專利名稱：生物轉(zhuǎn)化l-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇的方法，具 體地說涉及一種以十六(四)酸異丙酯為萃取劑的原位產(chǎn)物分離生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生 產(chǎn)2-苯乙醇的方法。
背景技術(shù)：
2-苯乙醇，又名β _苯乙醇，常溫下是無色透明的液體，天然存在于一些花和植物 比如玫瑰、茉莉等的精油中。2-苯乙醇具有的玫瑰香味深受人們歡迎，是所有玫瑰香型香氣 的基本組分，使其在食品、化妝品、日用品、煙草和藥品中有廣泛的應(yīng)用。天然2-苯乙醇一般直接從植物中直接提取，而目前廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)的則是化學 合成法，采用的原料是甲苯。1907年Ehrlich發(fā)現(xiàn)在一些酵母細胞中，L-苯丙氨酸通過轉(zhuǎn) 氨作用生成苯丙酮酸、再脫羧形成苯乙醛，苯乙醛經(jīng)氧化脫氫酶作用生成2-苯乙醇，這條 途徑后來以Ehrlich的名字命名(Ehrlich,Ber Dtsch Chem Ges 1907)。利用這條途徑通 過生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇是目前生物合成法制備2-苯乙醇的主要方法。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的2-苯乙醇對酵母細胞有一定的毒性，會抑制的酵母的生產(chǎn)， 同時，釀酒酵母在生長過程中積累的乙醇和2-苯乙醇的聯(lián)合作用比起單獨2-苯乙醇的毒 性要大得多，因此影響了生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇的產(chǎn)量。要解決這個問題， 一種方法是通過菌株改造來提高生產(chǎn)菌株對2-苯乙醇的耐受能力，另一種則是采用原位 產(chǎn)物分離的生物轉(zhuǎn)化方法，一般是采用添加萃取劑的兩相生物轉(zhuǎn)化，即是在生物轉(zhuǎn)化過程 中添加萃取劑形成油水兩相，產(chǎn)生的2-苯乙醇被不斷的萃取到有機相中，減小了水相中 2-苯乙醇的濃度，從而減少對菌株的毒性。因此不僅提高了產(chǎn)物2-苯乙醇的濃度，又可 以實現(xiàn)了產(chǎn)物的分離，簡化了生產(chǎn)中2-苯乙醇的分離提取步驟，目前報道較多的萃取劑是 油酸、油醇和聚丙二醇等。Stark等人以油酸作為萃取劑，采用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Giv 2009)進行兩相補料分批轉(zhuǎn)化，最終2_苯乙醇濃度可達到12. 6克/升 (Stark et al.，Biotechnol Prog2002)。Etschmann等人以油醇為萃取劑，以克魯維酵母 (Kluyveromyces marxianusCBS 600)為生產(chǎn)菌株，在搖瓶培養(yǎng)體系中加入50毫升水相培 養(yǎng)基和50毫升油醇，最終從9克/升L-苯丙氨酸獲得5. 6克/升2-苯乙醇，摩爾轉(zhuǎn)化率為 84% (Etschmannet al.，J Mol Catal B :Enzymatic，2004)。雖然這些工藝明顯的提高了 2-苯乙醇的產(chǎn)量，但萃取劑的加入也給產(chǎn)物的分離提取帶來了一定的困難，尤其是油酸，在 高溫減壓蒸餾過程中會與2-苯乙醇發(fā)生酯化反應(yīng)，給2-苯乙醇的提取帶來較大困難，影響 了其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對目前生物法生產(chǎn)2-苯乙醇的過程中，產(chǎn)物對微生物細胞 的毒性以及產(chǎn)物濃度較低、而使用油酸的原位產(chǎn)物分離生物轉(zhuǎn)化方法產(chǎn)物提取困難等問 題，提供了一種以十六(四)酸異丙酯為萃取劑的原位產(chǎn)物分離生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇的方法。本發(fā)明使用釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae P-3CCTCC M 209035 菌株進行 生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇時，添加十六酸異丙酯或者十四酸異丙酯作為萃取劑 進行原位產(chǎn)物分離生物轉(zhuǎn)化以提高產(chǎn)物的濃度，其步驟如下 (1)斜面培養(yǎng)將 Saccharomyces cerevisiae P-3CCTCC M 209035 菌株接種到固 體斜面培養(yǎng)基上，在35 °C條件下，靜置培養(yǎng)24小時；(2)制備種子培養(yǎng)液用步驟(1)所得的斜面培養(yǎng)物，刮取一環(huán)菌體接種到液體種 子培養(yǎng)基中，在35°C條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)24小時，制得種子培養(yǎng)液；(3)生物轉(zhuǎn)化使用步驟(2)所得的種子培養(yǎng)液，以6% (體積比)的接種量接種 MPK培養(yǎng)基，35°C條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)。在生物轉(zhuǎn)化開始0 10小時加入十六酸 異丙酯或十四酸異丙酯，加入量為體積比1 1 1 10(油水)。在上述以十六(四)酸異丙酯為萃取劑的原位產(chǎn)物分離生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生 產(chǎn)2-苯乙醇的方法中，種子培養(yǎng)使用的液體種子培養(yǎng)基配方為1升蒸餾水中含葡萄糖20 克，酵母粉2. 