專利名稱：登革病毒特異性hla-a2限制性表位肽及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)藥領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及登革病毒特異性HLA-A2 限制性表位肽及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
登革病毒(Dengue virus, DENV)為單股正鏈RNA病毒，屬黃病毒科、黃病毒屬，包 括四個(gè)血清型(DENV-1，2，3，4)。DENV基因組約為llkb，編碼產(chǎn)生3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(衣殼蛋白 C、膜蛋白M和包膜蛋白E)和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NSl，NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b和NS5)。 DENV感染引起輕度的登革熱(Dengue fever, DF)或嚴(yán)重的登革出血熱/登革休克綜合癥 (Denguehemorrhagic fever/dengue shock syndrome,DHF/DSS),其中 DHF/DSS病例具有極 高的病死率。據(jù)WHO估計(jì)全球每年約有5000萬-1億DENV感染者，其中包括約25萬-50 萬的DHF/DSS病例。目前，在100多個(gè)國家中出現(xiàn)過DF患者，而超過60個(gè)國家報(bào)道過DHF 病例。從1978年中國廣東和海南等地區(qū)首次出現(xiàn)DF以來，中國的臺(tái)灣，廣西，福建，云南， 浙江和上海等地區(qū)均出現(xiàn)過規(guī)模不等的DF的流行。最近十幾年，中國流行的DENV血清型 主要是DENV-I型。研究表明DENV感染所誘導(dǎo)的特異性CD8+T細(xì)胞(Cytotoxic Tlymphocyte,細(xì)胞毒 性T細(xì)胞，CTL)通過釋放穿孔素、顆粒酶或表達(dá)凋亡配體(FasL)而殺傷DENV感染細(xì)胞、清 除DENV。CTL表位是刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性CTL的核心元件(與MHC-I類分子結(jié)合的多肽， 長(zhǎng)度約為8-10個(gè)氨基酸)，其能誘導(dǎo)表位特異性的CTL而不出現(xiàn)無關(guān)的免疫反應(yīng)。因此，基 于CTL表位研發(fā)的CTL表位肽疫苗同傳統(tǒng)疫苗相比，具有明顯優(yōu)勢(shì)1.安全、無毒、穩(wěn)定原 因是此類疫苗不包含病原生物的無關(guān)組分，只能激發(fā)特異性CTL免疫反應(yīng)，因此徹底擺脫 了潛在的副作用；2.易于將來源于病原體的多個(gè)CTL表位進(jìn)行組合，研發(fā)針對(duì)一種病原體 或者針對(duì)多種病原體的多價(jià)CTL表位肽疫苗；3.易于人工合成，擺脫了體外培養(yǎng)的限制，大 大縮短了研制周期。由于上述優(yōu)勢(shì)，CTL表位肽疫苗已成為防治DENV感染研究的一個(gè)新方 向，而鑒定DENV特異性CTL表位則是研發(fā)此類疫苗的關(guān)鍵。HLA-A2是一種在中國人群中具有較高分布的MHC-I類分子，陽性率在40 % -60 % 之間，占MHC-I類分子中各個(gè)等位基因的首位，是CTL表位肽疫苗研發(fā)中首選的MHC分子。由于目前尚缺乏預(yù)防DENV感染的方法，因此迫切需要開發(fā)新的可用于防治DENV 感染的疫苗，尤其是安全性和特異性高的CTL表位肽疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供具有較高免疫原性的DENV-I特異性HLA-A2限制性表位 肽。在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的多肽，所述的多肽是選自如SEQ IDNO :1、 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4所示氨基酸序列的多肽。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的多肽來源于登革病毒。
在另一優(yōu)選例中，所述的多肽來源于登革病毒血清型1 (DENV-I)。在另一優(yōu)選例中，所述的多肽是登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白來源的。另一方面，提供一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸編碼所述的多肽。另一方面，提供一種載體，所述載體含有所述的多核苷酸。另一方面，提供一種遺傳工程化的細(xì)胞，所述細(xì)胞含有所述的載體或其基因組中 整合有所述的多核苷酸。另一方面，提供一種制備所述的多肽的方法，所述方法包括(i)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)所述的細(xì)胞；和(ii)分離出所述的多肽。另一方面，提供所述的多肽的用途，用于制備誘導(dǎo)發(fā)生細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)反應(yīng) 的藥物組合物。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的多肽用于制備誘導(dǎo)產(chǎn)生肽特異性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞 (CTL)的藥物組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞毒性T細(xì)胞是HLA-A2限制性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。