專利名稱：乙肝病毒拉米夫定耐藥變異株的檢測探針及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及乙肝病毒拉米夫定耐藥變異株的檢測探針及慢性乙肝患 者使用拉米夫定抗病毒治療后耐藥情況的臨床監(jiān)測。
背景技術(shù)：
以拉米夫定(lamivudine，LAM)為代表的核苷類似物類抗乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus,HBV)藥物的臨床應(yīng)用是慢性乙型肝炎治療史上的里程碑。迄今為止， 已經(jīng)有100多萬慢性乙型肝炎患者接受了拉米夫定治療，使慢性乙型肝炎的治療取得了巨 大的進(jìn)步。抗HBV藥物的廣泛應(yīng)用在為慢性乙型肝炎患者(chronic hepatitis B,CHB)帶 來福音的同時，也帶來了嚴(yán)重的耐藥問題。例如拉米夫定治療1 4年的耐藥率可分別高 達(dá)14%、38%、49%和66%。引起HBV對拉米夫定耐藥主要原因是在HBV的聚合酶基因的 逆轉(zhuǎn)錄B區(qū)的180位氨基酸由亮氨酸(L)替換成了蛋氨酸(M)和C區(qū)的204位氨基酸由蛋 氨酸M替換成了纈氨酸(V)或異亮氨酸(I)。即造成YIDD或YVDD變異，LAM與其的結(jié)合 力就會下降，導(dǎo)致HBV對LAM產(chǎn)生耐藥性。除了 YMDD變異之外，在LAM選擇壓力下，還會在 YMDD基序之外出現(xiàn)補(bǔ)償性變異。目前，國內(nèi)尚無同時用于多個變異位點檢測的試劑盒。為 此，我們研發(fā)了液相芯片(Multi-Analyte Suspension Array，多功能懸浮點陣儀)技術(shù)，可 快速、簡便和高通量地檢測LAM耐藥變異株。對于LAM耐藥相關(guān)性變異的檢測，除了 DNA測序分析之外，國外報道可使用聚合 酶鏈反應(yīng)_限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)、INNO-LiPA探針檢測法、特異性PCR 及固相芯片等方法。測序分析方法需要昂貴的測序儀，檢測過程耗時較長，且只有當(dāng)病毒 群中HBV變異株至少占30%以上時(通常需50 %以上)，才能檢測到變異株，用于變異株 的早期檢測有較大的局限性；基于PCR-RFLP的方法可能一次只能檢測一種類型的變異；而 INNO-LiPA探針檢測法雖然靈敏度較高，但檢測成本較高，且操作復(fù)雜耗時，檢測通量較低， 同時價格昂貴，推廣應(yīng)用受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種乙肝病毒拉米夫定耐藥變異株的檢測探針及相應(yīng)的乙 肝病毒拉米夫定相關(guān)變異應(yīng)用檢測方法。本發(fā)明提供了一種乙肝病毒拉米夫定耐藥變異株的檢測探針，該檢測探針可以是 SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID N016、SEQ ID NO 17、 SEQ ID NO 18或者SEQ ID NO 19中的一種或者幾種。較好的，該探針由SEQ ID NO 12、SEQID NO 13、SEQ ID NO 14中的一種或者幾種 和 SEQID NO 15, SEQID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18 或者 SEQ ID NO 19 中的一種 或者幾種組成。將序列SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14中的一種寡聚核苷酸 分子與序列如 SEQID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18 或者 SEQ ID NO 19中的一種寡聚核苷酸分子組合，進(jìn)行檢測可同時獲得兩個耐藥性位點的測試結(jié)果，能夠更準(zhǔn)確地獲得樣本的拉米夫定耐藥性特征。