專(zhuān)利名稱(chēng)：一種高穩(wěn)定性的重組胰蛋白酶的生產(chǎn)及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種高穩(wěn)定性的重組胰蛋白酶 的生產(chǎn)及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
胰蛋白酶(Trypsin，EC3. 4. 21. 4)在胰臟中以作為酶的前體胰蛋白酶原的形式被 合成，并作為胰液的成分而分泌，受腸激酶的酶解或胰蛋白酶的自身激活成為活性胰蛋白 酶，是肽鏈內(nèi)切酶，它能把多肽鏈中賴(lài)氨酸和精氨酸殘基中的羧基側(cè)切斷。它不僅起消化酶 的作用，而且還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，起活化作用， 是特異性最強(qiáng)的蛋白酶，在蛋白質(zhì)測(cè)序中是重要的工具酶。正是由于胰蛋白酶是活性強(qiáng)的肽鏈內(nèi)切酶，可水解任何暴露在蛋白表面的賴(lài)氨酸 和精氨酸殘基的羧基端形成的肽鍵，包括其自身，所以一般的胰蛋白酶在PH3以上不穩(wěn)定， 會(huì)自身水解。單獨(dú)表達(dá)胰蛋白酶不能獲得有效表達(dá)，因?yàn)槲⒘康幕钚砸鹊鞍酌傅拇嬖诰涂蓪?duì)表 達(dá)宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒性，有人以胰蛋白酶原的形式表達(dá)，胰蛋白酶原相對(duì)于胰蛋白酶，其N(xiāo)端 僅多了 7個(gè)氨基酸，胰蛋白酶原具有少量的活性，所以仍然很難表達(dá)，即使表達(dá)，也是不溶 性的包涵體形式，包涵體的復(fù)性率很低。所以，目前為止，報(bào)道的重組胰蛋白酶的收率均很 低。因此，本領(lǐng)域迫切需要研究開(kāi)發(fā)新的重組胰蛋白酶生產(chǎn)技術(shù)，以期獲得收率高、穩(wěn) 定性高的重組胰蛋白酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高穩(wěn)定性的重組胰蛋白酶的生產(chǎn)方法，所述方法實(shí)現(xiàn) 了重組胰蛋白酶的可溶性表達(dá)和激活。本發(fā)明的另一目的在于提供利用所述的方法生產(chǎn)獲得的重組胰蛋白酶。在本發(fā)明的第一方面，提供一種生產(chǎn)重組胰蛋白酶的方法，所述方法包括(1)重組表達(dá)融合蛋白，所述的融合蛋白序列從N端到C端依次包括40_200個(gè)氨 基酸序列、胰蛋白酶原序列；和(2)切除融合蛋白N端的40-200個(gè)(較佳地為90-200個(gè)，更佳地為100-170個(gè))
氨基酸序列以及前導(dǎo)序列，獲得重組胰蛋白酶。在一個(gè)優(yōu)選例中，步驟(1)中，所述的40-200個(gè)氨基酸序列中包括選自下組的氨 基酸甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、脯氨酸、甲 硫氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、精氨酸、賴(lài)氨酸、組氨酸、谷氨酸或天冬氨酸。在另一優(yōu)選例中，所述的40-200個(gè)氨基酸序列中，不含有2個(gè)或2個(gè)以上半胱氨 酸，或者2個(gè)或2個(gè)以上半胱氨酸之間間隔較少的氨基酸。優(yōu)選2個(gè)或2個(gè)以上半胱氨酸 之間間隔的氨基酸少于10個(gè)，更優(yōu)選少于6個(gè)，更優(yōu)選少于3個(gè)，最優(yōu)地所述氨基酸序列中不含有半胱氨酸。在另一優(yōu)選例中，所述的40-200個(gè)氨基酸序列中含有酸性氨基酸，特別是天冬氨 酸D。較佳地，天冬氨酸D數(shù)目占氨基酸總數(shù)的5%以上，更佳地為7%以上。在另一優(yōu)選例中，所述的40-200個(gè)氨基酸序列中含有盡量少的堿性氨基酸，特別 是堿性氨基酸精氨酸R。在另一優(yōu)選例中，步驟(1)中，所述的40-200個(gè)氨基酸序列是SEQ ID NO :1，SEQ ID NO :3,SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列。更優(yōu)選地，所述的40-200個(gè)氨 基酸序列是SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列。在另一優(yōu)選例中，步驟(2)中，用腸激酶或胰蛋白酶處理(1)獲得的融合蛋白，從 而切除融合蛋白N端的40-200個(gè)氨基酸序列以及前導(dǎo)序列。在另一優(yōu)選例中，用胰蛋白酶處理(1)獲得的融合蛋白的溫度是0-25°C (較佳的 為2-20°C，更佳地為2-10°C，最佳的為4士 1°C )。在另一優(yōu)選例中，步驟(1)中，采用大腸桿菌重組表達(dá)融合蛋白。