另一方面，提供所述的多肽的用途，用于制備預(yù)防或治療登革病毒(DENV)感染的 藥物組合物。另一方面，提供一種藥物組合物，所述藥物組合物含有有效量的所述的一種或多種多肽；和藥學(xué)上可接受的載體。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的藥物組合物是疫苗。另一方面，提供一種藥盒，所述的藥盒中含有一種或多種所述的多肽；或所述的 藥物組合物。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。


圖1、各種肽與HLA-A2分子的親和力，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)用各種肽處理的細(xì)胞 的熒光強(qiáng)度。圖2、體外從外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中誘導(dǎo)產(chǎn)生成熟的樹突狀細(xì)胞(DC)的顯微 鏡照片。其中，左圖顯示為未成熟DC，其表現(xiàn)為貼壁、長(zhǎng)分枝狀細(xì)胞；右圖顯示為成熟DC，其 表現(xiàn)為懸浮、細(xì)胞邊緣有細(xì)小突起。圖3、HLA_A2限制性表位肽誘導(dǎo)的CTL中IFN- y +CD8+T細(xì)胞的百分比。其中，“*” 表示肽刺激組和無肽刺激組比較有顯著性差異。圖4、CTL表位肽體外誘導(dǎo)的特異性CTL (ELISPOT檢測(cè)分泌IFN- γ的細(xì)胞)。其 中，A為無肽刺激；B為同樣的多肽刺激。圖5、HLA-A2限制性CTL表位肽體外誘導(dǎo)的特異性CTL(ELISP0T檢測(cè)分泌IFN- γ 的細(xì)胞)?！?”表示肽刺激組和無肽刺激組比較有顯著性差異。圖6、HLA-A2限制性CTL表位肽誘導(dǎo)的CTL對(duì)負(fù)載表位肽Τ2細(xì)胞的殺傷作用。圖7、各肽的質(zhì)譜圖。
AJi NS4a_140 的質(zhì)譜圖；B、肽 NS2a_144 的質(zhì)譜圖；C、肽 NS5_134 的質(zhì)譜圖；DJi NS4b_40 的質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，首次揭示一組具有較高免疫原性的DENV-I特 異性HLA-A2限制性表位肽。所述表位肽是DENV-I非結(jié)構(gòu)蛋白來源的、HLA-A2限制性的CTL 表位肽，可誘導(dǎo)高水平的具有殺傷作用的CTL反應(yīng)。本發(fā)明人首先通過對(duì)DENV-I的非結(jié)構(gòu)蛋白采用Rankp印，SYFPEITHI等T細(xì)胞 表位預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)，選擇合成了多條有可能與HLA-A2. 1分子結(jié)合并誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生CTL效 應(yīng)的抗原肽，通過MHC-肽復(fù)合物穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，篩選出與HLA-A2. 1具有強(qiáng)親和力的表位肽 NS4a_140、肽NS2a_144、肽NS5_134和肽NS4b_40，并對(duì)其免疫原性進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)它們不僅 可以在HLA-A2陽性健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中誘導(dǎo)出肽特異性的HLA-A2限制性 的CTL，并且這些CTL可以殺傷提呈同樣表位肽的T2細(xì)胞。MHC-肽復(fù)合物穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)顯示上述這些表位肽受HLA-A2限制，ICS、ELISPOT和 CTL殺傷實(shí)驗(yàn)證實(shí)這些表位肽具有較好免疫原性且其誘導(dǎo)的CTL可以殺傷負(fù)載多肽的T2細(xì) 胞。 如本文所用，所述的“HLA-A2限制性的CTL表位肽”是指具有SEQ ID NO=U SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4所示氨基酸序列的多肽(如表1)或其衍生肽，其是 登革病毒特異性的，具有誘導(dǎo)發(fā)生細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)反應(yīng)的功能。所述的“HLA-A2限 制性的CTL表位肽”在文中也簡(jiǎn)稱為“本發(fā)明的表位肽”或“所述的表位肽”。本文所述的 “CTL表位肽”是指含有CTL表位的氨基酸序列的蛋白；該蛋白或含有該蛋白的組合物可引 發(fā)哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答。本發(fā)明中，術(shù)語“多肽”、“蛋白”可互換使用。表 1 如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原 始環(huán)境即是天然環(huán)境)。例如，活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純 化的，但同樣的多聚核苷酸和多肽如果與天然狀態(tài)一起存在的其他物質(zhì)分開，則為分離純 化的。
