專利名稱：一種選育生產(chǎn)達(dá)托霉素的玫瑰孢鏈霉菌菌株的篩選方法及其所得菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于菌種的選育技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種選育生產(chǎn)達(dá)托霉素的玫瑰孢鏈霉 菌菌株的篩選方法及其所得到的菌株。
背景技術(shù)：
隨著抗生素在臨床上的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌耐藥性問題日趨嚴(yán)重，耐甲氧西林金黃色 葡萄球菌(MRSA)、耐萬古霉素腸球菌(VRE)呈驚人上升趨勢(shì)。20世紀(jì)80年代MRSA感染已 占金黃色葡萄球菌感染的20% 50%。美國疾病控制與防治中心報(bào)道，從1989年到1998 年，院內(nèi)感染的耐萬古霉素腸球菌的人數(shù)從0. 3%升至21. 2%。由于MRSA具有毒性強(qiáng)、多 重高度耐藥、傳播快的特點(diǎn)，一旦發(fā)生感染，迅速在院內(nèi)傳播，病情難以控制。即使用萬古霉 素治療，死亡率依然達(dá)10% 50%。因此，一些發(fā)達(dá)國家已將MRSA感染與烈性傳染病同等 對(duì)待。如何克服MRSA和VRE已成為抗生素工作者的研究熱點(diǎn)。目前能有效治療MRSA感染的藥物有糖肽類抗生素萬古霉素和脂肽類抗生素達(dá)托 霉素(Daptomycin)等。達(dá)托霉素是新的脂肽類抗生素的第一個(gè)產(chǎn)品，屬于酸性脂肽類抗生 素。它由13個(gè)氨基酸組成，其中十個(gè)氨基酸組成一個(gè)氨基酸環(huán)，另有3個(gè)氨基酸排列成線 狀，這三個(gè)氨基酸末端的L-色氨酸接著一個(gè)十碳癸酸。達(dá)托霉素的體外實(shí)驗(yàn)表明達(dá)托霉素 對(duì)多種抗藥性革蘭氏陽性病原性細(xì)菌特別是MRSA和VRE的抗菌活性強(qiáng)，并且因其作用機(jī)制 獨(dú)特而不易產(chǎn)生耐藥性，是目前公認(rèn)的萬古霉素等現(xiàn)用一線抗生素的最佳替代品。2003年 9月12日，美國FDA首次批準(zhǔn)Cubiein (達(dá)托霉素注射劑)用于治療復(fù)雜皮膚和皮膚結(jié)構(gòu) 感染，并先后在美國、德國、英國和荷蘭上市。2006年美國FDA又批準(zhǔn)了達(dá)托霉素的新適應(yīng) 癥，用于治療由金葡菌引起的心臟感染和菌血癥。2007年達(dá)托霉素的銷售額已經(jīng)達(dá)到2億 美元。上個(gè)世紀(jì)八十年代首次從玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)發(fā)酵產(chǎn)物 中分離獲得了達(dá)托霉素之后，達(dá)托霉素的生產(chǎn)方法有發(fā)酵法和生物轉(zhuǎn)化法。國內(nèi)在工業(yè)生 產(chǎn)達(dá)托霉素上使用發(fā)酵法比較多。但是目前達(dá)托霉素的產(chǎn)量非常低，通常才幾十個(gè)單位每 升，造成生產(chǎn)成本大量增加。雖然，經(jīng)過對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化和改進(jìn)，能使產(chǎn)量得到一定的提 高，但是由于所用的玫瑰孢鏈霉菌本身的限制，即使對(duì)發(fā)酵條件的極度優(yōu)化，也再難提高達(dá) 托霉素的產(chǎn)量。因此急需提供達(dá)托霉素的產(chǎn)量高的玫瑰孢鏈霉菌菌株及其篩選方法。傳統(tǒng)選育高產(chǎn)突變株的方法是隨機(jī)挑取誘變后的純培養(yǎng)物，通過對(duì)每個(gè)純培養(yǎng) 物進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，比較各個(gè)純培養(yǎng)物的發(fā)酵產(chǎn)量，從而獲得高產(chǎn)菌。這樣的篩選方法所產(chǎn)生 的突變是隨機(jī)的，突變無方向性，導(dǎo)致目標(biāo)菌株的篩選工作量大，直接影響了誘變育種的工 作效率。