在另一優(yōu)選例中，在步驟(1)和步驟(2)之間，還包括步驟純化重組表達(dá)獲得的 融合蛋白。在另一優(yōu)選例中，采用離子交換層析法純化所述的融合蛋白，用CaCl2溶液洗脫。在另一優(yōu)選例中，用0 0. 5M CaCl2溶液梯度洗脫。在另一優(yōu)選例中，還包括步驟(3)，利用5士 (w/v)的山梨醇作為保護(hù)劑，凍干 處理所獲得的重組胰蛋白酶。優(yōu)選利用5% (w/v)的山梨醇作為保護(hù)劑。在本發(fā)明的另一方面，提供一種分離的融合蛋白，所述的融合蛋白序列從N端到C 端依次包括40-200個(gè)氨基酸序列、胰蛋白酶原序列。在本發(fā)明的另一方面，提供一種分離的核酸，所述的核酸編碼所述的融合蛋白。在本發(fā)明的另一方面，提供一種表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體含有編碼所述融合蛋 白的核酸。在本發(fā)明的另一方面，提供一種遺傳工程化的細(xì)胞，所述的細(xì)胞含有所述的表達(dá) 載體；或其基因組中整合有編碼所述融合蛋白的核酸。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的融合蛋白或其編碼核酸的用途，用于生產(chǎn)重組 胰蛋白酶。在另一優(yōu)選例中，所述的重組胰蛋白酶穩(wěn)定性強(qiáng)。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn) 的。


圖1、重組胰蛋白酶的可溶性表達(dá)。其中，泳道1，ImM IPTG誘導(dǎo)30min的電泳結(jié) 果；泳道2，ImM IPTG誘導(dǎo)4h的電泳結(jié)果；泳道3，對(duì)細(xì)胞超聲破碎后分離的上清的電泳結(jié)^ ο圖2、重組胰蛋白酶的純化，SDS-PAGE檢測(cè)純化結(jié)果。其中，泳道1，上樣穿出液； 泳道2，平衡液；泳道3，峰1 ；泳道4，峰2 ；泳道5，峰3 ；泳道6，0. 5M CaCl2洗脫液。圖3、酶解4°C，25小時(shí)后獲得的酶解液的電泳鑒定結(jié)果。其中，泳道1是純化后的酶液(融合蛋白)的電泳結(jié)果；泳道2是對(duì)應(yīng)圖2泳道3酶解后的電泳結(jié)果；泳道3是酶解 后的酶解液的電泳結(jié)果。圖4、重組胰蛋白酶應(yīng)用于重組羧肽酶原B的激活(羧肽酶B 胰蛋白酶比例為 100 l(w w))0其中，泳道1為酶解前的羧肽酶原B的復(fù)性液，泳道2，4，6，8，10為重組 胰蛋白酶酶解0. 5h,lh,2h,3h, 4. 5h和7h后的電泳結(jié)果；泳道3，5，7，9，11為豬胰蛋白酶酶 解0. 5h，lh，2h，3h，4. 5h和7h后的電泳結(jié)果。
具體實(shí)施例方式為了解決現(xiàn)有技術(shù)中難以重組表達(dá)胰蛋白酶或表達(dá)效率不高的技術(shù)缺陷，本發(fā)明 人經(jīng)過(guò)深入的研究，出乎意料地找到一種生產(chǎn)高穩(wěn)定性的重組胰蛋白酶的方法。本發(fā)明人 采用一種分子內(nèi)分子伴侶實(shí)現(xiàn)了重組胰蛋白酶在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)，該可溶性表達(dá) 的重組胰蛋白酶在純化激活后獲得了具有很高的酶活性的胰蛋白酶，該法實(shí)現(xiàn)了胰蛋白酶 的重組可溶性生產(chǎn)，且生產(chǎn)的重組胰蛋白酶表現(xiàn)出高的穩(wěn)定性。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原 始環(huán)境即是天然環(huán)境)。例如，活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒(méi)有分離純 化的，但同樣的多聚核苷酸和多肽如果與天然狀態(tài)一起存在的其他物質(zhì)分開(kāi)，則為分離純 化的。如本文所用，所述的“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......構(gòu)
成”、“基本上由......構(gòu)成”、和“由......構(gòu)成”；“主要由......構(gòu)成”、“基本上
