專利名稱：microRNA-21在鑒別胰腺癌中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，是一種將血中的microRNA作為標(biāo)志物，鑒 別胰腺癌的方法。
背景技術(shù)：
microRNA最早發(fā)現(xiàn)于1993年，是一種小的、非編碼蛋白質(zhì)的單鏈RNA，由18 25 個(gè)核苷酸組成。microRNA通過與mRNA3’非翻譯區(qū)(3’ UTR)結(jié)合，使得靶mRNA降解或抑制 其翻譯，實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能。經(jīng)過20多年艱苦卓絕的努力，科學(xué)家對microRNA研究取得了 突破性進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)其在動(dòng)物、植物和病毒中普遍存在，且在許多生命活動(dòng)中起著非常重要的 作用。根據(jù)最新的microRNA數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計(jì)(miRBase Registry 13. 0)，人體已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 706 種microRNA。microRNA具有高度的保守性、時(shí)序性和組織特異性。近來研究表明，某些microRNA在細(xì)胞的分化發(fā)育中起著重要的作用，提示其與腫 瘤的發(fā)生密切相關(guān)。通過特定的分子生物學(xué)技術(shù)(包括=Northern印記雜交、實(shí)時(shí)定量PCR， 上調(diào)或下調(diào)特定microRNA的表達(dá)等)，人們發(fā)現(xiàn)microRNA表達(dá)量的變化與很多腫瘤密切相 關(guān)，如肺癌、乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌、白血病等。功能學(xué)研究顯示micr0RNA可能與癌基因或 抑癌基因起著同樣的作用。超過50%的microRNA基因位于腫瘤相關(guān)的基因組區(qū)域或者不 穩(wěn)定區(qū)域，這種現(xiàn)象提示，microRNA在部分腫瘤的發(fā)生過程中起著重要的作用。胰腺癌為消化道常見腫瘤，居全身惡性腫瘤第7位，其侵襲性強(qiáng)，惡性度高，手術(shù) 切除率低，預(yù)后極差，死亡率接近100%。且其起病隱匿，缺乏典型臨床癥狀，早期診斷難 度極大，成為目前國內(nèi)外腫瘤專家的研究熱點(diǎn)。有報(bào)道同正常組織及慢性胰腺炎組織相 比，microRNA在胰腺癌組織中的表達(dá)譜有顯著變化(Bloomston M, Frankel WL, Petrocca F, Volinia S, Aider H, Hagan JP, Liu CG, Bhatt D, Taccioli C, Croce CM. 2007May 2 ； 297(17) 1901-8. LeeEJ,Gusev Y,Jiang J,Nuovo GJ,Lerner MR,Frankel WL,Morgan DL, PostierRG, Brackett DJ, Schmittgen TD.Int J Cancer. 2007Marl ； 120 (5) 1046-54.) {0 目前臨床上胰腺組織標(biāo)本的獲取較為困難，如超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)下穿刺、CT引導(dǎo)下穿刺等方法 獲取胰腺組織標(biāo)本成功率低，費(fèi)用高，痛苦大，并發(fā)癥多，患者耐受性差。近來有多篇文章 報(bào)道，病變組織中mi croRNA的異常變化可以在血清中有所反映。(Mitchell PS, Parkin RK, Kroh EM, Fritz BR, Wyman SK, Pogosova-Agadjanyan EL, Peterson A, Noteboom J, O' Briant KC, Allen A, Lin Dff, Urban N, Drescher Cff, Knudsen BS, Stirewalt DL, Gentleman R, Vessella RL, Nelson PS, Martin DB, Tewari M. Proc Natl Acad Sci USA. 2008 Jul 29 ； 105 (30) 10513-8. Wang K, Zhang S, Marzolf B, Troisch P, Brightman A, Hu Z, Hood LE, Galas DJ. Proc Natl Acad Sci USA. 2009Mar 17 ；106(11) :4402_7·)。 利用檢測血清中的microRNA表達(dá)水平，是一種沒有創(chuàng)傷、價(jià)格低廉的方法，患者容易接受， 但至今未見有關(guān)利用檢測血清中的microRNA-21表達(dá)水平來鑒別胰腺癌的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