如本文所用，“免疫活性”或“免疫原性”指由天然、重組或合成的疫苗誘導(dǎo)哺乳動(dòng) 物體內(nèi)的特異性體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。如本文所用，“免疫應(yīng)答”包括細(xì)胞性和/或體液性免疫應(yīng)答，它們足以抑制或防止 病毒感染；或防止或抑制由登革病毒所導(dǎo)致的疾病。如本文所用，“藥學(xué)上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動(dòng)物而無過度不良 副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即具有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。術(shù)語“藥學(xué)上 可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑或稀釋劑。如本文所用，“有效量”或“免疫有效量”指以單劑或連續(xù)劑一部分給予個(gè)體的量對(duì) 治療或預(yù)防是有效的。該用量根據(jù)所治療個(gè)體的健康狀況和生理狀況、所治療個(gè)體的類別 (如非人靈長(zhǎng)類等)、個(gè)體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需的保護(hù)程度、疫苗的配制、治療醫(yī) 師對(duì)醫(yī)療狀況的評(píng)估、及其它的相關(guān)因素而定。預(yù)計(jì)該用量將在相對(duì)較寬的范圍內(nèi)，可通過 常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定。本發(fā)明的表位肽及其編碼基因本發(fā)明的表位肽可以是重組多肽、合成多肽。本發(fā)明的表位肽可以是天然純化的 產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母和哺乳 動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。本發(fā)明還包括所述表位肽的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片斷”、“衍 生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的表位肽相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本 發(fā)明的表位肽片斷、衍生物和類似物可以是(1)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘 基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，或(2)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代 基團(tuán)的多肽，或(3)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長(zhǎng)多肽半衰期的化合物，例如聚乙二 醇)融合所形成的多肽，或(4)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(如前 導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化的多肽序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片斷的形成的融合 蛋白)。這些片斷、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。本發(fā)明的表位肽的用途是直接作為藥物預(yù)防或治療病原體(登革病毒)感染相 關(guān)疾??；或制備誘導(dǎo)發(fā)生細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)反應(yīng)的藥物組合物。編碼本發(fā)明的表位肽的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是單鏈的 或是雙鏈的。術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼本發(fā)明的表位肽的多核苷酸，也 可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明表位肽有相同的氨基酸序 列的多肽或多肽的片斷、類似物和衍生物。本發(fā)明所述的多核苷酸通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。 對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì) 引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板， 擴(kuò)增而得有關(guān)序列。所述的重組法通常是將所述多核苷酸克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通 過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外還可以通過人工合成的方法來 合成有關(guān)序列。目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明表位肽(或其片段，或其衍 生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。