5克，蛋白胨2. 5克，氯化鈉5克。固體斜面培養(yǎng)基配方為在液體種子培養(yǎng)基 基礎(chǔ)上添加質(zhì)量體積比1. 6%的瓊脂。在上述以十六(四)酸異丙酯為萃取劑的原位產(chǎn)物分離生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生 產(chǎn)2-苯乙醇的方法中，MPK培養(yǎng)基配方為1升蒸餾水中含糖蜜30克，L-苯丙氨酸7克，磷 酸二氫鉀0.5克。本發(fā)明的優(yōu)點是使用以十六(四)酸異丙酯為萃取劑的原位產(chǎn)物分離生物轉(zhuǎn)化 L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇的方法，不僅有效解決了 2-苯乙醇對酵母細胞的毒性問題，提高 了 2-苯乙醇產(chǎn)量，也簡化了產(chǎn)物的分離提取步驟，降低了 2-苯乙醇的提取難度，可以較好 的代替目前應(yīng)用較多的油酸或油醇。本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，該方法可應(yīng)用于2-苯乙醇 的生物法生產(chǎn)，具有很大的應(yīng)用前景。
具體實施例方式實施例一在利用Saccharomyces cerevisiae P-3CCTCC M 209035 菌株生物轉(zhuǎn)化 L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇的過程中，不添加萃取劑直接進行生物轉(zhuǎn)化。其詳細步驟如下(1)斜面培養(yǎng)將 Saccharomyces cerevisiae P-3CCTCC M 209035 接種到固體斜 面培養(yǎng)基上，在35 °C條件下，靜置培養(yǎng)24小時；(2)制備種子培養(yǎng)液用步驟(1)所得的斜面培養(yǎng)物，刮取一環(huán)菌體接種到液體種 子培養(yǎng)基中，在35°C條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)24小時，制得種子培養(yǎng)液；(3)生物轉(zhuǎn)化使用步驟(2)所得的種子培養(yǎng)液，以6% (體積比)的接種量接種 到MPK培養(yǎng)基中，35°C條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)。40小時后發(fā)酵液中2-苯乙醇濃度 為3.4克/升。在上述的生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇的方法中，種子培養(yǎng)使用的液體種 子培養(yǎng)基配方為1升蒸餾水中含葡萄糖20克，酵母粉2. 5克，蛋白胨2. 5克，氯化鈉5克。 固體斜面培養(yǎng)基配方為在液體種子培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加質(zhì)量體積比1. 6%的瓊脂。在上述的生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇的方法中，MPK培養(yǎng)基配方為1升 蒸餾水中含糖蜜30克，L-苯丙氨酸7克，磷酸二氫鉀0. 5克。
實施例二在利用Saccharomyces cerevisiae P-3CCTCC M 209035 菌株以十六 (四)酸異丙酯為萃取劑的原位產(chǎn)物分離生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇的過程中，在 生物轉(zhuǎn)化開始后加入萃取劑十六酸異丙酯或十四酸異丙酯。其詳細步驟如下(1)斜面培養(yǎng)將 Saccharomyces cerevisiae P-3CCTCC M 209035 接種到固體斜 面培養(yǎng)基上，在35 °C條件下，靜置培養(yǎng)24小時；(2)制備種子培養(yǎng)液用步驟(1)所得的斜面培養(yǎng)物，刮取一環(huán)菌體接種到液體種 子培養(yǎng)基中，在35°C條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)24小時，制得種子培養(yǎng)液；(3)生物轉(zhuǎn)化使用步驟(2)所得的種子培養(yǎng)液，以6% (體積比)的接種量接種 MPK培養(yǎng)基，35°C條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)。在生物轉(zhuǎn)化開始0小時加入十六酸異丙酯 或十四酸異丙酯，加入量為體積比1 10(油水)。40小時后水相2-苯乙醇濃度為3. 7 克/升，有機相2-苯乙醇濃度為14. 18克/升。在上述的生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇的方法中，種子培養(yǎng)使用的液體種 子培養(yǎng)基配方為1升蒸餾水中含葡萄糖20克，酵母粉2. 5克，蛋白胨2. 5克，氯化鈉5克。 115°C條件下滅菌20分鐘。固體斜面培養(yǎng)基配方為在液體種子培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加質(zhì)量體積 比1.6%的瓊脂。在上述的生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇的方法中，MPK培養(yǎng)基配方為1升 蒸餾水中含糖蜜30克，L-苯丙氨酸7克，磷酸二氫鉀0. 5克。115°C條件下滅菌20分鐘。實施例三與上述實施例二的步驟及培養(yǎng)基成分相同，所不同的只是步驟(3)中加入萃取劑 十六酸異丙酯，加入量為體積比1 5(油水)。40小時后水相2-苯乙醇濃度為3. 09克 /升，有機相2-苯乙醇濃度為11克/升。實施例四與上述實施例二的步驟及培養(yǎng)基成分相同，所不同的只是步驟(3)加入萃取劑 十六酸異丙酯，加入量為體積比1 3(油水)。40小時后水相2-苯乙醇濃度為2. 6克 /升，有機相2-苯乙醇濃度為8. 86克/升。實施例五與上述實施例二的步驟及培養(yǎng)基成分相同，所不同的只是步驟(3)加入萃取劑 十六酸異丙酯，加入量為體積比1 2(油水)。40小時后水相2-苯乙醇濃度為1.93克 /升，有機相2-苯乙醇濃度為6. 3克/升。實施例六與上述實施例二的步驟及培養(yǎng)基成分相同，所不同的只是步驟(3)加入萃取劑 十六酸異丙酯，加入量為體積比1 1 (油水)。40小時后水相2-苯乙醇濃度為1. 31克 /升，有機相2-苯乙醇濃度為4. 58克/升。