本發(fā)明的探針也可由SEQ ID NO 12,SEQ ID NO 13,SEQ ID NO 14,SEQ IDNO 15、 SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18 和 SEQ ID NO 19 全部八種寡核苷酸分子組 成。同時使用八種寡核苷酸分子作為檢測探針，不僅能準(zhǔn)確地獲得樣本的拉米夫定耐藥性 特征，而且可以確定乙肝病毒拉米夫定耐藥變異株的類型。上述這些探針可以根據(jù)其核苷酸編碼序列，采用化學(xué)合成方法，也可以采用從乙 肝病毒拉米夫定耐藥變異株的基因組DNA通過多次PCR獲得。本發(fā)明還提供了將該檢測探針用于確定乙肝病毒拉米夫定耐藥變異株方面的應(yīng)
用。
實際應(yīng)用中，可以將本發(fā)明的乙肝病毒拉米夫定耐藥變異株檢測探針與液相芯片 技術(shù)結(jié)合。液相芯片技術(shù)(MASA)是美國納斯達(dá)克上市公司Luminex研制出的新一代生物芯 片技術(shù)平臺，它既能為后基因組時代科學(xué)研究提供強(qiáng)大的技術(shù)支持，又能提供高通量的新 一代分子診斷技術(shù)平臺。其技術(shù)原理是用聚苯乙烯制成的大小均一的圓形小球(微球)， 直徑在IOnm IOOOum之間，按照不同的比例摻入兩種不同的紅色分類熒光，將微球進(jìn)行染 色，使每個微球都有了一個特定的光譜地址。將不同的探針分別以共價方式結(jié)合到不同的 具有特定顏色的微球上，然后和待測樣品進(jìn)行液相雜交，再將微球成單列通過Luminex平 臺的檢測通道，用兩束不同顏色的激光進(jìn)行掃描，一束激光檢測特定光譜地址的微球，確定 探針的種類；另一束激光檢測微球上探針信號的強(qiáng)弱，以確定靶基因的含量。所得到的數(shù)據(jù) 經(jīng)電腦處理后可以直接用來判斷樣本中是否含有某種特定的變異位點及靶基因相對含量。 利用上述系統(tǒng)可同時完成上百種變異的檢測，并可以同時檢測96個樣本；從標(biāo)本采集、DNA 抽提到檢測完畢，僅需5-7小時即可完成。和固相芯片方法相比，它具有以下優(yōu)點1.重復(fù) 性好；2.敏感性高；3.靈敏度好；4.特異性高因為只讀微粒上的信號；5.檢測迅速液相 懸浮雜交比固相擴(kuò)散雜交快；6.價格低設(shè)備和試劑的價格都低于芯片；7.檢測結(jié)果易分 析。本發(fā)明中確定乙肝病毒拉米夫定耐藥變異株的方法包括如下步驟(1)將探針與微球結(jié)合；(2)擴(kuò)增樣本核酸序列中拉米夫定耐藥位點；(3)將(1)所得的產(chǎn)物與(2)的產(chǎn)物雜交，根據(jù)雜交反應(yīng)結(jié)果判斷樣本的拉米夫定 耐藥性。上述步驟(1)中，較好的是探針中每一種特定寡聚核苷酸與特定微球結(jié)合。雜交 后，通過檢測微球的種類就能夠確定寡聚核苷酸的種類。所述的微球也可以由類似大小的顆粒狀物質(zhì)代替。顆粒狀物質(zhì)的直徑可以采用 10-1000 μ m。如果需要采用兩種及兩種以上的微球置于同一反應(yīng)液中，可以將微球偶聯(lián)歐 聯(lián)不同的顯色劑或者熒光物質(zhì)進(jìn)行區(qū)分，通過檢測微球在一定條件下的顯色或者所發(fā)射的 熒光就可以確定微球的種類。通常采用有機(jī)材料制作微球，例如本發(fā)明實施例中的聚苯乙 烯。也可以采用其它帶有羧基功能基團(tuán)的材料制作微球，以便偶聯(lián)探針。也可以修飾探針， 以便其能與微球較好偶聯(lián)。步驟(2)中，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增。進(jìn)行PCR反應(yīng)在拉米夫定耐藥 位點相應(yīng)的核苷酸編碼序列的上游和下游設(shè)計引物，從而擴(kuò)增樣本中拉米夫定耐藥位點相