胰腺癌往往是在慢性胰腺炎基礎(chǔ)上發(fā)生的，本發(fā)明提供一種通過檢測血清中 microRNA-21的表達(dá)水平鑒別胰腺癌、慢性胰腺炎或正常胰腺的方法。本發(fā)明方法如下1.通過大樣本檢測，制作胰腺癌、慢性胰腺炎及正常人血漿中MicroRNA-21的表 達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)圖譜1)制備總 RNA 取胰腺癌患者、慢性胰腺炎患者和正常人血液樣本各若干例，將各例血液樣本分 別進(jìn)行離心，取血漿，將人工合成的micr0RNA(Cel-miR-39)分別加入各血漿作為參照物， 用美國 Molecular Research Center 公司的 TRI REAGENT BD(cat. no. TB 126)按常規(guī)抽提 總RNA，并檢測各例胰腺癌、慢性胰腺炎及正常人樣本中的總RNA濃度。2)microRNA-21表達(dá)豐度的測定使用Applied Biosys terns 公司的 microRNA 檢測試劑盒(TaciMan MicroRNAAssay, P/N =4373090)，以及熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，分別檢測胰腺癌、慢性胰腺炎 及正常人血漿中mi croRNA-21的表達(dá)豐度值(Ct值)，用Ct 21表示。并用同樣的方法測 得加入的參照物Cel-miR-39的Ct值Ct 39。3)制作胰腺癌、慢性胰腺炎及正常人血漿中MicroRNA-21的表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)圖譜將各例所得Ct 39值減去Ct 21值，即得標(biāo)準(zhǔn)化后的表達(dá)豐度值(Δ Ct)。用胰腺 癌、慢性胰腺炎和正常人microRNA-21各組分別得到的表達(dá)豐度值Δ Ct，制作胰腺癌、慢性 胰腺炎及正常人血漿中MicroRNA-21的表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)圖譜。2.鑒別胰腺癌、慢性胰腺炎及正常胰腺的方法按以上方法檢測未知血漿標(biāo)本中的microRNA-21表達(dá)豐度值A(chǔ)Ct，對照上述 MicroRNA-21的表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)圖譜，如果落入胰腺癌組microRNA-21的范圍內(nèi)，則將其歸為胰 腺癌，如果落入慢性胰腺炎或正常胰腺組的的范圍內(nèi)，則基本排除胰腺癌。本發(fā)明方法具有檢測方便、敏感性好、準(zhǔn)確率高等特點(diǎn)。


圖1為胰腺癌、慢性胰腺炎及正常人血漿中MicroRNA-21的表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)圖譜圖2為實(shí)施例1的診斷試驗(yàn)評價(jià)圖，圖中，胰腺癌血漿中MicroRNA-21表達(dá)水平列 為一組，慢性胰腺炎及正常人MicroRNA-21表達(dá)水平列為一組。
具體實(shí)施例方式現(xiàn)結(jié)合附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明作詳細(xì)描述。實(shí)施例1制作胰腺癌、慢性胰腺炎及正常人血漿中MicroRNA-21的表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)圖譜1.血漿采集選取31例胰腺癌、14例慢性胰腺炎及10例正常人個(gè)體，每例取Iml全血，在2小 時(shí)內(nèi)分別于常溫下依次進(jìn)行1200gX 10分鐘，15000g X 10分鐘離心，取血漿。2.血漿中RNA抽提每例個(gè)體取50μ1 血漿，力卩入 750 μ 1 TRI REAGENT BD (MolecularResearchCenter公司)和20 μ 1 5Ν醋酸，混勻后加入5 μ 1濃度為50pmol/L的 Cel-miR-39,震蕩混勻，室溫下靜置5分鐘，加入200 μ 1氯仿，震蕩混勻，室溫下靜置5分 鐘，4°C，12000g離心15min，提取上清液，加入4 μ 1 DNA mate (TAKARA公司),后加入與上 清液等體積的異丙醇混勻，-20°C靜置20min，4°C，12000g離心15min，去上清，向沉淀中加 入lml75%乙醇清洗沉淀，4°C，7500g離心洗滌沉淀5min。去上清，將沉淀室溫晾干后加入 40 μ IRNa se-free的水充分溶解，測定所得RNA的濃度。3. RT-PCR 反應(yīng)使用Applied Biosystems公司的Taqman microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒對提取的RNA進(jìn) 行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。