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對(duì)現(xiàn)有的達(dá)托霉素產(chǎn)生菌產(chǎn)量低的不足，提供一種選育生產(chǎn)達(dá)托霉素的玫瑰孢鏈霉菌菌株的篩選方法及其所得的菌株，該篩選方法 所得的菌株達(dá)托霉素產(chǎn)量高，篩選具有方向性，篩選效率高，可大大加快菌種選育進(jìn)程。本發(fā)明人經(jīng)過仔細(xì)的考慮和廣泛的研究后發(fā)現(xiàn)，達(dá)托霉素產(chǎn)生菌的抗生素抗性基 因和抗生素合成基因及其調(diào)控基因緊密連鎖，該三者基因容易發(fā)生共突變。因此，在達(dá)托霉 素產(chǎn)生菌育種中，采用鏈霉素抗性篩選和自身產(chǎn)物耐受性篩選的篩選方法，可以保證育種 的方向性，加快菌種選育進(jìn)程，提高篩選效率。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之一是，一種選育生產(chǎn)達(dá)托霉素的玫 瑰孢鏈霉菌菌株的篩選方法，包括以下步驟1)將野生型玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)或者其經(jīng)過誘變的突變 菌的菌液涂布含有鏈霉素和/或達(dá)托霉素的固體平板，培養(yǎng)，即得耐受鏈霉素和/或達(dá)托霉 素的玫瑰孢鏈霉菌；2)分別挑取步驟1)所得的耐受鏈霉素和/或達(dá)托霉素的玫瑰孢鏈霉菌的單個(gè)菌 落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，檢測發(fā)酵物中的達(dá)托霉素含量，選擇達(dá)托霉素含量比出發(fā)菌株高的菌株。本發(fā)明中，步驟1)為將野生型玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)或者 其經(jīng)過誘變的突變菌的菌液涂布含有鏈霉素和/或達(dá)托霉素的固體平板，培養(yǎng)，即得耐受 鏈霉素和/或達(dá)托霉素的玫瑰孢鏈霉菌。其中，所述的野生型玫瑰孢鏈霉菌Streptomyces roseosporus或者其經(jīng)過誘變的突變菌是待篩選的菌。本發(fā)明的待篩選的菌液可以是一 切野生型玫瑰孢鏈霉菌菌液，也可以是野生型玫瑰孢鏈霉菌經(jīng)過了誘變，如物理誘變或 化學(xué)誘變的突變菌菌液。所述的菌液較佳的是孢子液。其中所述的野生型玫瑰孢鏈霉 菌(Streptomycesroseosporus)較佳的是攻瑰抱鏈霉菌(Streptomyces roseosporus) NRRL11379。所述的固體平板可以是常規(guī)的培養(yǎng)玫瑰孢鏈霉菌的固體培養(yǎng)基，較佳的是ISP2 培養(yǎng)基，其成分為酵母膏0. 4%麥芽汁葡萄糖0. 4%瓊脂2% ；或高氏一號(hào)培養(yǎng)基，其 成分為可溶性淀粉 2. 0%, NaCl 0. 05%, KNO3O. 1%, K2HPO4 · 3Η20 0. 05%, MgSO4 · 7H20 0. 05%, FeSO4 · 7H20 0. 001%，瓊脂2. 0% ；所述的百分比均為質(zhì)量體積百分比。所述的鏈 霉素在固體平板中的濃度較佳的為0. 5 2. Ομ g/ml，更佳的為1. 5μ g/ml。所述的達(dá)托霉 素在固體平板中的濃度較佳的為0. 5 3. O μ g/ml，更佳的為2. 6 μ g/ml。所述的菌液可以 分別涂布含有鏈霉素固體平板或達(dá)托霉素的固體平板，也可以分別依次涂布含有鏈霉素或 達(dá)托霉素的固體平板，更佳的，所述的菌液涂布同時(shí)含有鏈霉素和達(dá)托霉素的固體平板，經(jīng) 過培養(yǎng)后，能長出菌落的就是同時(shí)耐受鏈霉素和達(dá)托霉素的菌株，這樣就對(duì)菌液進(jìn)行了初 次篩選。