載體及宿主細(xì)胞本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及本發(fā)明的載體或表位肽編碼序 列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明所述表位肽的方法。通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984，224 :1431)，可利用本發(fā)明的多核苷酸 序列來表達(dá)或生產(chǎn)重組的本發(fā)明的表位肽。一般來說有以下步驟(1)用本發(fā)明的編碼表位肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；和(3)從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。本發(fā)明中，編碼所述表位肽的多核苷酸可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá) 載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆 轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表 達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含所述多核苷酸序列和合適的轉(zhuǎn)錄/ 翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù) 等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。此外， 表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型 性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于 大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。包含上述的編碼所述的表位肽的多核苷酸以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體， 可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高 等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，酵母等。針對(duì)不同的宿主細(xì)胞，還 可對(duì)所述的多核苷酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，以獲得改進(jìn)的表達(dá)效果，密碼子優(yōu)化技術(shù)是本 領(lǐng)域人員熟知的。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原 核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理， 所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的 方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方 法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，以表達(dá)所述的表位肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞， 培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。所述的表位肽可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。可利用其物理的、化學(xué)的和其它 特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這 些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲 透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析 (HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
組合物本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的表位肽的組合物，特別是藥物組合物，所述的組合 物也包括疫苗。該組合物可用于誘導(dǎo)發(fā)生細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)反應(yīng)，也即誘導(dǎo)產(chǎn)生肽特 異性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)。該組合物可用于預(yù)防或治療登革病毒感染相關(guān)疾病，所述疾 病包括(但不限于)登革熱、登革出血熱/登革休克綜合癥。包含本發(fā)明的表位肽的組合物可以包含按表位肽的實(shí)際用途所選用的緩沖劑；還 可包含適用于預(yù)定用途的其它物質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員都善于選擇合適的緩沖劑，本領(lǐng)域已 知有多種緩沖劑適用于預(yù)定用途。在有些實(shí)例中，該組合物可含有藥學(xué)上可接受的賦形劑， 本領(lǐng)域已知有多種而無需在此詳細(xì)討論。藥學(xué)上可接受的各種賦形劑在多種出版物已有詳 述，包括如“Remington，sPharmaceutical Sciences'^《雷明頓藥物科學(xué)》，第 19 版(1995) Mack PublishingCo.)