專利名稱：：Rna和dna雙外參實(shí)時(shí)定量熒光pcr檢測(cè)方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物信息學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種RNA和DNA雙外參實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：自從1970年克里克提出分子生物學(xué)的中心法則以來(lái)，人們對(duì)于基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)和及其調(diào)控的機(jī)制進(jìn)行了大量的研究。Northern雜交方法是最早被用來(lái)測(cè)定基因轉(zhuǎn)錄量的方法。后來(lái)，結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生的RT-PCR(reversetranscription-PCR，即逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))提供了一種靈敏而又簡(jiǎn)便的半定量測(cè)定方法。近年來(lái)，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(簡(jiǎn)稱為qPCR)方法由于其靈敏、準(zhǔn)確和重復(fù)性好，因此逐步成為基因表達(dá)的定量測(cè)定的主要方法。所有上述方法的檢測(cè)原理是將待測(cè)基因的轉(zhuǎn)錄水平表示為與一個(gè)參考(內(nèi)參或外參)基因的相對(duì)表達(dá)量。因此為了減少由于RNA不穩(wěn)定和逆轉(zhuǎn)錄的效率問題產(chǎn)生的誤差，通常采用內(nèi)參或者用相同量的總RNA來(lái)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。內(nèi)參通常選用一些看家基因，如e-actin、GAPDH以及rRNA等。然而，眾所周知，由于對(duì)不同組織而言，細(xì)胞的總RNA含量和/或內(nèi)參的量并不相同，即便同一組織在不同條件下它們也不一定相同，而且這種以總RNA中的含量和/或相對(duì)于一個(gè)內(nèi)參的比例的表示方法顯示不出一個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平。由于上述原因，待測(cè)基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)數(shù)據(jù)往往不準(zhǔn)確。因此，如何檢測(cè)出真實(shí)可靠的基因轉(zhuǎn)錄水平是目前亟待解決的技術(shù)問題。此外，還有利用外源的RNA在實(shí)時(shí)定量PCR中進(jìn)行跟蹤標(biāo)定(spike-inqPCR)的方法，此方法結(jié)合絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以產(chǎn)生更加可靠的結(jié)果?，F(xiàn)有技術(shù)中雖然已經(jīng)有人使用了跟蹤標(biāo)定策略，但沒有能夠?qū)⒁粋€(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平與它的基因的拷貝數(shù)聯(lián)系起來(lái)。
發(fā)明內(nèi)容為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種RNA和DNA雙外參實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)方法。所述檢測(cè)方法通過同時(shí)測(cè)定待測(cè)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的拷貝數(shù)和待測(cè)基因的拷貝數(shù)以及參考基因(包括外參mRNA和外參DNA)的拷貝數(shù)來(lái)檢測(cè)待測(cè)基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)方法。通過檢測(cè)待測(cè)基因在某個(gè)時(shí)刻，某個(gè)細(xì)胞狀態(tài)下的mRNA和DNA的比值，即mRNA/DNA的值來(lái)確定待測(cè)基因在某細(xì)胞狀態(tài)下的表觀表達(dá)水平。本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種RNA和DNA雙外參實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)方法，包括如下步驟1)配制外參基因的mRNA與外參基因的DNA的預(yù)混合液；2)將待測(cè)樣品與步驟l)中制備的預(yù)混合液混合，分別抽提并且收集總mRNA部分和總DNA部分；3)總mRNA部分進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA鏈后與總DNA部分分別進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光PCR，然后計(jì)算擴(kuò)增后待測(cè)基因的mRNA和DNA以及外參基因的mRNA和DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物的拷貝數(shù)。上述步驟l)中的外參基因?yàn)楸粶y(cè)樣品中不存在的序列，同時(shí)該外參基因的mRNA與外參基因的DNA中均不含有待測(cè)基因的mRNA和DNA序列。常用外參基因的選擇現(xiàn)在己經(jīng)有多種生物的全基因組已經(jīng)測(cè)序完成，在已經(jīng)測(cè)出的序列中，可以選擇被測(cè)樣品中不存在的序列做外參。通常遺傳進(jìn)化上相差遠(yuǎn)的生物之間(例如植物與動(dòng)物之間，原核與真核之間)比較容易找到這種序列?？梢赃x擇天然存在并且滿足上述要求的序列作為外參基因，或者人工合成一個(gè)滿足上述要求的人為設(shè)定的序列作為外參。優(yōu)選的，所述外參基因的DNA為攜帶外參基因DNA序列的重組載體；所述外參基因的mRNA是以上述線性化的攜帶外參基因DNA序列的重組載體為模板，通過體外轉(zhuǎn)錄制得的mRNA。上述載體為質(zhì)粒或桿狀病毒DNA(bacmid)。優(yōu)選的，所述步驟1)中的外參基因的mRNA的序列長(zhǎng)度與待測(cè)基因的mRNA的序列長(zhǎng)度相近，外參基因的DNA的序列長(zhǎng)度與待測(cè)基因的DNA的序列長(zhǎng)度相近。上述步驟2)中RNA與DNA的預(yù)混合液中，mRNA拷貝數(shù)與DNA拷貝數(shù)的比值的范圍應(yīng)當(dāng)不受限制，根據(jù)實(shí)施例中對(duì)家蠶基因轉(zhuǎn)錄的測(cè)定，中等水平表達(dá)在50~5000:1。