本發(fā)明中，步驟2)為分別挑取步驟1)所得的耐受鏈霉素和/或達(dá)托霉素的玫瑰 孢鏈霉菌的單個(gè)菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，檢測發(fā)酵物中的達(dá)托霉素含量，選擇達(dá)托霉素含量比 出發(fā)菌株高的菌株。其中，所述的單個(gè)菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵的方法可以是本領(lǐng)域常規(guī)的方法。 較佳的，挑取所述的單個(gè)菌落，接種于種子培養(yǎng)基進(jìn)行放大培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn) 行發(fā)酵。發(fā)酵的條件同常規(guī)。較佳的，發(fā)酵結(jié)束后，離心取上清發(fā)酵液，采用高效液相色譜 法測定發(fā)酵液中達(dá)托霉素的發(fā)酵單位。選擇達(dá)托霉素含量比出發(fā)菌株高的菌株。待篩菌液 是野生型玫瑰孢鏈霉菌的，所述的出發(fā)菌株是指Sti^ptomycesroseosporus NRRLl 1379自 然分離的生產(chǎn)菌株。待篩菌液是經(jīng)過誘變的突變菌的，所述的出發(fā)菌株是指誘變前的生產(chǎn) 菌株。
根據(jù)本發(fā)明，為了更高效的篩選到高產(chǎn)達(dá)托霉素的玫瑰孢鏈霉菌菌株，步驟2)中 所述的單個(gè)菌落較佳的是菌落顏色為藍(lán)綠色的菌落，而不挑選玫瑰紅色的菌落。本發(fā)明發(fā) 現(xiàn)玫瑰孢鏈霉菌菌株顏色與達(dá)托霉素產(chǎn)量有相關(guān)性，藍(lán)綠色菌株的發(fā)酵單位比玫瑰紅色 高，因此選取藍(lán)綠色的菌落比玫瑰紅色的菌落有更高的達(dá)托霉素產(chǎn)量。該菌落的形態(tài)特征 變化顯著，可以簡便快速的篩選到高產(chǎn)突變株。根據(jù)本發(fā)明，為了更高效的篩選到高產(chǎn)達(dá)托霉素的玫瑰孢鏈霉菌菌株，步驟2)中 所述的單個(gè)菌落，較佳的在分瓶培養(yǎng)前，先劃線于普通固體平板上，培養(yǎng)至長出菌苔后，用 無菌打孔器在菌苔上打孔，然后將孔中瓊脂圓塊放于涂布好金黃色葡萄球菌菌液的固體平 板上，經(jīng)過培養(yǎng)，選擇抑菌圈直徑較大的菌株進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。其中所述的固體平板是常規(guī)的 培養(yǎng)玫瑰孢鏈霉菌的固體培養(yǎng)基，較佳的是ISP2培養(yǎng)基或高氏一號(hào)培養(yǎng)基。所述的涂布好 金黃色葡萄球菌菌液的固體平板較佳的是LB平板(具體成分是0. 5%酵母提取物，1. 0%蛋 白胨，0.5% NaCl ；所述的百分比均為質(zhì)量體積百分比。抑菌圈的大小直接表現(xiàn)了達(dá)托霉素 抑菌效果的強(qiáng)弱，因此采用了直觀、簡便易行的抑菌圈大小進(jìn)行初篩，可以進(jìn)一步提高篩選 效率。本發(fā)明篩選方法的篩選效率高，篩選陽性率達(dá)到10-35%，而傳統(tǒng)的隨機(jī)挑選陽性 率小于1%。本發(fā)明還提供所述的篩選方法所得到的生產(chǎn)達(dá)托霉素的玫瑰孢鏈霉菌菌株。篩選 到的玫瑰孢鏈霉菌菌株達(dá)托霉素的發(fā)酵單位明顯提高，最高可提高5倍以上。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明提供了一種選育生產(chǎn)達(dá)托霉素 的玫瑰孢鏈霉菌菌株的篩選方法，可以選育高產(chǎn)達(dá)托霉素的玫瑰孢鏈霉菌突變菌株。第一， 本發(fā)明的篩選方法所選擇的突變具有方向性，只有達(dá)托霉素產(chǎn)量高的突變才被作為待篩對(duì) 象，加快了育種的方向性。第二，本發(fā)明還采用抑菌圈實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初篩，直觀、簡便易行。第三， 本發(fā)明還采用菌落形態(tài)特征——菌落顏色的顯著變化直接進(jìn)行篩選，簡單快速的得到高產(chǎn) 突變株。第四，本發(fā)明大大減少了工作量，篩選快速，菌種育種的工作效率高，加快菌種選育 進(jìn)程，篩選陽性率達(dá)到10-35%，而傳統(tǒng)的隨機(jī)挑選陽性率小于1%。第五，篩選到的玫瑰孢 鏈霉菌菌株達(dá)托霉素的發(fā)酵單位明顯提高，最高可提高5倍以上，將大大降低達(dá)托霉素的 生產(chǎn)成本。因此，本發(fā)明在達(dá)托霉素產(chǎn)生菌菌種選育及發(fā)酵法獲得達(dá)托霉素的工業(yè)化生產(chǎn) 中有較大的推廣價(jià)值。