?？蓪⒈景l(fā)明的組合物制備成各種劑型，如注射劑、粒劑、片劑、丸劑、栓劑、膠囊、懸 浮液、噴霧、透皮藥物等。適用于口服或局部使用的藥用級(jí)別的有機(jī)或無機(jī)載體和/或稀釋 劑，可用于配制包含治療活性化合物的各種組合物。本領(lǐng)域已知的稀釋劑包括水性介質(zhì)、植 物性和動(dòng)物性油和脂肪。還可用穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑和乳化劑、改變滲透壓的鹽類或維持合適PH 值的各種緩沖劑和皮膚滲透增強(qiáng)劑等作為輔助性材料。當(dāng)用作疫苗時(shí)，所述的疫苗可采用各種方法進(jìn)行配制。通常，按本領(lǐng)域熟知的各種 方法，用合適的藥用載體和/或運(yùn)載體(vehicle)配制本發(fā)明的疫苗或藥物。合適的載體 是無菌鹽水。為此也可使用其它水性和非水性等滲無菌注射液以及水性和非水性無菌懸浮 液(已知都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的藥學(xué)上可接受的載體)。另外，本發(fā)明的疫苗的配制還可含有其它成分，包括如佐劑、穩(wěn)定劑、pH調(diào)節(jié)劑、防 腐劑等。這些成分是疫苗領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。佐劑類包括(但不限制于)鋁鹽佐劑；皂 苷佐劑；Ribi 佐劑(Ribi ImmunoChem Research In. , Hamilton, MT) ；Montanide ISA 佐劑 (Seppic, Paris, France) ；Hunter，s TiterMax 佐劑(CytRx Corp.，Norcross, GA) ；Gerbu 佐劑(Gerbu Biotechnik GmbH，Gaiberg，Germany)等。另外，在制劑中也可包含調(diào)節(jié)免疫 應(yīng)答的其它成分(IL_12、CpG寡脫氧核苷酸(CpG-ODN)等)。當(dāng)用作疫苗時(shí)，可用已知的方法將本發(fā)明的表位肽施用于對(duì)象。通常采用與常規(guī) 疫苗相同的施用途徑和/或模擬病原體感染路徑施用這些疫苗。采用疫苗組合物的形式 時(shí)，還可包括藥學(xué)上可接受的載體。此外，這種組合物還可包括佐劑、矯味劑或穩(wěn)定劑等。給予本發(fā)明組合物的常規(guī)和藥學(xué)上可接受的途徑包括鼻內(nèi)、肌內(nèi)、氣管內(nèi)、皮下、 皮內(nèi)、肺內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)鼻、經(jīng)口服或其它腸胃外給藥途徑。如果需要可以組合給藥途徑，或 按抗原肽或疾病情況進(jìn)行調(diào)節(jié)。疫苗可以單劑量或多劑量給予，且可以包括給予加強(qiáng)劑量 以引發(fā)和/或維持免疫力。應(yīng)以“有效量”給予本發(fā)明的表位肽，即表位肽的量在所選用的給藥路徑中足以引 發(fā)免疫應(yīng)答，能有效促使保護(hù)宿主抵抗登革病毒感染或因感染導(dǎo)致的并發(fā)癥。在各疫苗劑份中所選用的表位肽的量，是按可引發(fā)免疫保護(hù)性應(yīng)答而無明顯的副 作用的量而定。通常，給予約0. 01 μ g-10mg表位肽/kg體重，優(yōu)選0. 1 μ g-lmg表位肽/kg 體重，更優(yōu)選1 μ g-lmg表位肽/kg體重?？捎冒ㄓ^察對(duì)象中表位肽特異性CTL的水平和 其它反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)研究方法來確定具體疫苗的最佳用量，可通過監(jiān)控疫苗提供的免疫力水平來確定是否需要增強(qiáng)劑量。在評(píng)估了血液中的表位肽特異性CTL的水平后，可能需要選用 增強(qiáng)劑量免疫接種。施用佐劑和/或免疫刺激劑就可提高對(duì)本發(fā)明的表位肽的免疫應(yīng)答。藥盒本發(fā)明還提供了一種防治登革病毒感染或因感染導(dǎo)致的并發(fā)癥的藥盒，其中含有 本發(fā)明的表位肽或含有該表位肽的組合物。此外，為了方便給藥，所述的藥盒中還可含有注 射用的針，和/或藥學(xué)上可接受的載體，和/或使用說明書。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明表位肽是DENV-I非結(jié)構(gòu)蛋白來源的、HLA-A2限制性的CTL表位，可誘導(dǎo)高 水平的具有殺傷作用的CTL反應(yīng)，其不僅對(duì)DENV發(fā)病機(jī)制的研究，而且對(duì)DENV表位疫苗以 及DENV感染診斷試劑的研發(fā)均具有重要的意義。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所 述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1、MHC-肽復(fù)合物穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)首先對(duì)DENV-I非結(jié)構(gòu)蛋白采用Rankp印，SYFPEITHI等T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)， 用常規(guī)的肽人工合成法，合成了多條有可能與HLA-A2. 1分子結(jié)合并誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生CTL的抗 原肽，見表2。