因此，預(yù)混合液中，mRNA拷貝數(shù)與DNA拷貝數(shù)的比值優(yōu)選為100:1。上述步驟3)中的cDNA的制備過程為將外參基因的mRNA裝入T7體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，4再用T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄制得，其他常用于體外轉(zhuǎn)錄的酶還有SP6和T3RNA聚合酶。上述步驟3)中對(duì)同一基因的mRNA與DNA使用相同的引物分別進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光PCR擴(kuò)增。上述步驟3)中實(shí)時(shí)定量熒光PCR中的引物按照實(shí)時(shí)定量熒光PCR的常規(guī)要求進(jìn)行設(shè)計(jì)并合成，具體要求為要求引物退火溫度盡量相同，擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度盡量接近，擴(kuò)增產(chǎn)物的GC含量盡量接近，且每對(duì)引物應(yīng)當(dāng)是位于同一個(gè)外顯子中。同時(shí)由于本發(fā)明中需要同時(shí)對(duì)mRNA與DNA進(jìn)行擴(kuò)增，同一基因的mRNA與DNA使用相同的引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光PCR擴(kuò)增可以消除由于引物不同和擴(kuò)增片段不同帶來(lái)的誤差?？梢愿鶕?jù)上述規(guī)則使用引物設(shè)計(jì)軟件(例如clonemanager)進(jìn)行設(shè)計(jì)。上述步驟3)中的實(shí)時(shí)定量熒光PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度范圍一般為100bp~300bp，同一批測(cè)定要求長(zhǎng)度盡量接近，這里在由軟件設(shè)計(jì)時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度規(guī)定為140bp160bp。優(yōu)選的，所述RNA和DNA雙外參實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)方法還包括根據(jù)如下公式計(jì)算待測(cè)基因的表觀表達(dá)水平-.待測(cè)基因mRNA的拷貝數(shù)外參基因mRNA的拷貝數(shù)外參基因mRNA的初始含量待測(cè)基因的表觀表達(dá)水平=-待測(cè)基因DNA的拷貝數(shù)'外參基因DNA的拷貝數(shù)外參基因DNA的初始含量本發(fā)明的檢測(cè)方法通過引入外參基因的mRNA和外參基因的DNA分別對(duì)待測(cè)樣品中待測(cè)基因的mRNA(轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)和DNA(基因)進(jìn)行標(biāo)定，通過外參基因的mRNA的初始拷貝數(shù)與外參基因的DNA的初始拷貝數(shù)之間的比值最終測(cè)出在該樣品中待測(cè)基因的mRNA的初始拷貝數(shù)與待測(cè)基因的DNA的初始拷貝數(shù)之間的比值，并且使用該比值來(lái)表征這個(gè)基因的表達(dá)水平?？紤]到各基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的壽命是不一樣的，有些基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物半衰期很短，在檢測(cè)過程中可能有些轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物己經(jīng)水解消亡，因此將使用本發(fā)明的方法測(cè)得的基因轉(zhuǎn)錄水平稱為"表觀轉(zhuǎn)錄水平"。本發(fā)明的方法使用了mRNA和DNA雙外參來(lái)分別對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和基因進(jìn)行跟蹤標(biāo)定，是一種雙跟蹤標(biāo)定技術(shù)(daul-spike-intechnique)。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供所述的RNA和DNA雙外參實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)方法在芯片(包括cDNA芯片和寡核苷酸芯片)檢測(cè)基因表達(dá)和基因拷貝數(shù)變異中的應(yīng)用，包括如下步驟1)選定外參基因，在基因芯片上設(shè)計(jì)針對(duì)該外參基因的探針；2)配制外參基因的mRNA與DNA的預(yù)混合液；3)在抽提樣品中加入步驟2)中制得的預(yù)混合液，分別收集樣品中的總mRNA和DNA部分；4)mRNA和DNA分別進(jìn)行表達(dá)譜芯片檢測(cè)流程和拷貝數(shù)變異芯片(tilingarrayplatform)檢測(cè)流程，得到各基因的mRNA和DNA以及外參基因的mRNA和DNA的拷貝數(shù)變化情況；5)根據(jù)如下原理進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和歸一化，最終計(jì)算待測(cè)基因的轉(zhuǎn)錄水平行、，甚^|的表^宇丄+水平-待測(cè)基因mRNA的拷貝數(shù)外參基因mRNA的拷貝數(shù)外參基因mRNA的初始含量待測(cè)基因DNA的拷貝數(shù)t外參基因DNA的拷貝數(shù)X外參基因DNA的初始含量所述步驟l)中的外參基因可以為l個(gè)或多個(gè)。目前，正在廣泛使用的芯片技術(shù)實(shí)際上與實(shí)時(shí)定量PCR采用同樣的方法來(lái)進(jìn)行數(shù)據(jù)的歸一化的。從用看家基因歸一化和總RNA歸一化，再到跟蹤標(biāo)定。因此本發(fā)明的方法可以擴(kuò)展到高通量測(cè)定的平臺(tái)，即用RNA外參跟蹤標(biāo)定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，用DNA外參跟蹤標(biāo)定基因拷貝數(shù)，這樣可以將mRNA水平與基因拷貝數(shù)聯(lián)系起來(lái)?；蛐酒卸恈DNA芯片和寡核苷酸芯片。最近更有用寡核苷酸探針如屋頂上蓋瓦片一樣交叉重疊起來(lái)組成了一種嵌合芯片(tilingarrayplatform)技術(shù)，這種嵌合芯片既能分析基因表達(dá)譜又能夠分析基因拷貝數(shù)的變化，是一種很好的工具。在用上述二類基因芯片技術(shù)分析基因表達(dá)譜時(shí)使用木發(fā)明的方法同樣可以將mRNA水平與基因拷貝數(shù)聯(lián)系起來(lái)。