由......構(gòu)成”和“由......構(gòu)成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。融合蛋白為了解決活性胰蛋白酶表達(dá)對(duì)宿主毒性而使得宿主菌不能正常生長(zhǎng)，或者解決酶 原形式表達(dá)后形成包涵體形式，從而得到可溶性表達(dá)產(chǎn)物，本發(fā)明人在胰蛋白酶原的N端 增加一段序列，其不僅能夠在和胰蛋白酶共同表達(dá)時(shí)掩蓋胰蛋白酶的活性，使胰蛋白酶高 表達(dá)，同時(shí)可實(shí)現(xiàn)了胰蛋白酶的可溶性表達(dá)，可溶性表達(dá)的融合蛋白經(jīng)純化后，激活可獲得 活性重組胰蛋白酶。因此，本發(fā)明提供一種分離的融合蛋白，所述的融合蛋白序列從N端到C端依次包 括40-200個(gè)氨基酸序列、胰蛋白酶原序列。任何適合的氨基酸序列均可用于與重組胰蛋白酶原連接，用于制備所述的融合蛋 白，只要其具有適當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)度和合適的氨基酸。所述的氨基酸序列通常由40-200個(gè)氨基酸組成，所述的氨基酸優(yōu)選的是非強(qiáng)酸 性的和非強(qiáng)堿性的氨基酸。更優(yōu)選地，所述的氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、 異亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、蘇氨 酸、精氨酸、賴(lài)氨酸、組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的40-200個(gè)氨基酸序列中含有足夠多的酸性氨基 酸，特別是天冬氨酸D。較佳地，天冬氨酸D數(shù)目占氨基酸總數(shù)的5%以上，更佳地為7%以 上。足夠多的天冬氨酸有利于掩蓋胰蛋白酶的活性。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的40-200個(gè)氨基酸序列中含有盡量少的堿性氨基 酸，特別是堿性氨基酸精氨酸R。
所述的胰蛋白酶是一種本領(lǐng)域熟知的蛋白。胰蛋白酶原是胰蛋白酶的前體形式， 例如可參見(jiàn)GenBank登錄號(hào)M27602. 1所示的氨基酸序列(其中第1_16位為信號(hào)肽，第 17-23位為前導(dǎo)肽)，受腸激酶酶解或胰蛋白酶自身酶解可被激活成具有活性的胰蛋白酶。通過(guò)在胰蛋白酶原N端添加適量的氨基酸，可以調(diào)節(jié)胰蛋白酶的折疊聚合性質(zhì)， 在表達(dá)時(shí)掩蓋胰蛋白酶的活性，從而對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)毒性作用，或使其不易于被細(xì)胞內(nèi)的其 它成分所降解。另一方面，本發(fā)明還提供了編碼所述的融合蛋白的分離的核酸，也可以是其互補(bǔ) 鏈。編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR擴(kuò)增的方法獲得。在獲得了編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA序列之后，將其連入合適的表達(dá)載體，再轉(zhuǎn) 入合適的宿主細(xì)胞。最后通過(guò)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞，通過(guò)分離純化得到本發(fā)明的融合蛋 白。因此，本發(fā)明還提供了包含編碼所述融合蛋白的核酸分子的載體。所述的載體還 可包含與所述核酸分子的序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列，以便于所述融合蛋白的表達(dá)。 “操作性相連”或“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線(xiàn)性DNA序列的某些部分能夠影響 同一線(xiàn)性DNA序列其它部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分 泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA ；如果啟動(dòng)子控制序列的 轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操作地連于編碼序列。在本發(fā)明中，任何合適的載體都可以使用，比如一些用于細(xì)菌、真菌、酵母和哺乳 動(dòng)物細(xì)胞的克隆和表達(dá)的載體，如Pouwels等，克隆載體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Elsevier最新版) 中所描述的?？蛇x用本領(lǐng)域已知的各種載體如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將 編碼本發(fā)明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成蛋白表達(dá)載體。在 本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述的載體為原核載體。此外，含有編碼所述融合蛋白的核酸序列的重組細(xì)胞也包括在本發(fā)明中。