專利名稱：：熒光假單胞菌微生物農(nóng)藥的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：-本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥，具體地說(shuō)是一種熒光假單胞菌微生物農(nóng)藥的制備方法。
背景技術(shù)：
：我國(guó)是油菜種植大國(guó)，油菜菌核病是危害油菜生產(chǎn)和產(chǎn)量的最大病害之一，每年我國(guó)因油菜菌核病造成的減產(chǎn)高達(dá)總產(chǎn)量的30%80%?，F(xiàn)有技術(shù)采用農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)防治相結(jié)合的辦法，但是效果都不理想。農(nóng)業(yè)防治治標(biāo)不治本，化學(xué)防治又對(duì)環(huán)境造成污染和危害。當(dāng)代生物農(nóng)藥尤其是微生物農(nóng)藥發(fā)展迅速，目前已有報(bào)道利用盾殼霉、芽孢桿菌等對(duì)油菜菌核病進(jìn)行生物防治。從土壤中篩選放線菌和植物內(nèi)生細(xì)菌yc8能抑制油菜菌核病菌菌絲的生長(zhǎng)和菌核的形成；用油菜內(nèi)生枯草芽孢桿菌BY-2產(chǎn)生的胞外物質(zhì)來(lái)抑制油菜菌核病菌的生長(zhǎng)小面積實(shí)驗(yàn)已取得一定的防治效果。但是在大田推廣實(shí)驗(yàn)時(shí)，因?yàn)榫w活性不穩(wěn)定，使得防治油菜菌核病效果不穩(wěn)定。所以發(fā)展油菜生產(chǎn)，迫切需要開(kāi)發(fā)一種防治效果好、對(duì)環(huán)境無(wú)污染的微生物新農(nóng)藥。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種既能有效防治油菜菌核病，又對(duì)環(huán)境無(wú)污染，同時(shí)制備簡(jiǎn)單、使用方便、對(duì)油菜生長(zhǎng)起促進(jìn)作用的熒光假單胞菌微生物農(nóng)藥的制備方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種熒光假單胞菌微生物農(nóng)藥的制備方法，包括以下步驟(1)取下列重量比物質(zhì)均勻混合，制備液體培養(yǎng)基蛋白胨2份甘油l份K2HP04.3H200.15份MgS047H200.15份蒸餾水96.7份；(2)用移液槍按照1%的接種量將熒光假單胞菌P13菌種接種入液體培養(yǎng)基中，放入恒溫?fù)u床，轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘，振蕩培養(yǎng)24小時(shí)；(3)將振蕩培養(yǎng)后的菌體懸液轉(zhuǎn)入滅菌離心管，置入轉(zhuǎn)速為8000轉(zhuǎn)/分鐘的冷凍離心機(jī)離心10分鐘，沉淀制得P13菌體；(4)配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的羧甲基纖維素鈉溶液，在12rC滅菌30分鐘備用；將硅藻土置入高壓蒸汽滅菌鍋12rC滅菌30分鐘，烘干備用；(5)將步驟(3)制得的菌體用新鮮液體培養(yǎng)基懸浮，加入1%羧甲基纖維素鈉溶液，混合均勻；倒入裝有硅藻土的容器中，攪拌；密封容器，室溫放置1-2天；熒光假單胞菌微生物農(nóng)藥制成；(6)將步驟(5)制得的熒光假單胞菌微生物農(nóng)藥裝入包裝容器，室溫保存。