當(dāng)mRNA水平與基因拷貝數(shù)聯(lián)系起來(lái)后，同一基因的表達(dá)水平在不同組織之間可以進(jìn)行比較，在同一組織不同條件下可以進(jìn)行比較；不同基因之間也可以進(jìn)行比較；同一批的實(shí)驗(yàn)可以進(jìn)行比較，不同批的實(shí)驗(yàn)也可以進(jìn)行比較。因此，本發(fā)明的方法可以為基因表達(dá)數(shù)據(jù)和基因拷貝數(shù)據(jù)的整合提供新的概念和框架。木發(fā)明極大地改進(jìn)了對(duì)基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，使得人們可以得到某個(gè)基因的真實(shí)的轉(zhuǎn)錄水平而不是一個(gè)相對(duì)水平。此策略對(duì)于芯片分析以及芯片數(shù)據(jù)的整合同樣適用。本發(fā)明采用RNA和DNA雙外參分別跟蹤標(biāo)定樣品中的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和基因的拷貝數(shù)，使基因的轉(zhuǎn)錄水平能夠與每個(gè)基因聯(lián)系起來(lái)。本發(fā)明的方法是不依賴樣品，可以廣泛使用，并且能夠得到更具有生物學(xué)意義的數(shù)據(jù)的技術(shù)。根據(jù)實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，那些看家基因，如GAPDH和A3實(shí)際上在各組織中是差異表達(dá)的，然而它們以前卻經(jīng)常被用作內(nèi)參，因此使用看家基因作內(nèi)參的數(shù)據(jù)也許是不準(zhǔn)確的，可能需要重新進(jìn)行檢測(cè)。圖l質(zhì)粒pPigT.7的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2質(zhì)粒FFa2A3IFP2的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3bacmidAcA3IFP2的結(jié)構(gòu)示意圖。圖4IFP2DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖5Cyp6AB4在家蠶各組織中的表觀轉(zhuǎn)錄水平圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法及未說(shuō)明配方的試劑均為按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆試驗(yàn)手冊(cè)(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件或者制造商建議的條件進(jìn)行或配置。實(shí)施例11.實(shí)驗(yàn)蠶的處理實(shí)驗(yàn)蠶54A的卵由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蠶業(yè)研究所提供，催青、孵化后用人工飼料在25'C飼養(yǎng)。幼蟲長(zhǎng)到5齡第3天解剖，取中部絲腺、后部絲腺、脂肪體、馬氏管和中腸，重蒸水洗3次后-70'C保存。2.RNA和DNA外參的選擇p/ggy^"c轉(zhuǎn)座子在鱗翅目細(xì)胞系TN-368中發(fā)現(xiàn)的，它由2個(gè)轉(zhuǎn)座臂和一個(gè)轉(zhuǎn)座酶IFP2的編碼序列組成。由于IFP2不存在于家蠶中，因此選擇IFP2作為本實(shí)施例的外參。3.檢測(cè)RNA和DNA外參的比值質(zhì)粒pPigT.7是將T7-IFP2表達(dá)框插入載體pUC19中制得，質(zhì)粒pPigT.7(4983bp)的結(jié)構(gòu)圖見圖1。使用限制性內(nèi)切酶HindIII將質(zhì)粒pPigT.7線性化，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳純化后，用ThermoNanoDropl000Spectrophotometer(GeneCompanyLtd)儀器通過紫外吸收定量。以上述線性化的pPigT7為模板，使用T7RNA聚合酶通過體外轉(zhuǎn)錄制備外參RNA，即IFP2mRNA。其具體制備過程如下總反應(yīng)體積為20pl。反應(yīng)體系中含有2pi50mM的DTT(Dithiothreitol，二硫蘇糖醇)，pPigT7模板1.2嗎，4種NTP各2.5mM，10x反應(yīng)緩沖液2pl，20單位RNA酶抑制劑和50單位T7RNA聚合酶，37'C下保溫1小時(shí)。產(chǎn)物經(jīng)DNaseI處理后用CsCl(氯化銫)超離心純化，用ThermoNanoDrop1000Spectrophotometer(GeneCompanyLtd)儀器通過紫外吸收定量。最后用DEPC—H20將制備好的IFP2mRNA稀釋成濃度為lng/pl(即7.605xl08拷貝4tl)的溶液。考慮到細(xì)胞DNA抽提液中的DNA片段的長(zhǎng)度通常比質(zhì)粒DNA大許多，為避免DNA抽提液中DNA中其他片段的干擾所產(chǎn)生的不必要的誤差，因?yàn)橥鈪⒒虻膍RNA和DNA分別對(duì)待測(cè)基因的mRNA和DNA進(jìn)行跟蹤標(biāo)定，因此要求與被跟蹤的mRNA和DNA在各種處理過程(酒精沉淀，RNA的反轉(zhuǎn)錄，用于芯片測(cè)定時(shí)的DNA隨機(jī)引物延伸等)中的行為一致。因此本實(shí)施例選用含IFP2的bacmidAcA3IFP2(~134kb)(結(jié)構(gòu)參見圖2)來(lái)作為外參DNA。含IFP2的bacmidAcA3IFP2的制備方法為將質(zhì)粒FFa2A3IFP2(是將A3-IFP2表達(dá)框插入載體pFFa2中制得，其結(jié)構(gòu)圖見圖2)轉(zhuǎn)入bacmidAcAEGT得到bacmidAcA3IFP2(結(jié)構(gòu)如圖3所示)。通過實(shí)時(shí)定量PCR方法，以HindIII線性化的pPigT7為標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)AcA3IFP2的濃度，具體檢測(cè)方法如下實(shí)時(shí)定量PCR用SYBRPremixExTaqkit(TakaRaBiotechnology(Dalian)Co.Ltd.)在95t:下變性1min,然后在95°C5sec,55°C10sec,72°C10sec循環(huán)50次，然后收集熒光信號(hào)。熒光數(shù)據(jù)收集的溫度77"C。檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，經(jīng)過計(jì)算可知AcA3IFP2DNA外參的濃度為9.341xl06拷貝/pl。將等體積的外參IFP2mRNA和AcA3IFP2混合，2pl混合液中含DNA外參9.341xl06拷貝，RNA外參7.605xl()S拷貝，二者之比為1:81.4。將它們加到lOOmg家蠶組織勻漿液中，與細(xì)胞基因組DNA的拷貝數(shù)(~108)大致是相匹配的。4.