在本發(fā) 明中，所述的“重組細(xì)胞”通常是原核細(xì)胞。常用的原核細(xì)胞包括大腸桿菌、枯草桿菌等；優(yōu) 選的可為大腸桿菌細(xì)胞(E. coli)，如大腸桿菌HMS174(DE3)、或BL21 (DE3)。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原 核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理， 所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的 方法進(jìn)行。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，以表達(dá)所述的融合蛋白。根據(jù)所用的宿主細(xì) 胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。可利用所述融合蛋白的物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化 重組的蛋白。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽 析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過(guò)濾)、吸附層析、離子交換層 析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。優(yōu)選地，采用離子 交換層析的方法進(jìn)行分離純化，并用CaCl2濃度梯度洗脫代替?zhèn)鹘y(tǒng)的NaCl梯度洗脫。利用 CaCl2進(jìn)行洗脫比NaCl洗脫可使得獲得的胰蛋白酶更穩(wěn)定。優(yōu)選的CaCl2洗脫的濃度范圍 為0 0. 5M。生產(chǎn)重組胰蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)重組胰蛋白酶的方法，所述方法包括(1)重組表達(dá)融合 蛋白，所述的融合蛋白序列從N端到C端依次包括40-200個(gè)氨基酸序列、胰蛋白酶原序 列；和(2)切除融合蛋白N端的40-200個(gè)氨基酸序列以及前導(dǎo)序列，獲得重組胰蛋白酶。本發(fā)明的方法的特點(diǎn)是先在胰蛋白酶原的N端添加40-200個(gè)氨基酸的序列，在 重組表達(dá)獲得融合蛋白后，將位于N端的40-200個(gè)氨基酸以及胰蛋白酶原的前導(dǎo)肽(7個(gè) 氨基酸，序列為PFDDDDK(SEQ ID NO 8))切除，得到高活性的胰蛋白酶。切除步驟可在重組 表達(dá)獲得融合蛋白后即刻進(jìn)行；當(dāng)然，也可保存所獲得的融合蛋白，在需要使用活性的胰蛋 白酶時(shí)再進(jìn)行切除?；谝鹊鞍酌冈瓉?lái)切除前導(dǎo)肽，以獲得活性胰蛋白酶的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟 知的，通常采用一些適合的蛋白內(nèi)切酶。優(yōu)選地，采用腸激酶或胰蛋白酶處理所述的融合蛋 白，從而切除融合蛋白N端的40-200個(gè)氨基酸序列以及前導(dǎo)序列。腸激酶(Enterokinase，EK)是一種識(shí)別Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO 9)序 列的蛋白酶，專(zhuān)一性地在Lys的C端水解多肽。通常，腸激酶的適用溫度和PH值較寬，如溫 度可在4-45°C，pH范圍可在4-10。利用胰蛋白酶處理所述的融合蛋白也可切除前導(dǎo)序列，基于自身激活作用，其能 夠識(shí)別Lys和Arg，在它們的羧基端切開(kāi)。獲得的重組胰蛋白酶可通過(guò)凍干的方法保存，采用的凍干保護(hù)基優(yōu)選的為5%的 山梨醇，其保護(hù)效果良好，還有促進(jìn)酶活的效果。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)采用本發(fā)明的方法，可實(shí)現(xiàn)重組胰蛋白酶的可溶性生產(chǎn)，克服了以往表達(dá)過(guò)程 中其難以可溶性表達(dá)而包涵體表達(dá)復(fù)性率低的技術(shù)難題，大大提高了表達(dá)的收率。(2)采用本發(fā)明的方法，生產(chǎn)的重組胰蛋白酶表現(xiàn)出高的穩(wěn)定性，液體狀態(tài)下放置 2個(gè)月活性穩(wěn)定。解決了胰蛋白酶液體因自身降解不穩(wěn)定的問(wèn)題。該重組胰蛋白酶可用于 重組胰島素、重組羧肽酶B、蛋白測(cè)序等方面。(3)本發(fā)明的方法獲得的重組胰蛋白酶具有和提取的胰蛋白酶相同的活性，可替 代提取的胰蛋白酶用于蛋白或多肽的生產(chǎn)中，經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾后可替代提取胰蛋白酶用于細(xì)胞培養(yǎng)。