具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注 明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1鏈霉素篩選美國農(nóng)業(yè)部菌種保藏中心獲得的保存于凍存管的野生型玫瑰孢鏈霉菌 (Streptomyces roseosporus) NRRL11379，涂布于高氏一號(hào)斜面，28°C培養(yǎng) 5-6 天。用無菌 水洗下孢子，分別涂布在含有0. 5-2mg/L各個(gè)濃度的鏈霉素的高氏一號(hào)平板(其成分為 可溶性淀粉 2. 0%, NaCl 0. 05%, KNO3O. 1%, K2HPO4 · 3H20 0. 05%, MgSO4 · 7H20 0. 05%, FeSO4 · 7H20 0. 001%，瓊脂2. 0% ；所述的百分比均為質(zhì)量體積百分比)上，28°C培養(yǎng)5天。然后隨機(jī)挑選平板上生長出的單菌落轉(zhuǎn)接一級(jí)種子培養(yǎng)基中。一級(jí)種子培養(yǎng)基組成及質(zhì)量 含量為TSB 30g，麥芽糊精35g，溶解在IL蒸餾水中，初始pH7.0。然后于30°C、200rpm搖 床中振蕩培養(yǎng)25小時(shí)。再將獲得的經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)的菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。液體發(fā) 酵培養(yǎng)基組成及質(zhì)量含量為玉米淀粉20g，葡萄糖20g，花生餅粉20g，酵母浸粉2. 5g，KCl 0. 2g，MgS040. 175g，CaC032g，溶解在IL蒸餾水中，初始pH 7. 5。初始培養(yǎng)溫度為30°C，接 種量為5% (V/V)，發(fā)酵罐培養(yǎng)7天；發(fā)酵過程中，添加氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基保持pH6. 0 7. 2。發(fā)酵液離心，取上清液，采用高效液相色譜法測定其中達(dá)托霉素的發(fā)酵單位。HPLP 分析條件是流動(dòng)相，A相0. 01%三氟乙酸；B相，乙氰；梯度程序如下，流速lml/min 分析柱XB-C8(3um，4.6*50mm) (Welch Materials Inc.產(chǎn)品)；檢測波長223nm。采用高效液相測定發(fā)酵液中達(dá)托霉素含量的峰面積與已知濃度的達(dá)托霉素標(biāo)準(zhǔn) 品的峰面積相比算出的相對(duì)值，即發(fā)酵單位。所得各個(gè)發(fā)酵液的發(fā)酵單位均與出發(fā)菌分瓶 發(fā)酵的發(fā)酵液相比，計(jì)算出發(fā)酵單位提高的倍數(shù)。出發(fā)菌株是涂平板前斜面培養(yǎng)所得的菌 株。同時(shí)計(jì)算達(dá)托霉素發(fā)酵單位有所提高的菌株占所挑選的用于分瓶發(fā)酵的菌落(即篩選 陽性率)的百分比。結(jié)果見表1，從表中結(jié)果可以看出，從平板獲得越耐受鏈霉素的菌株，達(dá) 托霉素的發(fā)酵單位越高。本篩選方法篩選陽性率為10-30%，而傳統(tǒng)的隨機(jī)挑選陽性率小于 1%。表1.鏈霉素抗性篩選模型效果 實(shí)施例2達(dá)托霉素篩選野生型玫瑰孢鏈霉菌涂布前的處理步驟同實(shí)施例1。然后將野生型玫瑰孢鏈霉菌 分別涂布含有0. 5-3mg/L各個(gè)濃度的達(dá)托霉素的高氏一號(hào)平板上，28°C培養(yǎng)5天。