15 μ 1反應(yīng)體系中包括2μ 1提取的RNA，0. 15 μ 1的dNTPs (0. 25mM)，1 μ 1 的反轉(zhuǎn)錄酶(3. 33U/y 1，Ρ/Ν =4319983, AppliedBiosystems),0. 19 μ 1 的 RNase 抑制劑 (0. 25U/y 1，Ρ/Ν :Ν8080119 ；AppliedBiosystems)，1· 5μ 1 IOXRT buffer (Ρ/Ν =4319981, Applied Biosystems),7. 16 μ 1 RNase-free /K, 3 μ 1 stem-loop RT primer(50ηΜ)。使 用AppliedBiosystems公司9700熱循環(huán)儀進(jìn)行16°C 30分鐘，42°C 30分鐘，85°C 5分鐘的 反轉(zhuǎn)錄。對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，取5 μ 1作為實(shí)時(shí)定量PCR的模板，使用Applied Biosystems 公司的 TaqMan Universal PCR Master Mix 試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR 鑒定。PCR 反應(yīng)在 Applied Biosystems 7900HT 序列檢測系統(tǒng)(P/N :4329002，Applied Biosystems) 中進(jìn)行。PCR 反應(yīng)體系為 20μ 1，包括 5μ 1 RT 產(chǎn)物，IOul 10Χ TaqMan Universal PCR Master Mix (Ρ/Ν =4324018, Applied Biosystems)，1 μ 1 TaqMan 探針(0. 2mM)， 4ylRNaSe-free水。將所有的反應(yīng)體系首先進(jìn)行95°C 10分鐘的預(yù)熱，然后進(jìn)行每循環(huán) 950C 15秒，60°C 1分鐘，共50循環(huán)的PCR反應(yīng)。所有的反應(yīng)重復(fù)三次，每次取固定的閾值， 三次測定中最少的Ct值作為該樣本Ct值。4.實(shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理用上述方法先檢測各例樣本的MicroRNA-21的Ct值(Ct21)及參照物Cel-miR-39 的Ct值(Ct 39)，將所得Ct 39值減去Ct 21值，即得標(biāo)準(zhǔn)化后的表達(dá)豐度值(Δ Ct)。5. MicroRNA-21表達(dá)豐度值(Δ Ct)范圍的確定通過實(shí)時(shí)定量PCR獲得所有樣本microRNA-21的Δ Ct值，見表1，表1. 55例樣本(胰腺癌、慢性胰腺炎、正常人)MicroRNA-21的Δ Ct值 進(jìn)行方差分析，可見組間差異顯著(ρ = 0. 009)，然后使用LSD法進(jìn)行組間兩兩比 較，可見胰腺癌與慢性胰腺炎，胰腺癌與正常人間差異顯著(P值分別為0. 034和0. 006)，而 慢性胰腺炎同正常人間沒有差異(P = 0. 400)，見圖1初步判定mi croRNA-21可以作為胰腺疾病良惡性的判定。然后進(jìn)行ROC分析，AUC下面積為0. 719，診斷準(zhǔn)確度為中等，取診斷界值為ACt = -1. 518，其鑒別胰腺疾病良 惡性的敏感性為71%，特異性為62. 5%，見圖2。
權(quán)利要求
MicroRNA-21在鑒別胰腺癌中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，是一種將血中的microRNA作為標(biāo)志物，鑒別胰腺癌的方法。本發(fā)明通過大樣本調(diào)查檢測，制作胰腺癌、慢性胰腺炎及正常人血漿中MicroRNA-21的表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)圖譜，再將未知血漿標(biāo)本中的microRNA-21表達(dá)豐度值ΔCt，對照上述MicroRNA-21的表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)圖譜，如果落入胰腺癌組microRNA的范圍內(nèi)，則將其歸為胰腺癌，如果落入慢性胰腺炎或正常人組的的范圍內(nèi)，則基本排除胰腺癌。本發(fā)明方法具有檢測方便、準(zhǔn)確率高等特點(diǎn)。
文檔編號C12Q1/68GK101880707SQ20091005057
公開日2010年11月10日 申請日期2009年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月5日
發(fā)明者孔祥毓, 李兆申, 杜奕奇, 林寒, 王國坤, 荊清, 高軍 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)