實施例七與上述實施例二的步驟及培養(yǎng)基成分相同，所不同的只是步驟(3)在生物轉(zhuǎn)化開 始4小時加入萃取劑十六酸異丙酯，加入量為體積比1 2(油水)。40小時后水相2-苯 乙醇濃度為1. 8克/升，有機相2-苯乙醇濃度為6. 15克/升。實施例八
與上述實施例二的步驟及培養(yǎng)基成分相同，所不同的只是步驟(3)在生物轉(zhuǎn)化開始8小時加入萃取劑十六酸異丙酯，加入量為體積比1 2(油水)。40小時后水相2-苯 乙醇濃度為1. 95克/升，有機相2-苯乙醇濃度為6. 1克/升。實施例九與上述實施例二的步驟及培養(yǎng)基成分相同，所不同的只是步驟(3)在生物轉(zhuǎn)化開 始10小時加入萃取劑十六酸異丙酯，加入量為體積比1 2(油水)。40小時后水相2-苯 乙醇濃度為2克/升，有機相2-苯乙醇濃度為5. 88克/升。實施例十與上述實施例二的步驟及培養(yǎng)基成分相同，所不同的只是步驟(3)加入的萃取劑 為十四酸異丙酯，加入量為體積比1 1(油水)。40小時后水相2-苯乙醇濃度為1.25 克/升，有機相2-苯乙醇濃度為4. 49克/升。
權(quán)利要求
一種生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇的方法，其特征在于使用釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae P-3CCTCC M 209035菌株進行生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇時，添加萃取劑進行原位產(chǎn)物分離生物轉(zhuǎn)化，所添加的萃取劑為十六酸異丙酯或者十四酸異丙酯，其步驟如下(1)斜面培養(yǎng)將釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae P-3CCTCC M 209035菌株接種到固體斜面培養(yǎng)基上，在35℃條件下，靜置培養(yǎng)24小時；(2)制備種子培養(yǎng)液用步驟(1)所得的斜面培養(yǎng)物，刮取一環(huán)菌體接種到液體種子培養(yǎng)基中，在35℃條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)24小時，制得種子培養(yǎng)液；(3)生物轉(zhuǎn)化使用步驟(2)所得的種子培養(yǎng)液，以體積比6％的接種量接種MPK培養(yǎng)基，35℃條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)，在生物轉(zhuǎn)化開始后添加萃取劑十六酸異丙酯或十四酸異丙酯。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇的方法，其特征在于其 中步驟(2)種子培養(yǎng)使用的液體種子培養(yǎng)基配方為1升蒸餾水中含葡萄糖20克，酵母粉 2. 5克，蛋白胨2. 5克，氯化鈉5克。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇的方法，其特征在 于其中步驟(1)固體斜面培養(yǎng)基配方為在液體種子培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加質(zhì)量體積比1.6%的 瓊脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇的方法，其特征在于其 中步驟(3)添加萃取劑的時間為生物轉(zhuǎn)化開始后0 10小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇的方法，其特征在于其 中步驟(3)添加萃取劑的量為體積比油水1 1 1 10。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇的方法，其特征在于其 中步驟(3)MPK培養(yǎng)基配方為1升蒸餾水中含糖蜜30克，L-苯丙氨酸7克，磷酸二氫鉀0. 5 克。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇的方法，以十六(四)酸異丙酯為萃取劑的原位產(chǎn)物分離生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇。在使用釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae P-3CCTCC M 209035菌株生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇的過程中，添加十六(四)酸異丙酯作為萃取劑進行原位產(chǎn)物分離生物轉(zhuǎn)化，可代替目前常用的萃取劑油酸或者油醇，降低產(chǎn)物2-苯乙醇對細胞的毒性，簡化了產(chǎn)物的分離提取步驟，降低了2-苯乙醇的提取難度，有利于2-苯乙醇的分離提取，提高產(chǎn)物產(chǎn)量。
文檔編號C12P7/22GK101864456SQ20091004956
公開日2010年10月20日 申請日期2009年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月17日
發(fā)明者華棟梁, 張兆斌, 杜毅, 甘霖, 許平, 魏中浩 申請人:上海凱信生物科技有限公司