熒光假單胞菌微生物農(nóng)藥的制備方法，實(shí)施要點(diǎn)在于-(1)步驟(2)、(5)在超凈工作臺(tái)中無(wú)菌操作；(2)步驟(5)密封材料為滅菌紗布或橡膠塞；(3)步驟(6)的包裝容器為干燥的塑封袋、塑料瓶、玻璃瓶。本發(fā)明制備方法的實(shí)驗(yàn)室具體操作程序例如1、按照1%接種量用1000微升的移液槍將熒光假單胞菌P13菌株接種入100ml的KMB液體培養(yǎng)基；(KMB液體培養(yǎng)基成分蛋白胨20g，甘油10ml，K2HP04*3H201.5g，MgS04*7H201.5g，蒸餾水1000ml，pH自然)中，放在恒溫?fù)u床里，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。2、在超凈工作臺(tái)中，以無(wú)菌操作方式用移液槍將培養(yǎng)24小時(shí)的菌體懸液轉(zhuǎn)入事先已滅菌過(guò)的離心管中，在將離心管放入冷凍離心機(jī)中離心，轉(zhuǎn)速8000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，沉淀為P13菌體。用無(wú)菌接種環(huán)蘸取少許沉淀，用平板劃線法將其接種至新鮮的KMB固體培養(yǎng)基(KMB固體培養(yǎng)基成分:蛋白胨20g，甘油10ml，K2HP04'3H201.5g，MgS047H201.5g，瓊脂粉15%20%，蒸餾水1000ml，pH自然)上，置于恒溫培養(yǎng)箱中，28°C，培養(yǎng)24小時(shí)，該方法可以檢測(cè)該離心條件是否能獲得活P13菌體，如果培養(yǎng)基上有菌體形成，則證明該離心條件下獲得的是活菌體，若沒(méi)有菌落形成，則說(shuō)明該離心條件不適合獲得活菌體。3、制備農(nóng)藥選用的載體材料是干粉狀白色或灰白色硅藻土，硅藻土先用高壓蒸汽滅菌鍋121°C，滅菌30分鐘，滅菌后烘干備用。助劑材料是羧甲基纖維素鈉(CMC)，將CMC配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的溶液，121°C，滅菌30分鐘后備用。4、在超凈工作臺(tái)中，將離心后的菌體用少許新鮮的KMB液體培養(yǎng)基懸浮后，再加入2滴1%CMC溶液，輕輕振蕩混勻，倒入裝有硅藻土的錐形瓶中，用無(wú)菌玻璃棒攪拌均勻，之后用滅過(guò)菌的八層紗布將錐形瓶瓶口密封，室溫放置1-2天，再轉(zhuǎn)入千燥的塑封袋或干燥的玻璃瓶、塑料瓶中，室溫保存即可。加入新鮮KMB液體培養(yǎng)基的目的是使菌體懸浮，并提供一定的養(yǎng)分，但是加入量不宜過(guò)多，以使最終攪拌均勻后硅藻土不結(jié)團(tuán)塊為標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)室小量制備，用無(wú)菌玻璃棒攪拌；大量生產(chǎn)，用攪拌器攪拌，使硅藻土與菌體充分混勻。本發(fā)明農(nóng)藥抑菌活性測(cè)定程序如下(1)實(shí)驗(yàn)靶標(biāo)油菜菌核病菌(6b7eroz^77&sc7ero"or")由國(guó)家南方農(nóng)藥創(chuàng)制中心(上海)提供；油菜種子油研7號(hào)，購(gòu)于安徽省合肥豐樂(lè)種子有限公司，該品種對(duì)油菜菌核病敏感；(2)儀器設(shè)備電子分析天平、打孔器、脫脂棉、棉線、噴水壺；(3)藥劑處理用分析天平(0.0001g)稱取一定質(zhì)量的干粉狀活體P13農(nóng)藥，加入清水，配制成500倍的稀釋液。