專利名稱：提高真菌產(chǎn)酶和次級代謝物的方法
提高真菌產(chǎn)酶和次級代謝物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物、醫(yī)藥和化工技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種利用真菌生產(chǎn)次級代 謝物、蛋白和其它生物活性物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
絲狀真菌作為多種產(chǎn)物的生產(chǎn)菌，廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域，尤其是用于次級代 謝物、蛋白和其它生物活性物質(zhì)，如抗生素、多糖、酶制劑的生產(chǎn)。利用絲狀真菌的生產(chǎn)過程 既有固體、半固體發(fā)酵工藝，也有深層液體發(fā)酵工藝。前兩種工藝可直接利用低值原料，水 和能量輸入少，操作簡單，但生產(chǎn)效率偏低，難于進行規(guī)?；头€(wěn)定的生產(chǎn)；此外，采用固態(tài) 發(fā)酵工藝，氧的傳遞是一個限制因素，不利于需氧量大的產(chǎn)物合成。相比之下，深層液體發(fā) 酵工藝更適合大規(guī)模生產(chǎn)，其傳質(zhì)傳熱效果都遠遠優(yōu)于固態(tài)發(fā)酵，也容易實現(xiàn)生產(chǎn)全過程 的控制。然而，采用深層液體發(fā)酵工藝，由機械攪拌和通氣引起的剪切力會對菌體形態(tài)、生 長和產(chǎn)物合成產(chǎn)生重要的影響，導(dǎo)致生產(chǎn)效率和產(chǎn)量降低。有文獻報道，在利用真菌里氏木 霉(Trichoderma reesei)生產(chǎn)纖維素酶時，由于纖維素酶對剪切力非常敏感，當剪切力增 加時纖維素酶的失活率非常高。目前，針對這一問題的解決方案有兩類一是對反應(yīng)器的改進，包括利用固定床、 滴流床、轉(zhuǎn)鼓式、泡罩塔和氣升式反應(yīng)器等多設(shè)備，同時對攪拌槳的結(jié)構(gòu)和形式進行改進； 二是通過生產(chǎn)過程(工藝)的控制，即控制攪拌速率和通氣量。這些手段雖然可以有效減 少剪切力的形成，但是對于某些真菌的產(chǎn)酶和次級代謝物的生成，仍然有較大的局限，效果 并不十分理想，需要進一步改善和提高。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的、能減少剪切力的形成，降 低其產(chǎn)生的影響、提高真菌發(fā)酵效率生產(chǎn)酶和次級代謝物的方法。為減小剪切力的形成，減少纖維素酶的失活，除了在技術(shù)背景中介紹的兩種解決 方案以外，改變真菌培養(yǎng)基組成——添加剪切力保護劑，減少對發(fā)酵過程的影響，從而提高 酶和次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)率是一種簡單易行的方法。在動植物細胞培養(yǎng)中，葡聚糖、聚乙二 醇、聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆(Plur0niC)F68、血清白蛋白常作為剪切力保護劑添加到培 養(yǎng)基中，其產(chǎn)生的效果取決于剪切力保護劑的物化性質(zhì)、濃度、生產(chǎn)過程、保護機制、菌株和 產(chǎn)物。其中，泊洛沙姆(PluroniC)F68作為剪切力保護劑的主要作用是降低界面張力和阻 遏細胞對氣泡的附著。而關(guān)于泊洛沙姆(Plur0niC)F68在真菌培養(yǎng)過程的作用目前尚未見 有報道。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為—種提高真菌產(chǎn)酶和次級代謝物的方法，其步驟為包括(1)制備孢子液將真菌菌種接種于馬鈴薯/葡萄糖/瓊脂培養(yǎng)基上，在25 30°C 溫度下培養(yǎng)5 7天，孢子形成后，用生理鹽水洗下孢子，其中孢子的數(shù)量可達到107ml，用紗布過濾存放于4°C的冰箱內(nèi)；采用的真菌菌種為土曲霉(Aspergillus terreus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、 