待測(cè)樣品處理依產(chǎn)品說(shuō)明書用TRNzol-A+TotalRNA試劑(TiangenBiotechCo.,LTDBeijing,China)分別抽提家蠶各組織的總mRNA和DNA，具體步驟如下將待檢測(cè)組織研磨后將1ml抽提液加到100mg組織樣品中，同時(shí)加2|xlIFP2snRNA和AcA3IFP2的預(yù)混合液，使之充分混合，裂解細(xì)胞并且溶解細(xì)胞內(nèi)含物。在12,000rpm的轉(zhuǎn)速下離心15min，分別收集RNA和DNA部分?？俁NA部分用DNaseI處理后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成第一條cDNA鏈。具體反應(yīng)為在20^總反應(yīng)體系中含有4pi5x反應(yīng)緩沖液，1|_ig總RNA,4種dNTP各0.5mM，25單位8RNasin(核酸酶抑制劑)，150nM(dN)6，2pi10nMoligo(dT15)及200單位M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/pi;TaKaRa)。5.實(shí)時(shí)定量PCR引物檢測(cè)為減少由不同引物和擴(kuò)增片段帶來(lái)的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)誤差，本實(shí)施例中對(duì)同一基因測(cè)定其mRNA和DNA的拷貝數(shù)時(shí)采ffl相同的引物對(duì)，并設(shè)計(jì)在問一外顯子屮。擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度在144bp到152bp之間。針對(duì)FibH、FibL、Ser-l、Cyp6AB4、A3、GAPDH、28SrRNA和IFP2的引物見表1。表l實(shí)時(shí)定量PCR引物<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實(shí)時(shí)定量PCR的條件如下實(shí)時(shí)定量PCR用SYBRPremixExTaqkit(TakaRaBiotechnology(Dalian)Co.Ltd.)在95。C下變性1min,然后在95°C5sec,55°C10sec,72°C10sec循環(huán)50次，然后收集熒光信號(hào)。熒光數(shù)據(jù)收集的溫度依據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物而定(具體溫度參見表l)。6、實(shí)時(shí)定量PCR效率分析對(duì)于每一個(gè)基因的'a'值通過實(shí)時(shí)定量PCR的DNA模板和RNA模板的稀釋曲線來(lái)測(cè)定。取W值趨向于1的最大值得到直線方程C(T)=axlg(c叩y)+b,這里斜率'a'給出每一個(gè)基因的PCR的效率。結(jié)果表明不同基因的PCR擴(kuò)增效率稍有不同(見表2)。這些'a'值可以用于RNA與DNA比值的計(jì)算。表2每個(gè)基因的qPCR效率<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>7、實(shí)吋定量PCR檢測(cè)的數(shù)據(jù)處理和歸一化通過檢測(cè)某個(gè)基因在某個(gè)細(xì)胞狀態(tài)下的raRNA和DNA的比值，即mRNA/DNA的值來(lái)確定在某細(xì)胞狀態(tài)下每個(gè)拷貝的基因的表觀轉(zhuǎn)錄量。本實(shí)施例中通過檢測(cè)組織或者樣品中待測(cè)基因的mRNA的拷貝數(shù)與待測(cè)基因DNA的拷貝數(shù)之比來(lái)判斷待測(cè)基因在該組織或者樣品中在特定時(shí)間范圍內(nèi)的表達(dá)水平，即上述的"表觀表達(dá)水平"。本實(shí)施例的檢測(cè)過程如下在用實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定了每個(gè)基因的mRNA和DNA水平后，計(jì)算這個(gè)基因的mRNA與DNA之比，并用實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定的外參基因的mRNA與DNA之比進(jìn)行歸一化，再乘以預(yù)混合液中外參基因的mRNA與DNA之比(81.4)進(jìn)行歸一化。其中，第一步歸一化的目的是用于去除諸如酒精沉淀、逆轉(zhuǎn)錄效率和PCR等技術(shù)上的問題；第二步歸一化的目的是用于去除RNA和DNA樣品處理過程帶來(lái)的差別。通過上述兩步歸一化，可以準(zhǔn)確地計(jì)算出某組織中的待測(cè)基因在某個(gè)條件下，每個(gè)拷貝的表達(dá)水平。計(jì)算公式如下PCR擴(kuò)增時(shí)樣品中初始拷貝數(shù)越高，則熒光信號(hào)強(qiáng)度超過閾值(T)時(shí)的擴(kuò)增圈數(shù)C(T)就越??；C(T)值與初始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系C(T)=axlg(copy)+b,a和b分別是直線方程的斜率和截距。根據(jù)數(shù)學(xué)運(yùn)算lg(c叩yl/copy2)^C(T)！-C(T)2)+a.C(T)=axlg(copy)+b，C(T)產(chǎn)axlg(copy!)+b........................................................................(1)C(T)2=axlg(COpy2)+b........................................................................(2)(1)式一(2)式可得C(T)廠C(T)2=ax(lgcopy「lgcopy2)所以可得lg(c叩y,/c叩y2)=[QTh-C(T)2]+a即第一步歸一待測(cè)翻的表觀表達(dá)水，待測(cè)基因m腿附頻數(shù)+外參基因mR輔拷貝數(shù);待測(cè)基因DNA的拷貝數(shù)夕卜參基因DNA的拷貝數(shù)第二步歸一行測(cè)某H的-恕ff表伏水平—待測(cè)基因mRNA的拷貝數(shù)外參基因mRNA的拷貝數(shù)外參基因mRNA的初始含量付"巷Utf、J衣人衣込JM—待測(cè)基因DNA的拷貝數(shù)7外參基因DNA的拷貝數(shù)X外參基因DNA的初始含量'由于IFP2基因的mRNA與IFP2基因的DNA的初始含量之比為81.4，因此經(jīng)過兩步歸一步驟后可知，^甘m^主加主i'+i亞—A3基因mRNA的拷貝數(shù).IFP2基因mRNA的拷貝數(shù)A堪因的表觀表達(dá)水干-A3基剛幽勺拷貝數(shù)-!FP堪剛NA附考貝數(shù)x81.4同時(shí)因?yàn)?