接著，應(yīng)用MHC-肽復(fù)合物穩(wěn)定性試驗(yàn)篩選與HLA-A2. 1分子高親和力的表位肽。T2 細(xì)胞是用于測(cè)定表位與HLA-A2. 1分子結(jié)合的細(xì)胞，是一種抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體(TAP)缺陷 的HLA-A2. 1型細(xì)胞株，其細(xì)胞表面只表達(dá)未結(jié)合表位的HLA-A2. 1分子，因而可利用其與肽 的結(jié)合程度來測(cè)定HLA-A2. 1分子與肽的親和力。方法如下培養(yǎng)T2細(xì)胞(購自ATCC)，用無血清RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，調(diào)細(xì)胞濃度 為6X IO5個(gè)/ml，鋪于24孔板，Iml/孔。分為實(shí)驗(yàn)孔每孔加50 μ g肽、3 μ g的β 2Μ( β 2微 球蛋白，購自Sigma)、空白對(duì)照孔(未加肽刺激、未加β2Μ)和背景對(duì)照孔(未加肽刺激、 只加β 2Μ)，首先將細(xì)胞在37°C，5% CO2孵箱中孵育lh，然后在26°C孵育18h，最后在37°C 孵育3h。用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入FITC標(biāo)記的抗HLA-A2的單克隆抗體(BD pharmingen) (空白對(duì)照孔不加)，4°C避光孵育30min，PBS洗滌2次后，用500 μ 1的含0.5%多聚甲醛 的PBS懸浮細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度(空白對(duì)照孔的Τ2細(xì)胞用于調(diào)電 壓)。結(jié)果判定外源性肽與Τ2細(xì)胞表面HLA-A2. 1分子的結(jié)合可使其表面的MHC-I類 分子的量增加，兩者結(jié)合越牢固，可檢測(cè)到的MHC-I類分子的量越多。以平均熒光強(qiáng)度為檢 測(cè)指標(biāo)，以熒光系數(shù)(FI)作為衡量指標(biāo)，肽的FI > 1被認(rèn)為是高親和力的表位?！? 樣本平均熒光強(qiáng)度-背景平均熒光強(qiáng)度
熒光系數(shù)(FI)=-
背景平均熒光強(qiáng)度如表1 和圖 1 所示，肽 NS4a_140、肽 NS2a_144、肽 NS5_134 和肽 NS4b_40 與 HLA-A2. 1分子具有高親和力，這些肽為HLA-A2限制性表位。這些肽的質(zhì)譜鑒定見圖7。表2. T2細(xì)胞HLA-A2分子對(duì)DENV-I候選表位肽的結(jié)合力 其中，OPT 肽同HLA-A2分子結(jié)合力得分占最佳表位肽同HLA-A2分子結(jié)合力得分 的百分比。實(shí)施例2、成熟樹突狀細(xì)胞(DC)的誘導(dǎo)，以及負(fù)載肽的DC的制備成熟樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)如下抽取HLA-A2陽性健康者的外周靜脈血，用無菌PBS緩沖液1 1稀釋，將其輕輕 覆蓋在Ficoll-Paque密度梯度分離液上，室溫2000rpm離心25min，輕輕吸取中間白膜層 (PBMC)，用10 % FCS的RPMI 1640液洗滌2次，將PBMC在6孔板中貼壁培養(yǎng)3h，棄培養(yǎng)液 及未貼壁細(xì)胞，每孔加 2ml 含 10% FCS、20y g/ml GM-CSF(Peprotech Inc)、20 μ g/ml 的
10IL-4(Peprotech Inc)的RPMI1640培養(yǎng)液，于37°C、5% CO2孵箱中，每3天半量換液(補(bǔ) 充等量的細(xì)胞因子)，培養(yǎng)至第7天加TNF-α (10 μ g/ml,Peprotech Inc)誘導(dǎo)成熟，48h后 收集細(xì)胞，用相差顯微鏡觀察樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)成熟中細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果如圖2所示，未成熟DC為貼壁、長(zhǎng)分枝狀細(xì)胞，而成熟DC為懸浮、細(xì)胞邊緣有突起。負(fù)載肽的DC的制備如下將各肽加入前述制備的成熟的DC中(100 μ g/1 X IO5DC)，37 °C、5 % CO2孵箱中培 養(yǎng) 12h。實(shí)施例3、PBMC的分離及體外肽特異性CTL的誘導(dǎo)抽取HLA-A2陽性健康者的外周靜脈血，用無菌PBS緩沖液1 1稀釋，將其輕輕 覆蓋在Ficoll-Paque密度梯度分離液上，室溫2000rpm離心25min，輕輕吸取中間白膜層 (PBMC)，用10% FCS的RPMI 1640液洗滌2次。將PBMC懸浮于10%人AB血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液(2X106個(gè)/ml)中，將細(xì)胞懸液加到6孔板中(每孔2ml)，然后將前述制備的負(fù)載肽 的DC (IX IO5個(gè)/ml)加入孔中共同孵育，每孔加IL-2(10ng/ml，P印rotech Inc)。隔7天 用負(fù)載肽的DCaxiO5個(gè)/ml)再刺激1次。第二次刺激后7天，收集細(xì)胞(為效應(yīng)細(xì)胞)。實(shí)施例4、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法(ICS)檢測(cè)肽特異性⑶8+IFN- y +T細(xì)胞用負(fù)載相同表位肽的DC刺激前述獲得的效應(yīng)細(xì)胞，用未負(fù)載表位肽的DC刺激 前述獲得的效應(yīng)細(xì)胞。