菌發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述的纖維堆囊菌為 Sorangium cellulosum 90。
6.如權(quán)利要求1所述的纖維堆囊菌發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述的纖維堆囊菌發(fā)酵 培養(yǎng)基的PH值為3-9。
7.如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的纖維堆囊菌發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述的碳 源為0. 2-2襯％的選自土豆淀粉、玉米淀粉、麥芽糊精和土豆糊精中的一種或多種，以及 0. I-Iwt%的葡萄糖；所述的氮源為0. 05-0. 5wt%的大豆蛋白胨或胰胨，以及0. I-Iwt %的 酵母膏；所述的無機(jī)鹽為 0. 05-0. 5wt%^ MgSO4 · 7Η20，0· 05-0. 5wt%^ CaCl2 · 2H20,以及 0. 5-5ml/L的微量元素液；所述的大孔吸附樹脂為體積百分比為2%的XAD-16大孔吸附樹 脂；所述的水的含量為補(bǔ)足質(zhì)量百分比100%。
8.如權(quán)利要求7所述的纖維堆囊菌發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述的標(biāo)準(zhǔn)微量元素液， 其 IL 體系含有:MnCl2 · 4H20 IOOmg, CoCl2 20mg, CuSO4IOmg, Na2MoO4 · 2H20 IOmg, ZnCl2 20mg, LiCl 5mg, SnCl2 · 2H20 5mg, H3BO3 IOmg, KBr 20mg, KI 20mg,以及 EDTA Na_Fe3+8g0
9.一種纖維堆囊菌發(fā)酵生產(chǎn)埃坡霉素B的發(fā)酵方法，其步驟包括在如權(quán)利要求1所 述的纖維堆囊菌發(fā)酵培養(yǎng)基中接種纖維堆囊菌，培養(yǎng)，生產(chǎn)埃坡霉素B。
10.如權(quán)利要求9所述的發(fā)酵方法，其特征在于所述的纖維堆囊菌的接種量為 5-50%，百分比為質(zhì)量百分比；所述的培養(yǎng)的溫度為20-40°C ；所述的培養(yǎng)的pH值為3_9。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種纖維堆囊菌發(fā)酵培養(yǎng)基，其包括碳源、氮源、無機(jī)鹽、大孔吸附樹脂和水，其還含有氨基酸。其用于發(fā)酵培養(yǎng)纖維堆囊菌制備埃坡霉素B時(shí)，菌株性能穩(wěn)定，生長快速，產(chǎn)品埃坡霉素B的產(chǎn)量明顯提高。本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的纖維堆囊菌發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)纖維堆囊菌生產(chǎn)埃坡霉素B的發(fā)酵方法。
文檔編號C12R1/01GK101851591SQ200910048789
公開日2010年10月6日 申請日期2009年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月3日
發(fā)明者田剛, 陳少欣 申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院