(4)實(shí)驗(yàn)方法A、離體葉片實(shí)驗(yàn)從植物園摘取葉位一致、大小相近的新鮮健康油菜葉子，用清水洗凈后放在500倍的農(nóng)藥稀釋液中浸泡10分鐘；將葉片置于鋪有無(wú)菌濕潤(rùn)濾紙的白瓷盆中，并用保鮮膜覆蓋白瓷盆，放在25°C，濕度為90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每5片葉子為一個(gè)處理，各處理3次重復(fù)，3天后用打孔器取油菜菌核病菌菌餅(直徑為6cm)，將有菌絲的一面貼于葉片上端，每天觀察患病情況，對(duì)照組用無(wú)菌水代替500倍的農(nóng)藥稀釋液。B、溫室盆栽實(shí)驗(yàn)在溫室里，挑選粒大飽滿、大小相近、顏色均一的健康油菜種子，不進(jìn)行表面消毒直接播種于塑料花盆中(c^l5cm)，設(shè)置5個(gè)花盆為一個(gè)處理，每盆3株，每個(gè)處理3次重復(fù)。油菜出苗后至一葉期期間，連續(xù)澆灌稀釋500倍的農(nóng)藥稀釋液3次，于四葉期在葉柄與主莖接合處接種油菜菌核病菌菌餅，具體方法是先用清水沖洗葉片、葉柄和主莖，再用無(wú)菌水反復(fù)擦洗葉柄與主莖交匯處，接著用無(wú)菌棉球蘸取稀釋500倍的P13藥劑擦拭，然后用蘸有P13農(nóng)藥稀釋液的棉球包裹葉柄與主莖交匯處，三天后將油菜菌核病菌菌餅(c^6mm)倒貼與此交匯處，用無(wú)菌棉球保濕固定，每天噴水三次保證棉球濕潤(rùn)。3天后觀察病情，對(duì)照組用清水代替農(nóng)藥稀釋液進(jìn)行處理。C、田間實(shí)驗(yàn)挑選粒大飽滿、大小相近、顏色均一的健康油菜種子，不進(jìn)行表面消毒直接播種于上海師范大學(xué)植物園實(shí)驗(yàn)田(2mX8m)中，出苗至一葉期開(kāi)始對(duì)油菜進(jìn)行處理，連續(xù)用500倍的農(nóng)藥稀釋液澆灌幼苗3次，于四至五葉期接種油菜菌核病菌菌餅(方法同溫室實(shí)驗(yàn))，3天后觀察病情，對(duì)照組用清水代替農(nóng)藥稀釋液進(jìn)行處理。熒光假單胞菌活體微生物農(nóng)藥在油菜幼苗期使用，可以增強(qiáng)作物抗油菜菌核病的能力，延遲染病時(shí)間，大大降低植株發(fā)病率，長(zhǎng)期施用可以顯著促進(jìn)作物生長(zhǎng)。熒光假單胞菌活體微生物農(nóng)藥的應(yīng)用價(jià)值(1)防治油菜菌核病熒光假單胞菌活體微生物農(nóng)藥能顯著抑制油菜菌核病菌菌絲的生長(zhǎng)和菌核的形成，施用到田間后，能誘導(dǎo)作物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，增強(qiáng)抵御油菜菌核病的能力，起到預(yù)防和防治油菜菌核病的效果。(2)促進(jìn)作物生長(zhǎng)-作物出苗后施用熒光假單胞菌活體微生物農(nóng)藥，并在整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中多次施用，可以顯著促進(jìn)作物生根和葉片的生長(zhǎng)，進(jìn)而促進(jìn)植株生長(zhǎng)。(3)農(nóng)藥開(kāi)發(fā)成本低熒光假單胞菌活體微生物農(nóng)藥的活性成分是熒光假單胞菌，該菌具有易獲得、易培養(yǎng)、易收集、對(duì)人體及動(dòng)植物無(wú)害的特點(diǎn)，加工農(nóng)藥選用的載體及助劑材料價(jià)格低廉，制備工藝簡(jiǎn)便易行。(4)農(nóng)藥使用操作簡(jiǎn)單熒光假單胞菌活體微生物農(nóng)藥為干粉狀，使用前加水稀釋，采用澆灌和噴灑的方式施用均可。6本發(fā)明的效果通過(guò)實(shí)驗(yàn)室離體葉片實(shí)驗(yàn)、溫室實(shí)驗(yàn)和田間實(shí)驗(yàn)表明熒光假單胞菌活體微生物農(nóng)藥藥效穩(wěn)定，能顯著降低發(fā)病率和病情指數(shù)；與對(duì)照組相比，防治效果高達(dá)80%以上；促進(jìn)油菜生長(zhǎng)作用明顯，能明顯促進(jìn)油菜根系和葉片的生長(zhǎng)。