加入BFA(BrefeldinA，布雷菲德菌素Α，購自EnzoBiochem公司， 終濃度為10yg/ml)，37°C、5% CO2孵箱中培養(yǎng)6h。收集細(xì)胞，PBS洗滌2次。管中加入 APC標(biāo)記的抗人⑶3單克隆抗體(eBioscience，美國)、FITC標(biāo)記的抗人⑶8單克隆抗體 (eBioscience)，4°C避光孵育30min。PBS洗滌2次，管中加入固定劑室溫IOmin0 PBS洗滌 1次，管中加入破膜劑，加入PE標(biāo)記的抗人IFN-Y單克隆抗體(eBioscience)，4°C避光孵 育30min。PBS洗滌2次，用500μ1含0.5%多聚甲醛的PBS懸浮細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測(cè)肽 特異性⑶8+IFN- y +T細(xì)胞的水平。結(jié)果如圖3所示，DENV-I特異性HLA-A2限制性表位肽NS4a_140，肽NS2a_144，肽 NS5_134和肽NS4b_40可在體外誘導(dǎo)高水平的CTL反應(yīng)(在同樣肽刺激后，⑶8+T細(xì)胞中有 高水平的IFN- y +CD8+T細(xì)胞)。實(shí)施例5、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(ELISP0T)檢測(cè)肽特異性分泌IFN-Y的細(xì)胞采用人IFN- y ELISP0T試劑盒(預(yù)包被的PVDF膜96孔板，荷蘭U-CyTech公司)， 參照說明書進(jìn)行。過程如下將96孔板平衡至室溫，每孔加入200 μ 1的RPMI 1640培養(yǎng)液，室溫下孵育20min。 吸出培養(yǎng)液，每孔加入前述肽刺激的2 X IO4PBMC (效應(yīng)細(xì)胞)(懸浮于100 μ 1 RPMI 1640培 養(yǎng)液)。設(shè)置陰性對(duì)照孔(加PBMC而不加多表位肽)，表位肽刺激孔(加PBMC同時(shí)加入表位 肽使其終濃度為10 μ g/ml)，每個(gè)處理因素均設(shè)置兩孔。將板放于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)24h。吹散每孔中的細(xì)胞，吸除液體，洗滌4次(每孔加入100 μ 1洗脫液，洗滌30s，最后 將板倒置到吸水紙上拍打以吸干殘留的液體)。每孔加入100 μ 1新鮮稀釋好的生物素化抗 IFN-Y的檢測(cè)抗體，于37°C培養(yǎng)lh。吸除孔中液體，洗滌4次(同上)。每孔加入100 μ 1 新鮮稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈酶親和素，于37°C培養(yǎng)Ih(避光)。吸除孔中 液體，洗滌4次(同上)。每孔加入100 μ 1現(xiàn)配的ACE顯色液，于37°C培養(yǎng)10-30min (避光)。移除每孔中ACE，用去離子水沖洗，將板倒置到吸水紙上拍干。從板底部移除塑料排水 管，擦干凈板的底部。室溫放置l-2d使板充分干燥。用ELISP0T斑點(diǎn)分析儀對(duì)每孔斑點(diǎn)計(jì) 數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)只計(jì)數(shù)邊緣顏色淺中心顏色深的斑點(diǎn)。一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)斑點(diǎn)形成細(xì)胞(Spots Forming Cells，SFC)。斑點(diǎn)數(shù)表示為SFCs/1 X 104PBMC。減去陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)后，表位肽 刺激孔斑點(diǎn)數(shù)彡ISFCs/l X IO4PBMC時(shí)，結(jié)果判讀為陽性。結(jié)果如圖4、圖5所示，DENV-I特異性HLA-A2限制性表位肽NS4a_140、肽 NS2a_144、肽NS5_134和肽NS4b_40可在體外誘導(dǎo)高水平的CTL反應(yīng)。實(shí)施例6、CTL殺傷實(shí)驗(yàn)用負(fù)載相同表位肽的T2細(xì)胞制備方法如實(shí)施例1，用各肽刺激即可(每孔加 50 μ g肽、3 μ g的β 2Μ)做靶細(xì)胞，用LDH細(xì)胞毒檢測(cè)試劑盒(Cayman公司，德國)檢測(cè)肽 特異性CTL殺傷靶細(xì)胞的活性，設(shè)RPMI 1640液孔(加無血清RPMI 1640液)，體積校正孔 (加無血清RPMI 1640液)，實(shí)驗(yàn)孔(效/靶比分為10 1,5 1,2 1，靶細(xì)胞為1 X IO3)， 靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔(IX IO3靶細(xì)胞)，靶細(xì)胞最大釋放孔(IX IO3靶細(xì)胞)，效應(yīng)細(xì)胞孔(效 應(yīng)細(xì)胞為1 X IO4或5 X IO3或2 X IO3)，每孔總體積為100 μ 1。實(shí)驗(yàn)過程如下按上述將細(xì)胞或培養(yǎng)液加入96孔板中，37°C、5% CO2孵箱中培養(yǎng)48h，結(jié)束前6h， 體積校正孔和靶細(xì)胞最大釋放孔加入0. 8%的Tripton-IOO。培養(yǎng)結(jié)束后，吹打每孔lmin， 采用培養(yǎng)板水平離心機(jī)400g離心lOmin，吸取每孔上清50 μ 1，轉(zhuǎn)移到新的96孔板(每孔 加入50 μ 1新配置的檢測(cè)試劑)，室溫反應(yīng)lh。測(cè)定每孔490nm的吸光度值(0D值)。計(jì)算 每個(gè)效/靶比時(shí)殺傷百分比。