(4)本發(fā)明的方法獲得的重組胰蛋白酶在較寬的PH范圍內(nèi)均穩(wěn)定，一般的胰蛋白 酶在PH3條件下才穩(wěn)定，而本發(fā)明獲得的重組胰蛋白酶在中性PH或弱堿性條件下也是穩(wěn)定 的。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和 份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所 述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1、融合蛋白(N端159個(gè)氨基酸+人胰蛋白酶原)的可溶性表達(dá)
在人胰蛋白酶原(GenBank :M27602. 1，第17-247位(即不包括前導(dǎo)肽之前的信號(hào) 肽))的N端添加由159個(gè)氨基酸組成的多肽，其序列為(SEQ ID NO=D MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTA PKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVRGSGMKETAAAKFERQH MDSPDLGTENLYFQS其中，含有天冬氨酸(D) 12個(gè)。設(shè)計(jì)以下引物正向;aaggatccAAAATCGTGGGTGGTTAC(SEQ ID NO:6)；反向ccAAGCTTTTAAGAGTTAGCAGCGA(SEQID NO 7)；以人胰腺cDNA文庫(kù)為模板，用前述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得人胰蛋白酶原的編碼序 列。前述獲得的序列用Hindi II/BamHI酶切后插入到pET32a表達(dá)載體(購(gòu)自 Invitrogen)的相應(yīng)位點(diǎn)中，在對(duì)應(yīng)胰蛋白酶原N端的編碼序列之前插入前述159個(gè)氨基酸 的編碼序列，獲得用于表達(dá)的融合蛋白的編碼序列。測(cè)序鑒定獲得正確插入的重組表達(dá)載 體。將該重組表達(dá)載體常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α (BL21(DE3))，獲得轉(zhuǎn)化子。挑取轉(zhuǎn)化平板上的單克隆菌落，接種至30mL LB培養(yǎng)液中(含100 μ g/mLAmp)， 置于37°C搖床過(guò)夜培養(yǎng)(10 12h)后，以2%接種量轉(zhuǎn)入二級(jí)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。菌密度 至0D600 0. 5 0. 6時(shí)，于37°C和12°C下分別加入終濃度0. 5mmol/L IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)， IOOOOrpm離心收集菌體，棄上清，菌體超聲破碎，離心后獲得含有前導(dǎo)序列_胰蛋白酶原融 合蛋白的上清。蛋白表達(dá)情況見(jiàn)圖1，其中，泳道1為ImM IPTG誘導(dǎo)30min的電泳結(jié)果；泳道2為 ImM IPTG誘導(dǎo)4h的電泳結(jié)果；泳道3為對(duì)細(xì)胞超聲破碎后分離的上清的電泳結(jié)果。實(shí)施例2、實(shí)施例1獲得的融合蛋白的純化將前述誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體超聲破碎后收集的上清作為上樣液，以純化重組融合蛋 白。用2 X 15cm層析柱，離子交換柱事先用20mM Tris-HCl，pH 8. 0的緩沖液平衡，然 后上清液上樣，用相同的緩沖液平衡至基線(xiàn)平穩(wěn)后，用含O-IM NaCl或0 0.5M CaCl2梯 度洗脫，分部收集，測(cè)定每管的0D280和酶活，把有酶活的收集液合并，測(cè)總酶活和總蛋白 含量。合并酶活高的收集管，即得純化的活性重組胰蛋白酶。收集的純化液采用SDS-PAGE檢測(cè)純化結(jié)果，見(jiàn)圖2。其中，泳道1為上樣穿出液； 泳道2為平衡液；泳道3為峰1 ；泳道4為峰2 ；泳道5為峰3 ；泳道6為0. 5M CaCl2洗脫液。 從分子量可知，融合重組蛋白集中在峰4洗脫液中。經(jīng)鑒定，純化后可得到較純化前純度提高2-3倍的融合蛋白。實(shí)施例3、激活條件利用豬胰腺胰蛋白酶(購(gòu)自Sigma公司)對(duì)前述純化獲得的融合蛋白進(jìn)行酶解 激活，以獲得有活性的重組胰蛋白酶。其中，加入的豬胰腺胰蛋白酶的量為豬胰腺胰蛋白 酶融合蛋白(w w) = 1 1000。激活后，獲得去除了 N端融合的氨基酸以及位于N端 的7個(gè)氨基酸的活性的重組胰蛋白酶。酶解條件如表1。
