專利名稱：dcf-1基因剔除小鼠模型、其構(gòu)建方法及其應(yīng)用的制作方法
dcf-l基因剔除小鼠模型、其構(gòu)建方法及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域本專利涉及一種dcf-l基因剔除小鼠模型、其構(gòu)建方法及其應(yīng)用。 發(fā)明背景神經(jīng)干細胞(Neural stem cell, NSC)是一類可以自我更新復(fù)制，并具有分化成為神經(jīng) 元和膠質(zhì)細胞潛能的細胞。與神經(jīng)干細胞分化相關(guān)的dcf-1基因的高表達有助于干細胞維持 未分化狀態(tài)，而沉默dcf-1基因的表達可以加速神經(jīng)干細胞的分化過程。小鼠已成為研究人類疾病的一種重要模式生物。Cre-loxP系統(tǒng)，己經(jīng)能夠較為容易的實 現(xiàn)基因的敲除從而構(gòu)建基因剔除小鼠模型。動物行為學(xué)及組織化學(xué)的迅速發(fā)展，realtimePCR 之類的高新技術(shù)手段在實驗室中運用，給予了我們從一個生物整體的角度研究基因功能的良 好平臺。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一在于提供一種與神經(jīng)干細胞分化相關(guān)的dcf-1基因剔除小鼠模型。 本發(fā)明的目的之二在于提供該模型的構(gòu)建方法。 本發(fā)明的目的之三在于提供該模型在篩選抗焦慮藥物中的應(yīng)用。 本發(fā)明的目的之四在于提供該模型在制備促進5-羥色胺祌經(jīng)元發(fā)育藥物中的應(yīng)用。 為達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案 一種與神經(jīng)干細胞分化相關(guān)的dcf-1基因剔除小鼠模型。一種構(gòu)建上述的dcf-1基因剔除小鼠模型的方法，其特征在于該方法的具體步驟為利用Cre-loxP系統(tǒng)，將打靶載體電擊轉(zhuǎn)化胚胎干細胞，使其與基因組發(fā)生同源重組。再將胚胎 干細胞移植入胚胎，產(chǎn)生在dcf-1基因的兩側(cè)帶有l(wèi)oxP位點的后代，將這些后代與表達Cre 重組酶的小鼠雜交，就會產(chǎn)生dcf-1基因剔除小鼠模型。上述的dcf-1基因剔除小鼠模型在篩選抗焦慮藥物中的應(yīng)用。上述的dcf-1基因剔除小鼠模型在制備促進5-羥色胺神經(jīng)元發(fā)育藥物中的應(yīng)用。 本發(fā)明通過Cre — loxP系統(tǒng)，構(gòu)建了確為可靠的dcf-1基因剔除小鼠模型。然后通過動物行為學(xué)實驗，發(fā)現(xiàn)dcf-1基因的剔除會導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生焦慮情緒。為了更好的研究dcf-1基因與焦慮之間的關(guān)系，本發(fā)明使用了 realtime PCR技術(shù)和組織化學(xué)等手段，進一步發(fā)現(xiàn)dcf-l基因的剔除會影響5-羥色胺神經(jīng)元的發(fā)育成熟。


圖1為dcf-l基因剔除小鼠構(gòu)建圖，圖中標示小鼠的基因組結(jié)構(gòu)，鑒定方法以及鑒定結(jié) 果。其中A-D分別為野生型小鼠、打靶載體、dcf-1 loxP小鼠和dcf-l剔除小鼠的基因組結(jié) 構(gòu)。E為在基因組水平證實剔除的發(fā)生。F為在表達水平證實剔除的發(fā)生。圖2為dcf-1基因剔除小鼠的行為學(xué)實驗結(jié)果，顯示了嚴重的焦慮傾向。A為進入開放 臂和中央?yún)^(qū)域的次數(shù)。B為在開放臂停留的時間。圖3為dcf-l基因剔除小鼠5-羥色胺神經(jīng)元考察結(jié)果，結(jié)果顯示5-羥色胺神經(jīng)元數(shù)量明 顯減少。A為5-羥色胺神經(jīng)元標志物Pet-l的表達量，C-D分別為野生型、dcf-l+/-和dCf-l-/-小鼠的中縫背核切片。