然后將 平板上生長出的單菌落轉(zhuǎn)接一級(jí)種子培養(yǎng)基中。種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)的步驟同實(shí)施例1。 對(duì)發(fā)酵液中達(dá)托霉素的發(fā)酵單位的檢測和計(jì)算也同實(shí)施例1。結(jié)果見表2，從表中結(jié)果可以看出，從平板獲得越耐受達(dá)托霉素的菌株，達(dá)托霉素 的發(fā)酵單位越高。本篩選方法篩選陽性率為15-25%，而傳統(tǒng)的隨機(jī)挑選陽性率小于1%。表2.達(dá)托霉素耐受篩選模型效果 實(shí)施例3抑菌圈篩選
野生型玫瑰孢鏈霉菌涂布前的處理步驟同實(shí)施例1。然后將野生型玫瑰孢鏈霉菌涂布高氏一號(hào)平板上28°C培養(yǎng)5天。然后將平板上長出的單菌落劃線于高氏一號(hào)體平板上，28°C培養(yǎng)5天。待平板上均勻的長出菌苔后，用--個(gè)無菌打孔器(孔徑約為5mm)在菌苔上打孔，然后將孔中瓊脂圓塊放于涂布好金黃色葡萄球菌菌液的LB平板上。28°C培養(yǎng)1天，通過比較抑菌圈直徑大小進(jìn)行篩選。將抑菌圈直徑較大的菌株轉(zhuǎn)接所對(duì)應(yīng)的菌株轉(zhuǎn)接一級(jí)種子培養(yǎng)基中。種子培養(yǎng)和發(fā)蹈計(jì)咅養(yǎng)的步驟同實(shí)施例1。對(duì)發(fā)酵液中達(dá)托霉素的發(fā)酵單位的檢測和計(jì)算也同實(shí)施例1。
結(jié)果見表3。從表中結(jié)果可以看出，從平板獲得抑菌圈越大的菌株，最后的達(dá)托霉素的發(fā)酵單位越高。
表3.抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果 實(shí)施例4菌落顏色篩選 野生型玫瑰孢鏈霉菌涂布前的處理步驟同實(shí)施例1。然后分別涂布含有1. 5mg/L 不同濃度鏈霉素的高氏一號(hào)平板上28°C培養(yǎng)5天，選取菌落顏色為藍(lán)綠色的菌株，轉(zhuǎn)接一級(jí)種子培養(yǎng)基中。種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)的步驟同實(shí)施例1。對(duì)發(fā)酵液中達(dá)托霉素的發(fā)酵單 位的檢測和計(jì)算也同實(shí)施例1。同時(shí)挑取玫瑰紅色菌株作為對(duì)照。結(jié)果見表4，從表中結(jié)果可以看出，菌株顏色的與產(chǎn)量有相關(guān)性，藍(lán)綠色菌株的發(fā) 酵單位比玫瑰紅色高，可以做為一種直接判斷菌株高產(chǎn)的方法。表4.菌株顏色與達(dá)托霉素產(chǎn)量的關(guān)系 玫瑰紅色菌株398.9
藍(lán)綠色菌株1 192.4 藍(lán)綠色菌株2 204.9 藍(lán)綠色菌株3_214.7_實(shí)施例5鏈霉素、達(dá)托霉素篩選美國農(nóng)業(yè)部菌種保藏中心獲得的保存于凍存管的野生型玫瑰孢鏈霉菌 Streptomyces roseosporus NRRL11379，涂布 ISP2 斜面(其成分為酵母膏 0. 4%麥芽汁
葡萄糖0. 4%瓊脂2% ；所述的百分比均為質(zhì)量體積百分比)，28°C培養(yǎng)5-6天。用無菌 水洗下孢子，然后涂布同時(shí)含有1. 5mg/L鏈霉素和2. 6μ g/ml的達(dá)托霉素的ISP2培養(yǎng)基， 其成分為酵母膏0.4%麥芽汁葡萄糖0.4%瓊脂2% ；平板上28°C培養(yǎng)5天。然后將 平板上生長出的單菌落轉(zhuǎn)接一級(jí)種子培養(yǎng)基中。種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)的步驟同實(shí)施例1。 對(duì)發(fā)酵液中達(dá)托霉素的發(fā)酵單位的檢測和計(jì)算也同實(shí)施例1。結(jié)果見表5，從表中結(jié)果可以看出，從平板獲得同時(shí)耐受鏈霉素和達(dá)托霉素的菌 株，達(dá)托霉素的發(fā)酵單位很高。