圖3為酶解4°C，25小時(shí)后獲得的酶解液的電泳鑒定結(jié)果。其中，泳道1是純化后 的酶液(融合蛋白)的電泳結(jié)果；泳道2是對(duì)應(yīng)圖2泳道3酶解后的電泳結(jié)果；泳道3是酶 解后的酶解液的電泳結(jié)果。酶解后測(cè)定重組胰蛋白酶的活性。測(cè)定的方法如下測(cè)活采用BAEE法(底物BAEE 購(gòu)自Sigma)，具體方法根據(jù)Sigma規(guī)定的測(cè)定胰蛋白酶的方法。NaCl洗脫后的樣品的激活結(jié)果如表1，可見(jiàn)在4°C下酶解25小時(shí)可獲得活性很高 的胰蛋白酶，高溫不利于酶的激活。CaCl2洗脫后的樣品的激活結(jié)果如表2，可見(jiàn)CaCl2洗脫后的樣品在4°C下酶解25 小時(shí)可獲得活性很高的胰蛋白酶，高溫不利于酶的激活。比較表1和表2，可知，CaCl2對(duì)重組融合蛋白酶的激活有很好的作用，激活作用可 提高9倍。表INaCl洗脫后的樣品的激活
權(quán)利要求
一種生產(chǎn)重組胰蛋白酶的方法，其特征在于，所述方法包括(1)重組表達(dá)融合蛋白，所述的融合蛋白序列從N端到C端依次包括40 200個(gè)氨基酸序列、胰蛋白酶原序列；和(2)切除融合蛋白N端的40 200個(gè)氨基酸序列以及前導(dǎo)序列，獲得重組胰蛋白酶。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的40-200個(gè)氨基酸序列中 包括選自下組的氨基酸甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、 組氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、精氨酸、賴(lài)氨酸、組氨酸、谷 氨酸或天冬氨酸。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的40-200個(gè)氨基酸序列是 SEQ ID NO :1，SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :4 或 SEQ ID NO 5 所示的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，用腸激酶或胰蛋白酶處理(1) 獲得的融合蛋白，從而切除融合蛋白N端的40-200個(gè)氨基酸序列以及前導(dǎo)序列。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，采用大腸桿菌重組表達(dá)融合蛋白。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(1)和步驟(2)之間，還包括步驟 純化重組表達(dá)獲得的融合蛋白。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，采用離子交換層析法純化所述的融合蛋白， 用CaCl2溶液洗脫。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括步驟(3)，利用5士1%(w/v)的山梨 醇作為保護(hù)劑，凍干處理所獲得的重組胰蛋白酶。
9.一種分離的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白序列從N端到C端依次包括: 40-200個(gè)氨基酸序列、胰蛋白酶原序列。
10.一種分離的核酸，其特征在于，所述的核酸編碼權(quán)利要求9所述的融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高穩(wěn)定性的重組胰蛋白酶的生產(chǎn)及應(yīng)用。公開(kāi)了一種生產(chǎn)重組胰蛋白酶的方法，所述方法包括(1)重組表達(dá)融合蛋白，所述的融合蛋白序列從N端到C端依次包括40-200個(gè)氨基酸序列、胰蛋白酶原序列，所述融合蛋白為可溶性表達(dá)；和(2)切除融合蛋白N端的40-200個(gè)氨基酸序列以及前導(dǎo)序列，獲得重組胰蛋白酶。采用本發(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)了胰蛋白酶的可溶性表達(dá)，可獲得具有高活性、高穩(wěn)定性的胰蛋白酶。
文檔編號(hào)C12N9/96GK101967469SQ20091005549
公開(kāi)日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2009年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月28日
發(fā)明者馮矗, 趙致 申請(qǐng)人:上海雅心生物技術(shù)有限公司