<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>可得1n[(C(T)(A3/mRNA)_C(T)(A3/DNA))+aA3]八3基因的表觀表達(dá)水平=~^-^~Tx81.41ol_(C(T)(IFP2/mRNA)—C(T)(IFP2/DNA)卜a肝2jA3基因在后部絲腺測(cè)定結(jié)果計(jì)算步驟如下三次mRNA測(cè)定的C(T)值的平均為24.092，三次DNA測(cè)定的C(T)值的平均為32.947，A3基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)的a值是-3.1H7，lg(A3mRNA/A3DNA)=(24.092—32.947)+(-3.1147)=2.84297(A3mRN感3DNA)=102層=696.58外參IFP2在后部絲腺測(cè)定結(jié)果四次RNA測(cè)定的C(T)值的平均為23.337，六次DNA測(cè)定的C(T)值的平均為29.742，外參IFP2PCR擴(kuò)增反應(yīng)的a值是-3.6882，lg(IFP2RNA/IFP2DNA)=(23.337—29.742)+(-3.6882)=1.73662(IFP2RNA/IFP2DNA)=10173662=54.528A3基因在后部絲腺的表觀表達(dá)水平=696.58+54.528X81.4=1039.9實(shí)施例2檢測(cè)A3,GAPDH，28SrRNA在家蠶各組織中的表達(dá)使用實(shí)施例1中的檢測(cè)方法對(duì)A3,GAPDH，28SrDNA基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和基因以及外參IFP2mRNA和DNA在家蠶中部絲腺、后部絲腺、脂肪體、馬氏管和中腸抽提物中的拷貝數(shù)進(jìn)行了測(cè)定。A3，GAPDHand28SrDNA基因在這些組織中的每拷貝基因的表達(dá)量按上述方法計(jì)算出來(lái)。它們的表觀轉(zhuǎn)錄水平在不同組織間差別很大(如表3所示)。表3家蠶各組織中A3,GAPDHand28SrRNA基因的表觀轉(zhuǎn)錄水平<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明actin-3基因(即A3基因)的表觀轉(zhuǎn)錄水平與家蠶組織的生長(zhǎng)速度相一致，最高的是后部絲腺，接下來(lái)依次是脂肪體、馬氏管、中部絲腺和中腸。GAPDH的表觀轉(zhuǎn)錄水平反映了各組織的能量代謝的能力，而28SrDNA的表觀轉(zhuǎn)錄水平表示出各組織的蛋白質(zhì)合成能力。GAPDH的表達(dá)最高的是脂肪體，接著是后部絲腺、馬氏管、中腸和中部絲腺。28SrDNA的表達(dá)最高的也是脂肪體，接著是后部絲腺、中部絲腺、馬氏管和中腸。家蠶脂肪體的功能與高等動(dòng)物的肝臟類似，在能量代謝和蛋白質(zhì)合成上起著至關(guān)重要的作用，這能解釋GAPDH和28SrDNA基因在脂肪體中的表達(dá)特別高的結(jié)果。28SrDNA基因在后部絲腺和中部絲腺也相當(dāng)高，這與絲腺的這兩部分中高蛋白合成的相符。這個(gè)結(jié)果提示這些常被用作內(nèi)參的基因在測(cè)定組織專一性表達(dá)時(shí)用來(lái)歸一化其他基因的表達(dá)是不合適的。由于本實(shí)施例中計(jì)算的是每個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平，對(duì)于多拷貝基因，它的真實(shí)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物就要多得多。例如，在脂肪體中RNA與DNA之比對(duì)A3是538.69，對(duì)GAPDH是10475，對(duì)28SrRNA是97321。由于基因組中rDNA和核糖體蛋白基因有200-300拷貝，所以28SrRNA的量比A3和GAPDH的mRNA還要多得多。實(shí)施例3家蠶中絲素基因和絲膠l基因的表達(dá)的檢測(cè)檢測(cè)方法同實(shí)施例l。測(cè)定了家蠶各組織中絲素重鏈基因(FibH)、輕鏈基因和絲膠l基因的表觀轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示FibH和FibL專一地在后部絲腺表達(dá)，Ser-l專一地在中部絲腺表達(dá)。FibL在后部絲腺的表觀轉(zhuǎn)錄水平(192029士30739)與Ser-l在中部絲腺的表觀轉(zhuǎn)錄水平(196539土12455)相近，而FibH在后部絲腺的表觀轉(zhuǎn)錄水平(106453土13667)約是FibL的一半。如果將FibH和FibL在后部絲腺的表達(dá)以及Ser-l在中部絲腺的表達(dá)如以前常做的用A3,GAPDH或28SrRNA進(jìn)行歸一化，Ser-l在中部絲腺的表達(dá)比FibL在后部絲腺的表達(dá)要高得多。這是由于A3,GAPDH和28SrDNA基因在絲腺兩部分的表達(dá)不同之故。結(jié)果參見表4，表4中的結(jié)果證明一個(gè)基因的表觀轉(zhuǎn)錄水平比對(duì)看家基因的相對(duì)表達(dá)要可靠。表4表觀轉(zhuǎn)錄水平和相劉r測(cè)定的比較表達(dá)的基因和組織后部絲腺中FibH的表達(dá)后部絲腺中FibL的表達(dá)中部絲腺中Ser-l的表達(dá)表觀轉(zhuǎn)錄水平106453192029196539相對(duì)于A3的表達(dá)96,987174.951607.7相對(duì)于GAPDH的表達(dá)689.511243.818208相對(duì)于28SrRNA的表達(dá)*0.0393570.0709950.1103713*依每個(gè)基因組中有300拷貝28SrDNA計(jì)算。同樣，如上所述，F(xiàn)ibH和FibL在后部絲腺的表觀轉(zhuǎn)錄水平(106453和192029),Ser-l在中部絲腺的表觀轉(zhuǎn)錄水平(196539)都超過28SrDNA在絲腺的這二個(gè)部分中的表觀轉(zhuǎn)錄水平(后部絲腺9016.1,中部絲腺5935.5)。這與絲腺在5齡第3天大量合成絲素和絲膠相一致。考慮到基因組中rDNA有200-300拷貝，雖然FibH,FibL和Ser-l以每個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平高于28SrDNA，rRNA的總量還是比比這些基因的mRNA高許多，因而保證了蛋白合成系統(tǒng)的功能。實(shí)施例4細(xì)胞色素P450(Cyp6AB4)表達(dá)的組織專一性Cyp6AB4是近年克隆的一種家蠶細(xì)胞色素P450，然而其表達(dá)的組織專一性還不清楚。檢測(cè)方法同實(shí)施例1。檢測(cè)結(jié)果如圖5中所示，Cyp6AB4在各組織的表觀轉(zhuǎn)錄水平顯示Cyp6AB4主要在馬氏管和脂肪體中表達(dá)，在中腸和絲腺中不表達(dá)。本實(shí)施例用家蠶做模式系統(tǒng)來(lái)測(cè)定不同基因在各組織中的表觀轉(zhuǎn)錄水平。家蠶的基因表達(dá)明顯地在空間與時(shí)間上受到調(diào)控，例如絲素蛋白專一地在5齡家蠶的后部絲腺表達(dá)，而絲膠蛋白則在中部絲腺表達(dá)。這對(duì)于研究基因的組織專一性表達(dá)，并發(fā)展測(cè)定方法十分有利。