本篩選方法篩選陽性率為20-30%，比傳統(tǒng)方法高。表5.鏈霉素、達(dá)托霉素耐受篩選模型效果 實(shí)施例6鏈霉素、達(dá)托霉素、菌落顏色篩選美國農(nóng)業(yè)部菌種保藏中心獲得的保存于凍存管的野生型玫瑰孢鏈霉菌 (Streptomyces roseosporus) NRRL11379，涂布高氏一號(hào)斜面，28°C培養(yǎng)5天。用無菌水洗 下孢子。孢子懸液中加入終濃度為lmg/ml的亞硝基胍，于30°C振蕩培養(yǎng)30min，然后涂布 含有1. 5mg/L鏈霉素和2. 6 μ g/ml的達(dá)托霉素的高氏一號(hào)平板，28°C培養(yǎng)5天，然后選取平
9板上生長出的菌落顏色為藍(lán)綠色的單菌落轉(zhuǎn)接一級(jí)種子培養(yǎng)基中。種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)的 步驟同實(shí)施例1。對(duì)發(fā)酵液中達(dá)托霉素的發(fā)酵單位的檢測和計(jì)算也同實(shí)施例1。結(jié)果見表6，從表中結(jié)果可以看出，從平板獲得的耐受鏈霉素和達(dá)托霉素、菌落顏 色為藍(lán)綠色的菌株，達(dá)托霉素的發(fā)酵單位很高。本篩選方法篩選陽性率為25-35%，比傳統(tǒng) 方法高。表6.鏈霉素、達(dá)托霉素、菌落顏色篩選效果 實(shí)施例7鏈霉素、達(dá)托霉素、菌落顏色、抑菌圈篩選美國農(nóng)業(yè)部菌種保藏中心獲得的保存于凍存管的野生型玫瑰孢鏈霉菌 (Streptomyces roseosporus) NRRL11379，涂布高氏一號(hào)斜面，28°C培養(yǎng)5天。用無菌水洗 下孢子，然后涂布同時(shí)含有1. 5mg/L鏈霉素和2. 6μ g/ml的達(dá)托霉素的高氏一號(hào)平板，28°C 培養(yǎng)5天。然后選取平板上生長出的菌落顏色藍(lán)綠色的單菌落，劃線于高氏一號(hào)平板上， 28°C培養(yǎng)5天。待平板上均勻的長出菌苔后，用一個(gè)無菌打孔器(孔徑約為5mm)在菌苔上 打孔，然后將孔中瓊脂圓塊放于涂布好金黃色葡萄球菌菌液的LB平板上。28°C培養(yǎng)1天， 通過比較抑菌圈直徑大小進(jìn)行篩選。將抑菌圈直徑較大的菌株轉(zhuǎn)接所對(duì)應(yīng)的菌株轉(zhuǎn)接一級(jí)種子培養(yǎng)基中。種子培養(yǎng)和 發(fā)酵培養(yǎng)的步驟同實(shí)施例1。對(duì)發(fā)酵液中達(dá)托霉素的發(fā)酵單位的檢測和計(jì)算也同實(shí)施例1。結(jié)果見表7，從表中結(jié)果可以看出，從平板獲得耐受鏈霉素和達(dá)托霉素、菌落顏色 為藍(lán)綠色、抑菌圈大的菌株，達(dá)托霉素的發(fā)酵單位很高。本篩選方法篩選陽性率為25-35%， 比傳統(tǒng)方法高。表7.鏈霉素、達(dá)托霉素、菌落顏色、抑菌圈篩選效果
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權(quán)利要求
一種選育生產(chǎn)達(dá)托霉素的玫瑰孢鏈霉菌菌株的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟1)將野生型玫瑰孢鏈霉菌Streptomyces roseosporus或者其經(jīng)過誘變的突變菌的菌液涂布含有鏈霉素和/或達(dá)托霉素的固體平板，培養(yǎng)，即得耐受鏈霉素和/或達(dá)托霉素的玫瑰孢鏈霉菌；2)分別挑取步驟1)所得的耐受鏈霉素和/或達(dá)托霉素的玫瑰孢鏈霉菌的單個(gè)菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，檢測發(fā)酵物中的達(dá)托霉素含量，選擇達(dá)托霉素含量比出發(fā)菌株高的菌株。
2.如權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟1)所述的野生型玫瑰孢鏈霉菌 Streptomyces roseosporus 是攻瑰抱鏈霉菌 Streptomycesroseosporus NRRL 11379。