變色栓菌(Trametes versicolor)、綠色木霉(Trichoderma viride)絲狀真菌；(2)種子培養(yǎng)將步驟(1)得到的真菌孢子分別接種到種子培養(yǎng)基中，在25 30°C溫度下、150 200rpm搖床中培養(yǎng)16 28小時，得到有眾多菌絲或菌絲球的菌種培養(yǎng) 液；其特征是，(3)發(fā)酵生產(chǎn)將步驟(2)得到的菌種培養(yǎng)液以10 15%的比例接種到添加有剪 切力保護劑的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行酶或代謝物的生產(chǎn)，在28 37°C溫度下、于150 250rpm 搖床中培養(yǎng)4 7天，獲得含有酶或次級代謝物的發(fā)酵液；(4)將含有酶和次級代謝產(chǎn)物的發(fā)酵液進行分離、提取，獲得酶和次級代謝產(chǎn)物。所述的剪切力保護劑選自非離子型表面活性劑。所述的剪切力保護劑為泊洛沙姆(Pluronic) F68。發(fā)酵培養(yǎng)基中添加的剪切力保護劑的濃度為0. 1 3g/L。所述的酶和次級代謝產(chǎn)物主要為纖維素水解酶、木聚糖酶、木質(zhì)素水解酶和洛伐 他丁 (Iovastatin)。所述的酶和次級代謝產(chǎn)物包含抗生素、多糖、酶制劑和其它生物活性物質(zhì)。本發(fā)明提高真菌產(chǎn)酶和次級代謝物的方法的積極效果是(1)將泊洛沙姆(PlUr0niC)F68作為剪切力保護劑用于真菌的培養(yǎng)過程。(2)通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加剪切力保護劑，改善了因攪拌和通氣產(chǎn)生的剪切力 對真菌代謝及產(chǎn)物合成的影響，提高了酶活和次級代謝產(chǎn)物的濃度。(3)提高了工業(yè)化生產(chǎn)中真菌發(fā)酵生產(chǎn)酶和次級代謝產(chǎn)物的效率。

附圖為LiP和MnP生產(chǎn)過程中添加剪切力保護劑的對比圖，圖中， 為LiP酶活，■□為 MnP 酶活，■為添加了 Pluronic F68 的結(jié)果。
具體實施方式以下給出本發(fā)明提高真菌產(chǎn)酶和次級代謝物的方法的4個具體實施例，但本發(fā)明 不限于以下的實施例。實施例1木質(zhì)素水解酶的生產(chǎn)(1)采用變色栓菌(Trametes versicolor)菌株，其編號為中國典型培養(yǎng)物保藏 中心(CCTCC) 5. 48，中國微生物保藏中心等菌株保藏機構(gòu)均可提供；(2)將Iml變色栓菌(Trametes versicolor)菌株的孢子懸液接入土豆/葡萄糖 培養(yǎng)基，在30°C條件下、150 200rpm培養(yǎng)24 28小時，得菌種培養(yǎng)液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)基的組成磷酸二氫鉀2. 0g/L,
4
硫酸銨(MM)2SO41. 4g/L,CaCl2 · 2H200. lg/L,MgSO4 · 7H200. 5g/L,GlucoselOg/L,微量元素溶液I-IOml，維生素Bl0. 001g/L,酒石酸二銨0. 02g/L,泊洛沙姆(Pluronic)F68 0_3g/L ；(4)發(fā)酵條件將步驟(2)得到菌種培養(yǎng)液以10 15%的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基 中，在37°C條件下、于150 200rpm搖床中培養(yǎng)4 7天。(5)酶的分析LiP的酶活分析體系為1. Oml 0. 2M，pH3. 0酒石酸緩沖液(含藜蘆醇0. 8mM和過 氧化氫0. 4mM)和100 μ 1發(fā)酵濾液，反應(yīng)在室溫下進行，并于310nm測定，酶活單位定義為 每分鐘氧化1 μ mol底物為一個酶活單位。MnP的酶活分析體系為1. Oml 0. 2M, pH4. 5酒石酸緩沖液(含0. 2mMMnS04,8mM Guaiacol)和100 μ 1發(fā)酵濾液，反應(yīng)在室溫下進行，并于465nm測定，酶活單位定義為每分 鐘產(chǎn)生1 μ mol為一個單位。
結(jié)果參見附表和附圖 附表.不同濃度添加劑對產(chǎn)酶的影響