下表是在不同實(shí)驗(yàn)條件下，稀釋500倍的熒光假單胞菌P13活體微生物農(nóng)藥對(duì)油菜菌核病的防治效果及其的使用對(duì)油菜生長(zhǎng)的影響，其中"l"表示先用500倍的農(nóng)藥稀釋液處理，再接種油菜菌核病菌；"2"表示直接用培養(yǎng)24小時(shí)的P13菌體懸液處理，再接種油菜菌核病菌；"3"表示對(duì)照組，即用清水處理后再接種油菜菌核病菌。離體葉片實(shí)驗(yàn)具有快速檢測(cè)的特點(diǎn)，但是實(shí)驗(yàn)易受葉片本身枯萎和葉片保鮮等原因的影響。表中數(shù)據(jù)表明，在短時(shí)間內(nèi)，與對(duì)照組相比，農(nóng)藥稀釋液處理過(guò)的葉片雖然也是全部發(fā)病，但病情嚴(yán)重程度相對(duì)較低，可以起到一定的保護(hù)效果。溫室實(shí)驗(yàn)和田間實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)都說(shuō)明P13活體農(nóng)藥對(duì)油菜菌核病的防治起到了明顯的作用，防治效果都在80%以上。由于使用的是活體農(nóng)藥，P13菌體可以通過(guò)自身在土壤及植物根際定植來(lái)發(fā)揮其對(duì)作物促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，體現(xiàn)在澆灌該農(nóng)藥后，油菜幼苗鮮重明顯增大，幼苗長(zhǎng)葉片的數(shù)目增多，這些都有助于作物產(chǎn)量的提高。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1.具有高效抑制油菜菌核病菌的生長(zhǎng)，防治油菜菌核病效果顯著。2.能促進(jìn)油菜生長(zhǎng)。3.無(wú)毒、無(wú)副作用，人畜安全。4.制備工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)容易、成本低。5.使用方法簡(jiǎn)便。本發(fā)明在世界上首次選用熒光假單胞菌P13菌株，以硅藻土為載體，制備熒光假單胞菌微生物農(nóng)藥，具備新穎性和創(chuàng)造性；本發(fā)明制備的熒光假單胞菌微生物農(nóng)藥在油菜生產(chǎn)中應(yīng)用，可以有效防治油菜菌核病，促進(jìn)作物生長(zhǎng)，提高油菜產(chǎn)量，具有廣泛的實(shí)用性。具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明實(shí)施例1:熒光假單胞菌微生物農(nóng)藥的制備方法步驟如下(1)制備液體培養(yǎng)基，取下列重量比物質(zhì)均勻混合蛋白胨20克;甘油10毫升；K2HP043H201.5克；MgS047H201.5克；蒸餾水1000毫升；(2)在超凈工作臺(tái)中用移液槍將1毫升熒光假單胞菌P13菌懸液接種入100毫升液體培養(yǎng)基中，放入恒溫?fù)u床，轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘，振蕩培養(yǎng)24小時(shí)；(3)將振蕩培養(yǎng)后的菌體懸液轉(zhuǎn)入滅菌離心管，置入轉(zhuǎn)速為8000轉(zhuǎn)/分鐘的冷凍離心機(jī)離心10分鐘，沉淀制得P13菌體；(4)取1克羧甲基纖維素鈉，加入99克蒸餾水中，攪拌均勻，在溫度121。