3.如權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟1)所述的鏈霉素在固體平板中的 濃度為0. 5 2. Ομ g/ml。
4.如權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟1)所述的達(dá)托霉素在固體平板中 的濃度為0. 5 3. O μ g/ml。
5.如權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟1)所述的固體平板是SP2培養(yǎng)基 或高氏一號(hào)培養(yǎng)基。
6.如權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟2)所述的單個(gè)菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵 的方法是，挑取所述的單個(gè)菌落，接種于種子培養(yǎng)基進(jìn)行放大培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基 進(jìn)行發(fā)酵。
7.如權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟2)所述的單個(gè)菌落是菌落顏色為 藍(lán)綠色的菌落。
8.如權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟2)所述的單個(gè)菌落在分瓶培養(yǎng)前， 先劃線于普通固體平板上，培養(yǎng)至長出菌苔后，用無菌打孔器在菌苔上打孔，然后將孔中瓊 脂圓塊放于涂布好金黃色葡萄球菌菌液的固體平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，選擇抑菌圈直徑較大的 菌株進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。
9.如權(quán)利要求8所述的篩選方法，其特征在于，所述的普通固體平板是SP2培養(yǎng)基或高 氏一號(hào)培養(yǎng)基；所述的涂布好金黃色葡萄球菌菌液的固體平板是LB平板。
10.一種如權(quán)利要求1 9任一項(xiàng)所述的篩選方法所得到的生產(chǎn)達(dá)托霉素的玫瑰孢鏈 霉菌菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種選育生產(chǎn)達(dá)托霉素的玫瑰孢鏈霉菌菌株的篩選方法及其所得到的菌株。該篩選方法包括以下步驟1)將野生型玫瑰孢鏈霉菌(Streptomyces roseosporus)或者其經(jīng)過誘變的突變菌的菌液涂布含有鏈霉素和/或達(dá)托霉素的固體平板，培養(yǎng)，即得耐受鏈霉素和/或達(dá)托霉素的玫瑰孢鏈霉菌；2)分別挑取步驟1)所得的耐受鏈霉素和/或達(dá)托霉素的玫瑰孢鏈霉菌的單個(gè)菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，檢測發(fā)酵物中的達(dá)托霉素含量，選擇達(dá)托霉素含量比出發(fā)菌株高的菌株。本發(fā)明篩選方法具有方向性，直觀、簡單、快速、高效，大大減少工作量，加快菌種選育進(jìn)程。篩選到的玫瑰孢鏈霉菌菌株達(dá)托霉素的發(fā)酵單位明顯提高，最高可提高5倍以上。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101892287SQ200910051489
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2009年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月19日
發(fā)明者廖艷艷, 王巖, 陳少欣 申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院