具體實施方式
實施例一dcf-l基因剔除小鼠模型的構(gòu)建dcf-l基因的剔除可以利用Cre-loxP系統(tǒng)來實現(xiàn)。將打靶載體電擊轉(zhuǎn)化胚胎干細胞，使 其與基因組發(fā)生同源重組。再將胚胎干細胞移植入胚胎，產(chǎn)生在dcf-l基因的兩側(cè)帶有l(wèi)oxP 位點的后代。將這些后代與表達Cre重組酶的小鼠雜交，就會產(chǎn)生dcf-1基因剔除小鼠。通 過基因組PCR， RT-PCR，本發(fā)明驗證了此模型中確實發(fā)生了 dcf-l基因的缺失，結(jié)果如圖1 所示。實施例二 dcf-1基因的功能研究1. 行為學(xué)研究本發(fā)明對dcf-l基因剔除小鼠進行高架十字迷宮行為學(xué)測試。先將小鼠放在 迷宮的中央?yún)^(qū)域，然后觀察小鼠在5分鐘內(nèi)的行為，包括進入進入開放臂和中央?yún)^(qū)域的次數(shù) 以及在開放臂區(qū)域停留的時間。結(jié)果如圖2所示，WT小鼠進入中央?yún)^(qū)域的次數(shù)與Cfcf"+/-和(^/^-/-小鼠的沒有明顯的區(qū)別，說明它們在迷宮中穿梭的頻率基本相當(dāng)，選擇進入開放臂 還是封閉臂的機會也基本相等；但是野生型進入開放臂的次數(shù)高于后兩種基因型，WT小鼠 在開放臂停留的時間也明顯長于cfc/^+Z-和01(;/4-/-小鼠。結(jié)果表明dcf-l基因剔除小鼠物 行為的異常符合公認的焦慮行為特征。2. 5-羥色胺神經(jīng)元考察本發(fā)明針對5-羥色胺神經(jīng)元的標志物Pet-1進行realtime PCR，同 時將dcf-l基因剔除小鼠的腦組織切片并染色，發(fā)現(xiàn)dcf-l基因剔除小鼠的5-羥色胺神經(jīng)元 數(shù)量明顯減少，結(jié)果如圖3所示。神經(jīng)元考察的結(jié)果表明dcf-l基因敲除導(dǎo)致小鼠5-HT神 經(jīng)元明顯減少，是小鼠產(chǎn)生焦慮行為的原因。
權(quán)利要求
1.一種與神經(jīng)干細胞分化相關(guān)的dcf-1基因剔除小鼠模型。
2. —種構(gòu)建根據(jù)權(quán)利要求l所述的dcf-l基因剔除小鼠模型的方法，其特征在于該 方法的具體步驟為利用Cre-loxP系統(tǒng)，將打靶載體電擊轉(zhuǎn)化胚胎干細胞，使 其與基因組發(fā)生同源重組。再將胚胎干細胞移植入胚胎，產(chǎn)生在dcf-l基因的兩 側(cè)帶有l(wèi)oxP位點的后代，將這些后代與表達Cre重組酶的小鼠雜交，就會產(chǎn)生 dcf-l基因剔除小鼠模型。
3. —種根據(jù)權(quán)利要求1所述的dcf-1基因剔除小鼠模型在篩選抗焦慮藥物中的應(yīng) 用。
4. 一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的dcf-1基因剔除小鼠模型在制備促進5-羥色胺神經(jīng)元 發(fā)育藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種與神經(jīng)干細胞分化相關(guān)的基因dcf-1及其應(yīng)用。通過同源重組，胚胎干細胞移植以及Cre-loxP系統(tǒng)，我們得到dcf-1基因剔除小鼠，并且發(fā)現(xiàn)該基因的剔除會導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生焦慮情緒。借助realtime PCR和組織化學(xué)等手段，我們還發(fā)現(xiàn)dcf-1基因剔除會導(dǎo)致Pet-1表達量下調(diào)，影響5-羥色胺神經(jīng)元的發(fā)育。
文檔編號C12N15/85GK101574074SQ200910053359
公開日2009年11月11日 申請日期2009年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月18日
發(fā)明者婕 吳, 文鐵橋, 譚智昊 申請人:上海大學(xué)