C條件下滅菌30分鐘；(5)取10克白色粉末狀硅藻土置入高壓蒸汽滅菌鍋中，12rC滅菌30分鐘，取出后烘干備用；(6)將步驟(3)制得的菌體用0.51毫升新鮮的液體培養(yǎng)基懸浮，加入1%羧甲基纖維素鈉溶液4滴，混合均勻；倒入裝有硅藻土的三角燒瓶中，用無(wú)菌玻璃棒攪拌；然后用8層滅菌紗布密封瓶口；室溫下放置2天；熒光假單胞菌微生物農(nóng)藥制成。(7)將步驟(6)制得的熒光假單胞菌微生物農(nóng)藥裝入塑料袋每10克1袋，抽真空，塑料袋封口，室溫保存。背負(fù)式噴霧器裝入規(guī)定水位的水，取2袋熒光假單胞菌微生物農(nóng)藥，兌入水中，攪拌；油菜田苗期噴霧l畝。實(shí)施例2:熒光假單胞菌微生物農(nóng)藥的制備方法步驟如下(1)制備液體培養(yǎng)基，取下列重量比物質(zhì)均勻混合蛋白胨40克；甘油20毫升；K2HP04'3H203克；MgS04*7H203克；蒸餾水2000毫升；(2)在超凈工作臺(tái)中用移液槍將10毫升熒光假單胞菌P13菌株接種入IOOO毫升液體培養(yǎng)基中，放入恒溫?fù)u床，轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘，振蕩培養(yǎng)24小時(shí)；(3)將振蕩培養(yǎng)后的菌體懸液轉(zhuǎn)入滅菌離心管，置入轉(zhuǎn)速為8000轉(zhuǎn)/分鐘的冷凍離心機(jī)離心10分鐘，沉淀制得P13菌體；(4)取1克羧甲基纖維素鈉，加入99克蒸餾水中，攪拌均勻，在溫度12rC條件下滅菌30分鐘；配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的羧甲基纖維素鈉溶液備用；(5)取10000克白色粉末狀硅藻土置入高壓蒸汽滅菌鍋，121°。滅菌30分鐘，取出后烘干備用；(6)將步驟(3)制得的菌體用10毫升新鮮的液體培養(yǎng)基懸浮，加入2毫升1%羧甲基纖維素鈉溶液，混合均勻；倒入裝有10000克硅藻土的不銹鋼容器中，攪拌機(jī)攪拌；然后用不銹鋼蓋密封容器；室溫下放置2天；熒光假單胞菌微生物農(nóng)藥制成。(7)將步驟(6)制得的熒光假單胞菌微生物農(nóng)藥裝入塑料袋每10克1袋，塑料袋封口，室溫保存。20公斤塑料水桶裝滿水，取4袋熒光假單胞菌微生物農(nóng)藥，兌入水中，攪拌；油菜田苗期灌根。實(shí)施例3:熒光假單胞菌微生物農(nóng)藥的制備方法步驟如下(1)制備液體培養(yǎng)基，取下列重量比物質(zhì)均勻混合蛋白胨40克；甘油20毫升；K2HP043H203克；MgS047H203克；蒸餾水2000毫升；(2)在超凈工作臺(tái)中用移液槍將10毫升熒光假單胞菌P13菌株接種入1000毫升液體培養(yǎng)中，放入恒溫?fù)u床，轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘，振蕩培養(yǎng)24小時(shí);(3)將振蕩培養(yǎng)后的菌體懸液轉(zhuǎn)入滅菌離心管，置入轉(zhuǎn)速為8000轉(zhuǎn)/分鐘的冷凍離心機(jī)離心10分鐘，沉淀制得P13菌體；(4)取1克羧甲基纖維素鈉，加入99克蒸餾水中，攪拌均勻，在溫度12rC條件下滅菌30分鐘；配制羧甲基纖維素鈉溶液備用；(5)取10000克白色粉末狀硅藻土置入高壓蒸汽滅菌鍋，121'C滅菌30分鐘，取出烘干；(6)將步驟(3)制得的菌體10毫升新鮮的液體培養(yǎng)基懸浮，加入2毫升1%羧甲基纖維素鈉溶液，，混合均勻；倒入裝有10000克硅藻土的不銹鋼容器中，攪拌機(jī)攪拌；然后用不銹鋼蓋密封容器；室溫下放置2天；熒光假單胞菌微生物農(nóng)藥制成。(7)將步驟(6)制得的熒光假單胞菌微生物農(nóng)藥裝入塑料瓶每50克1瓶，蓋緊瓶蓋，室溫保存。