Pluronic F68/%LiP/u/L_MnP/u/L
0270393
0.056801050
0. 1630953
0.2550760
_03_480_1032
附圖為LiP和MnP生產(chǎn)過程中添加剪切力保護劑的對比圖。 實施例2纖維素水解酶的生產(chǎn)
(1)采用綠色木霉(Trichoderma viride)菌株，其編號為3. 1912，中國典型培養(yǎng) 物保藏中心(CCTCC)等菌株保藏機構(gòu)均可提供；(2)將Iml綠色木霉(Trichoderma viride)菌株的孢子懸液接入種子培養(yǎng)基，在 30°C條件下、150 200rpm培養(yǎng)16 24小時；(3)發(fā)酵培養(yǎng)基的組成無機營養(yǎng)液KH2PO42. 0g/L,Urea0. 3g/L,(MM)2SO41. 4g/L,
5
CaCl20. 3g/L,MgSO4 · 7H20 0. 3g/L,FeSO4 · 7H20 0. 005g/L,MnSO4 · H2O 0. 0016g/L,ZnSO40. 0014g/L,CoCl20. 002g/L ；在無機營養(yǎng)液的基礎(chǔ)上添加乳糖10g/L，葡萄糖10g/L，Pluronic F68 2g/L ；(4)發(fā)酵條件在28 30°C條件下，于180 220rpm搖床中培養(yǎng)4 5天；(5)酶的分析用20mg新華濾紙為底物，加入pH4. 8,0. IM的檸檬酸緩沖液1ml，再 加稀釋的酶液0. lml，50°C反應(yīng)1小時，用DNS方法測定還原糖，以葡萄糖為標準，每分鐘產(chǎn) 生Img葡萄糖為一個酶活單位。發(fā)酵5天時，纖維素酶活為1. 8IU/ml，是未添加剪切力保護劑的2. 1倍。實施例3木聚糖酶的生產(chǎn)(1)采用黑曲霉(Aspergillus niger)菌株，其編號為3. 3147，中國典型培養(yǎng)物 保藏中心(CCTCC)等菌株保藏機構(gòu)均可提供；(2)將Iml黑曲霉(Aspergillus niger)菌株的孢子懸液接入馬鈴薯/葡萄糖種 子培養(yǎng)基，在30°C條件下、150 200rpm培養(yǎng)16 24小時；(3)發(fā)酵培養(yǎng)基的組成無機營養(yǎng)液KH2PO42. Og/L,(MM)2SO41. 4g/L,CaCl20. 3g/L,MgSO4 · 7H200. 3g/L,FeSO4 · 7H200. 005g/L,MnSO4 · H2O0. 0016g/L,ZnSO40. 0014g/L,CoCl20. 002g/L ；發(fā)酵培養(yǎng)基以無機營養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加蛋白胨lg/L，乳糖10g/L，Pluronic F68lg/L ；(4)發(fā)酵條件在28 30°C條件下，于180 220rpm搖床中培養(yǎng)4 5天；(5)酶的分析取0. 5ml稀釋的粗酶液，加入Iml 0. lmol/L NaAc-HAc緩沖液 (ρΗ4· 8)和 0. 5ml 2% (w/v)木聚糖溶液(0. lmol/L,pH4. 8NaAc_HAc 緩沖液配制)，50°C下 反應(yīng)30分鐘。用DNS法測定木聚糖酶的活力，定義每毫升酶液每分鐘催化木聚糖所產(chǎn)生 的木糖的微摩爾數(shù)為1個酶活力單位。
發(fā)酵5天，酶活檢測為295IU/ml，是未添加Pluronic F68的1. 8倍。實施例4洛伐他丁(Iovastatin)的生產(chǎn)(1)采用土曲霉(Aspergillus terreus)菌株，其編號為CPCC440480，中國典型 培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)等菌株保藏機構(gòu)均可提供；(2)將Iml 土曲霉(Aspergillus terreus)菌株的孢子懸液接入種子培養(yǎng)基，在 28 30°C條件下、150 200rpm培養(yǎng)16 20小時；種子培養(yǎng)基為玉米漿5g/L，酵母抽提物5g/L，豆餅粉5g/L，葡萄糖15g/L，微量元素溶液IOml ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)基的組成乳糖70g/L，玉米漿10g/L，酵母抽提物8g/L，豆餅粉4.2g/L，葡萄糖20g/L，甘油30g/L，Pluronic F680. 5g/L ；(4)發(fā)酵條件在28 30°C條件下，于180 250rpm搖床中培養(yǎng)4 5天；(5)產(chǎn)物分析用純甲醇萃取發(fā)酵液中的產(chǎn)物(比例1 1)，離心收集上清進行 HPLC測定，進樣量20uL。流動相甲醇水(4 1，ρΗ3· 5)，C18柱，紫外檢測(237nm)。檢 測分析發(fā)酵4天的產(chǎn)物，洛伐他丁(lovastatin)濃度達620mg/L，是未添加剪切力保護劑的 1.6 倍。