同時(shí)，本實(shí)施例測(cè)定了家蠶幼蟲絲腺的不同部位、脂肪體、馬氏管、中腸中細(xì)胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白(cytoplasmicactin，A3)、甘油醛3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)、28S核糖體RNA(28SrRNA)的表觀轉(zhuǎn)錄水平。發(fā)現(xiàn)A3，GAPDH、28SrRNA這些常被用作內(nèi)參的基因在不同組織中的表達(dá)差別非常大，說(shuō)明采用本實(shí)施例的檢測(cè)方法是非常必要的。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)施例中測(cè)定了絲素重鏈蛋白基因(fibroinheavychain,FibH)和輕鏈蛋白基因(fibroinlightchain,FibL)、絲膠蛋白1基因(sericin-1,Ser-1)和細(xì)胞色素P450Cyp6AB4基因(cytochromeP450，Cyp6AB4)轉(zhuǎn)錄的組織專一性。實(shí)施例5RNA和DNA雙外參實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)方法應(yīng)用于嵌合芯片(tilingarrayplatform)技術(shù)平臺(tái)本實(shí)施例中，將該RNA和DNA雙外參實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)方法應(yīng)用于嵌合芯片(tilingarrayplatform)技術(shù)平臺(tái)，對(duì)表達(dá)譜和基因拷貝數(shù)進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)和整合分析。步驟如下1)選定外參基因，并且在tilingarray芯片上設(shè)計(jì)針對(duì)該外參基因的探針；2)制備外參基因的RNA與DNA，配制外參基因的RNA與DNA的預(yù)混合液；3)將預(yù)混合液混入組織樣本，分別收集總mRNA和DNA;4)tnRNA樣本用于表達(dá)譜檢測(cè)，得到樣本的基因表達(dá)情況以及外參基因的mRNA拷貝數(shù)；DNA樣本用于拷貝數(shù)變異(copynumbervariation,縮寫為CNV)檢測(cè)，得到樣本的DNA拷貝數(shù)以及外參基因的拷貝數(shù)情況；5)按照如下原理進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和歸一化，實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)數(shù)據(jù)與基因拷貝數(shù)據(jù)的整合，最終計(jì)算待測(cè)基因的轉(zhuǎn)錄水平-MS，.,jfct-y-待測(cè)基閔m咖A的拷貝數(shù).外參基因m咖A的拷貝數(shù)外參基因mRNA的初始含量、待測(cè)基因DNA的拷貝數(shù)t外參基因DNA的拷貝數(shù)X外參基因DNA的初始含量15序列表<110>上海生物信息研究中心<120>RNA和DNA雙外參檢測(cè)方法<130>090365<160>17<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>4983<212>DNA<213>重組質(zhì)粒gagacggtca60tcagcgggtg120ctgagagtgc180atcaggcgcc240tcttcgctat300acgccagggt360txactatagg420ctgattttga480cttttaagat540acttattata600tgttctttag660ggtgaggatt720gaagaagcgt780tcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccgcagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatc卿gc卿ttgtaaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtatttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattctaatacgacgcgccgcttggagctcgcgtgaggcgtgcttgtcaatgcggtaagtgtcaactatatcgaccgcgtgagtcaaaatgacgcatgattatcttttacgtgattaactcatacgataattatattgttatttcatgttctacttscgtgatatatatattttcttgttatagatatcgtgactaatatataataaaatgggaacgatgagcatatcctctctgctcttctgcaaggcgatgacgagcttgttctgacagtgaaatatcagatcacgtaagtgaagacgtccagagcgataca16ttat3gSLtgaaaaatgttsLtgccgagtctxttgtaa犯tgcatttcgtgacagtgaga犯tgtacgtctcccatagatgaacaagcc已a(bǔ)gtgat犯atgg犯tactacgt3C犯ttggttCC3ttgtggggctccaggcctcaacg已a(bǔ)agtgg3C3CgCtctatggcattgccat犯tgttttBCatgELgggt￡LCertg￡L￡ltgaetcaacc3tag8ggt83gtgceLctgaaccccacttttaagataaccactctctttatcacagttacttt犯gtatggaaatgccttatg卿g兆ttacacctcaatcaaccgtgcga郞tggg認(rèn)agccagct犯gagaccaaatgattgtacggac已gt已gc已已gcctgacgtcagtgtCgLgCCaggttcttcataataaacattattgtcagattgcttcaaacgagatatcatgatgaaatctatgtccacagctgtggatcgcccacacttccatcagtgcaggttU卿gataaaa&tccttgggs卿gtc犯3gcctgtcaaacaaactcgatgttttatggtatactccgcaagitggtgttctgtgatcgtttatgcacgtcaagcgtggcttctaagttggtcaacctca^agaggtattttttactg犯3cgtcgatgctttcttatgacctcttttttggatttgacggtgtcctcatgatgtggaacacagactgC3Cggt3gaaaac11actgcgagataccgttttgacggtattatcatcttatgtattatgsLCctgcagttgcctgcatttca^Lgtcggtaaccgtttcagaatcttgttc犯agtcctccgacgcgttgattgag3t3gg犯tct已tgtggtattctgtggatcgatctttgatacgatgtatttactcsctccaggggtttaggatgtgacagtggtttgtcgtaatacaag犯ccggg鄉(xiāng)tactgaccccttactttgtgatgagtaatcaaactt鄉(xiāng)a卿cgaaattc"ttttagaagctcctttagacgaacaccttgccac3cg鄉(xiāng)ggtaatgtgccgcaatttcgcaaaacaggtgctagtaatgacagtttgtcaatgtgtcttag犯cctgttagaagctcatttgatatatccc犯ccactcggtg3tt3Cgtgtg幼a犯cagtcctcgtctcatgatgcttcta犯aggcggeigaataggtggcattatatacaatgagaaaccactttgaags900960102010801140120012601320138014401500156016201680174018001860192019802040210021602220gatatttgcgcgataatatctctaatattttgccaaatgaagtgcctggtacalcagatg2280acagtactgaagagccagtaatgas犯aacgtacttactgtacttactgcccctctaa犯2340t犯ggcga犯ggcaaatgcatcgtgc犯aaaatgcs犯犯sgtteitttgtcg3g3gC￡Lt32400atattgatatgtgccaaagttgtttctgactgactaataagtatastttgtttctattat2460gtataagttaagctaattacttattttataatacaacatgactgtttttaaagtacaaaa2520taagtttatttttgtaaaagagagaatgtttaaaagttttgttactttagaagaaatttt2580gagtttttgtttttttttaataaata犯taaacataaataaattgtttgttgaatttatt2640attagtatgta3gtgt犯atatastaaaacttaatatctattcawttaat犯ataaacc2700tcg3tstac3g3ccg3as幼犯3犯saa犯a犯3犯3^a犯犯3gcttggcgt犯tcat2760ggtcatagctgtttcctgtgtga犯ttgttatccgctcacaattccacacaacatacgag2820ccggaagcataaagtgt犯agcctggggtgcctaatgagtgagct犯ctcacattaattg2880cgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa2940tcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctca3000ctgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcgg3060t犯tacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaa犯ggcc3120agcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcc3180cccctgacgagcatcacaaa犯tcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggac3240tataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccc3300tgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcata3360gctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgc3420acg肪ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggt朋ctatcgtcttgagtcca3480acccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagsg3540cgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacacta3600gaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaa犯gagttg366018gtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagc3720agcagattacgcgcsgaa犯a犯ggatctc犯gaagatcctttgatcttttctacggggt3780ctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaa3840ggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatct已a(bǔ)agtat3t3900atgagt犯acttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcga3960tctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatac4020gggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccgg4080ctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcsgaagtggtcctg4140caactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagtt4200cgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgct4260cgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgat4320cccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagta4380agttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtca4440tgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaat4500agtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccac4560atagcagaactttaa犯gtgctcatcattggaa犯cgttcttcggggcgaaaactctcaa4620ggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatctt4680cagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccg4740caaaaaagggaat犯gggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaat4800attattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacstatttgaatgtattt4860agaaa犯t8aacat犯taggggttccgcgcacatttccccgaa犯gtgccacctgacgtct4920aagaaaccattattatcatgacattaacctataa<aaataggcgtstcacgaggccctttc4980gtc4983<210>2<211>19<212>DNA<213>引物<400>2cggctactcgttcactacc19<210>3<211>19<212>DNA<213>引物<400>3ccgtcgggaagttcgtaag19<210>4<211>20<212>DNA<213>引物<400>4cggtaacgagtccattgtag20<210>5<211>20<212>DNA<213>引物<400>5<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><213>引物<400>9accgtcggtggatgttac<210>10<211>21<212>DNA<213>引物<400>10cccagtgctctgaatgtcaac<210>11<211〉22<212>DNA<213>引物<400>11agatagggacagtgggaatctc<210>12<211>18<212>DNA<213>引物<400>12ctgtgcacggtagttgtc<210>13說(shuō)明書第20/22頁(yè)18212222<211>20<212>DNA<213>引物<400>13tcagtacttccggtatctcg20<210>14<211>18<212>DNA<213>引物<400>14tgttgagggcttgatgac18<210>15<211>18<212>DNA<213>引物<400>15accttaccc3cagctttg18<210>16<211>20<212>DNA<213>引物<400>16cgcgtatttctatccaaggg2023<210>17<211>18<212>DNA<213>引物<400>17acatggcacgcaatttcc1g權(quán)利要求1.一種RNA和DNA雙外參實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)方法，包括如下步驟1)配制外參基因的mRNA與外參基因的DNA的預(yù)混合液；2)將待測(cè)樣品與步驟1)中制備的預(yù)混合液混合，分別抽提并且收集總mRNA和總DNA；3)總mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA鏈后與總DNA分別進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光PCR，然后計(jì)算擴(kuò)增后待測(cè)基因的mRNA和DNA的拷貝數(shù)以及外參基因的mRNA和DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物的拷貝數(shù)。2.如權(quán)利要求1所述的RNA和DNA雙外參實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟l)中的外參基因?yàn)楸粶y(cè)樣品中不存在的序列，同時(shí)該外參基因的mRNA與外參基因的DNA中均不含有待測(cè)基因的mRNA和DNA序列。3.如權(quán)利要求1所述的RNA和DNA雙外參實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述外參基因的DNA為包含外參基因的重組載體；所述外參基因的mRNA是以上述線性化的包含外參基因的重組載體為模板，通過體外轉(zhuǎn)錄制得的mRNA。4.如權(quán)利要求3所述的RNA和DNA雙外參實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述載體為質(zhì)?；驐U狀病毒。5.如權(quán)利要求1所述的RNA和DNA雙外參實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，對(duì)同一基因的mRNA與DNA使用相同的引物分別進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光PCR擴(kuò)增。6.權(quán)利要求1-7任一權(quán)利要求中所述的RNA和DNA雙外參實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，還包括根據(jù)如下公式計(jì)算待測(cè)基因的表觀表達(dá)水平.待測(cè)基因mRNA的拷貝數(shù)外參基因mRNA的拷貝數(shù)外參基因mRNA的初始含量待測(cè)基因的表觀表達(dá)水平=待測(cè)基因DNA的拷貝數(shù)'外參基醫(yī)1DNA的拷貝數(shù)外參基因DNA的初始含量7.權(quán)利要求6所述的RNA和DNA雙外參實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)方法在芯片分析基因表達(dá)和基因拷貝數(shù)變化中的應(yīng)用，其特征在于，步驟l)中的外參基因相應(yīng)的探針同時(shí)出現(xiàn)在用于表達(dá)譜檢測(cè)和基因拷貝數(shù)檢測(cè)的芯片中，可以為1個(gè)或多個(gè)。全文摘要本發(fā)明涉及生物信息學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種RNA和DNA雙外參實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)方法及其應(yīng)用，包括如下步驟選定外參基因；制備外參基因的mRNA與DNA，配制外參基因的mRNA與DNA的預(yù)混合液；在抽提樣品時(shí)加入預(yù)混合液，收集樣品中的總mRNA和DNA部分；實(shí)時(shí)定量熒光PCR，計(jì)算待測(cè)基因和外參基因mRNA和DNA的拷貝數(shù)；數(shù)據(jù)處理和歸一化。本發(fā)明還公開了上述方法在基因芯片分析基因表達(dá)技術(shù)中的應(yīng)用。本發(fā)明改進(jìn)了對(duì)基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可以得到某個(gè)基因的真實(shí)的轉(zhuǎn)錄水平而不是一個(gè)相對(duì)水平，為基因表達(dá)數(shù)據(jù)和基因拷貝數(shù)據(jù)的整合提供新的概念和框架。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101538611SQ20091004930公開日2009年9月23日申請(qǐng)日期2009年4月14日優(yōu)先權(quán)日2009年4月14日發(fā)明者李園園,陸長(zhǎng)德申請(qǐng)人:上海生物信息技術(shù)研究中心