100公斤塑料水箱裝滿水，取4瓶熒光假單胞菌微生物農(nóng)藥，兌入水中，攪拌均勻；油菜田溝灌。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、改進(jìn)等，均應(yīng)包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1、一種熒光假單胞菌微生物農(nóng)藥的制備方法，包括以下步驟(1)取下列重量比物質(zhì)均勻混合，制備液體培養(yǎng)基蛋白胨2份甘油1份K2HPO4·3H2O0.15份MgSO4·7H2O0.15份蒸餾水96.7份；(2)用移液槍按照1％的接種量將熒光假單胞菌P13菌種接種入液體培養(yǎng)基中，放入恒溫?fù)u床，轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘，振蕩培養(yǎng)24小時(shí)；(3)將振蕩培養(yǎng)后的菌體懸液轉(zhuǎn)入滅菌離心管，置入轉(zhuǎn)速為8000轉(zhuǎn)/分鐘的冷凍離心機(jī)離心10分鐘，沉淀制得P13菌體；(4)配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的羧甲基纖維素鈉溶液，在121℃滅菌30分鐘備用；將硅藻土置入高壓蒸汽滅菌鍋121℃滅菌30分鐘，烘干備用；(5)將步驟(3)制得的菌體用新鮮液體培養(yǎng)基懸浮，加入1％羧甲基纖維素鈉溶液，混合均勻；倒入裝有硅藻土的容器中，攪拌；密封容器，室溫放置1-2天；熒光假單胞菌微生物農(nóng)藥制成；(6)將步驟(5)制得的熒光假單胞菌微生物農(nóng)藥裝入包裝容器，室溫保存。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光假單胞菌微生物農(nóng)藥的制備方法，其特征在于(1)步驟(2)、(5)在超凈工作臺(tái)中無(wú)菌操作；(2)步驟(5)密封材料為滅菌紗布或橡膠塞；(3)步驟(6)的包裝容器為干燥的塑封袋、塑料瓶、玻璃瓶。全文摘要本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥，一種熒光假單胞菌微生物農(nóng)藥的制備方法。油菜菌核病是危害油菜生產(chǎn)和產(chǎn)量的最大病害之一，現(xiàn)有技術(shù)采用農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和微生物農(nóng)藥防治，效果都不理想。本發(fā)明熒光假單胞菌微生物農(nóng)藥的制備方法步驟如下取蛋白胨、甘油等制備液體培養(yǎng)基；用移液槍將熒光假單胞菌P13菌株接種入液體培養(yǎng)基恒溫振蕩培養(yǎng)；冷凍離心沉淀制得P13菌體；取蛋白胨、甘油、瓊脂等制備固體培養(yǎng)基將P13菌體，接種至固體培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)；加入裝有硅藻土的容器中，攪拌；密封，室溫放置1-2天。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是防治油菜菌核病效果顯著；促進(jìn)油菜生長(zhǎng)；無(wú)毒、副作用，人畜安全；制備工藝簡(jiǎn)單、成本低；使用方法簡(jiǎn)便。文檔編號(hào)C12N1/20GK101606541SQ200910055029公開(kāi)日2009年12月23日申請(qǐng)日期2009年7月17日優(yōu)先權(quán)日2009年7月17日發(fā)明者慧李,明肖申請(qǐng)人:上海師范大學(xué)