(實(shí)驗(yàn)孔-1640液孔)-(效應(yīng)細(xì)胞孔-1640液孔)-(靶細(xì)胞自
—、，， _發(fā)釋放孔-體積校正孔)_
手傷百分比=--
〃(靶細(xì)胞最大釋放孔-1640液孔)-(靶細(xì)胞自發(fā)釋放組-體
積校正孔)如圖6 所示，DENV-I 特異性 HLA-A2 限制性表位肽 NS4a_140、NS2a_144、NS5_134 和NS4b_40體外誘導(dǎo)的CTL具有高水平的殺傷活性。實(shí)施例7、藥物組合物配制藥物組合物如下人工合成上述表位肽，將表位肽同弗氏佐劑乳化，即作為候
選疫苗。將疫苗免疫HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠，采用ICS、ELISPOT、CTL殺傷實(shí)驗(yàn)等方法檢測(cè)小 鼠脾細(xì)胞中表位肽特異性CTL的水平以及表位肽特異性CTL對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性。結(jié)果發(fā) 現(xiàn)，上述各表位肽具有良好的免疫原性。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110>溫州醫(yī)學(xué)院
<120>登革病毒特異性HLA-A2限制性表位肽及應(yīng)用<130)092548<160>8<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>9<212>PRT<213>登革病毒<400>1Ala Leu Leu Phe Met lie Leu Thr Val15<210>2<211>9<212>PRT<213>登革病毒<400>2Gln Leu Trp Ala Thr Leu Leu Ser Leu15<210>3<211>9<212>PRT<213>登革病毒<400>3Leu Leu Met Arg Thr Thr Trp Ala Leu15<210>4<211>9<212>PRT<213>登革病毒<400>4Thr Leu Tyr Ala Val Ala Thr Thr Ile15<210>5<211>9<212>PRT<213>登革病毒<400>5Met Leu Leu Ala Leu lie Ala Val Leu15
<210>6<211>9<212>PRT<213>登革病毒<400>6Leu Val Met Ala Phe lie Ala Phe Leu15<210>7<211>9<212>PRT<213>登革病毒<400>7Leu Leu Ala Thr Ser lie Phe Lys Leu15<210>8<211>9<212>PRT<213>登革病毒<400>8Ala Met lie Leu Ser lie Val Ser Leu1權(quán)利要求
一種分離的多肽，其特征在于，所述的多肽是選自如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示氨基酸序列的多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的多肽來源于登革病毒。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸編碼權(quán)利要求1所述的多肽。
4.一種載體，其特征在于，所述載體含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
5.一種遺傳工程化的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞含有權(quán)利要求4所述的載體或其基 因組中整合有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
6.權(quán)利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，用于制備誘導(dǎo)發(fā)生細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng) 的藥物組合物。
7.如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述的細(xì)胞毒性T細(xì)胞是HLA-A2限制性的 細(xì)胞毒性T細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，用于制備預(yù)防或治療登革病毒感染的 藥物組合物。
9.一種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物含有有效量的權(quán)利要求1所述的一種或多種多肽；和藥學(xué)上可接受的載體。
10.一種藥盒，其特征在于，所述的藥盒中含有權(quán)利要求1所述的一種或多種多肽；或 權(quán)利要求9所述的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及登革病毒特異性HLA-A2限制性表位肽及應(yīng)用。本發(fā)明表位肽是DENV-1非結(jié)構(gòu)蛋白來源的、HLA-A2限制性的CTL表位，可誘導(dǎo)高水平的具有殺傷作用的CTL反應(yīng)。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101921310SQ200910053050
公開日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2009年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月15日
發(fā)明者張麗芳, 文金生, 朱珊麗, 李文姝, 段志良, 陳俊 申請(qǐng)人:溫州醫(yī)學(xué)院