權(quán)利要求
一種提高真菌產(chǎn)酶和次級代謝物的方法，其步驟為包括(1)制備孢子液將真菌菌種接種于馬鈴薯/葡萄糖/瓊脂培養(yǎng)基上，在25～30℃溫度下培養(yǎng)5～7天，孢子形成后，用生理鹽水洗下孢子，其中孢子的數(shù)量可達到107/ml，用紗布過濾存放于4℃的冰箱內(nèi)；采用的真菌菌種為土曲霉、黑曲霉、變色栓菌、綠色木霉絲狀真菌；(2)種子培養(yǎng)將步驟(1)得到的真菌孢子分別接種到種子培養(yǎng)基中，在25～30℃溫度下、150～200rpm搖床中培養(yǎng)16～28小時，得到有眾多菌絲或菌絲球的菌種培養(yǎng)液；其特征在于，(3)發(fā)酵生產(chǎn)將步驟(2)得到的菌種培養(yǎng)液以10～15％的比例接種到添加有剪切力保護劑的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行酶或代謝物的生產(chǎn)，在28～37℃溫度下、于150～250rpm搖床中培養(yǎng)4～7天，獲得含有酶或次級代謝物的發(fā)酵液；(4)將含有酶和次級代謝產(chǎn)物的發(fā)酵液進行分離、提取，獲得酶和次級代謝產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高真菌產(chǎn)酶和次級代謝物的方法，其特征在于，所述的剪 切力保護劑選自非離子型表面活性劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高真菌產(chǎn)酶和次級代謝物的方法，其特征在于，所述的剪 切力保護劑為泊洛沙姆F68。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的提高真菌產(chǎn)酶和次級代謝物的方法，其特征在于，發(fā)酵培 養(yǎng)基中添加的剪切力保護劑的濃度為0. 1 3g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高真菌產(chǎn)酶和次級代謝物的方法，其特征在于，所述的酶 和次級代謝產(chǎn)物主要為纖維素水解酶、木聚糖酶、木質(zhì)素水解酶和洛伐他丁。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的提高真菌產(chǎn)酶和次級代謝物的方法，其特征在于，所述的 酶和次級代謝產(chǎn)物包含抗生素、多糖、酶制劑和其它生物活性物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明是一種利用真菌生產(chǎn)次級代謝物、蛋白和其它生物活性物質(zhì)的方法，通過(1)孢子液制備、(2)種子培養(yǎng)、(3)發(fā)酵生產(chǎn)、(4)分離提取等步驟獲得酶和次級代謝產(chǎn)物；采用的菌種為土曲霉、黑曲霉、變色栓菌、綠色木霉；發(fā)酵生產(chǎn)中添加非離子型表面活性劑泊洛沙姆F68作為的剪切力保護劑進行酶或代謝物的生產(chǎn)；本發(fā)明的積極效果是通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加剪切力保護劑，改善了因攪拌和通氣產(chǎn)生的剪切力對代謝及產(chǎn)物合成的影響，提高了工業(yè)生產(chǎn)中真菌發(fā)酵生產(chǎn)酶和次級代謝產(chǎn)物的效率。
文檔編號C12R1/885GK101928701SQ20091005365
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月23日
發(fā)明者葉勤, 李志敏, 祖彩霞 申請人:華東理工大學(xué)