RTSlRTASlRTS2RTAS2
應(yīng)序列。所用的弓I物可以按照常規(guī)方法設(shè)計，例如采用下表的引物。引物序列
名稱序列(5’ 一3’ ) 5’ -CTAGGACCCCTGCTCGTGTT-3’ (SEQ ID NO 20) 5， -GCAAACCCCAAAAGACCCA-3， (SEQID NO 21) 5’ -ATTCCTATGGGAGTGGGCCT-3(SEQ ID NO 22) 5’ -Biotin-CCCAAAAGACCCACAATTCG-3(SEQ ID NO 23)步驟(3)中，根據(jù)雜交后微球所結(jié)合探針的種類和數(shù)量判斷樣本的拉米夫定耐藥 性。雜交過程中，通常在PCR產(chǎn)物、探針或者微球上有顯色或者熒光標(biāo)記物，用于識別。雜 交后，洗去未結(jié)合的PCR產(chǎn)物，重懸反應(yīng)液中的微球，然后檢測所結(jié)合探針種類甚至數(shù)量即 可分析樣本的拉米夫定耐藥性。上述的拉米夫定耐藥位點是HBV RT區(qū)的第180位或者第250位氨基酸殘基，變異 株的密碼子突變詳見表1。本發(fā)明具體涉及建立一種快速、準(zhǔn)確測定乙型肝炎病毒拉米夫定相關(guān)耐藥變異株 檢測系統(tǒng)，可用于臨床標(biāo)本的檢測。在NA治療之前進(jìn)行檢測，有助于針對性地選用合適的 NA和療效預(yù)測，節(jié)約治療成本。在治療過程中對HBV不同變異株進(jìn)行監(jiān)測，將有助于早期發(fā) 現(xiàn)基因型耐藥，并及時給予更換或加用其他NA，防止出現(xiàn)病毒學(xué)突破及臨床耐藥，阻止由耐 藥所引起的療效喪失和病情的惡化，提高療效?？傊?，敏感、特異的NA變異株檢測系統(tǒng)的建 立將有助于針對性地選用NA，使乙肝的治療個體化，優(yōu)化治療方案，提高我國慢性乙肝治療 的整體水平。本方法可以根據(jù)患者血液甚至體液，判斷患者體內(nèi)是否存在拉米夫定耐藥變異 株，以決定是否需及時調(diào)整治療藥物找到合適的治療方案，從而實現(xiàn)臨床常見HBV耐藥位 點的檢測，并為臨床抗病毒治療提供一定的參考。具體而言，本發(fā)明的檢測方法可以通過以下方案進(jìn)行1.基本原理用聚苯乙烯制成的大小均一的圓形小球(微球，購自Luminex公 司)，直徑在IOnm IOOOum之間，按照不同的比例摻入兩種不同的紅色分類熒光，將微球進(jìn) 行染色，使每個微球都有了一個特定的光譜地址。2.探針的設(shè)計、合成與固定(1)探針是針對不同的基因突變位點而設(shè)計的特異性序列，主要包括拉米夫定常 見的兩個耐藥位點(rtl80和rt204位氨基酸)，通過分析我國不同地區(qū)乙肝患者(包括治 療和未治療的患者)血清標(biāo)本中HBV RT區(qū)的核苷酸序列，進(jìn)一步了解自然變異情況以及拉 米夫定誘導(dǎo)的核苷酸變異情況，以確保本檢測系統(tǒng)的準(zhǔn)確性，使之適合于不同的地區(qū)、種族 和基因型的患者。通過對GenBank中HBVRT區(qū)核苷酸多態(tài)性分析RT180和RT204位的自然 變異情況，從而設(shè)計耐藥相關(guān)型核苷酸變異，包括同義突變(見表1)；(2)突變位點盡可能位于探針的中間，探針長度21bp左右，雜交溫度54°C (見表 2)。(3)不同光譜地址的微球與以上特定的探針偶聯(lián)，因微球的主要化學(xué)成分為聚苯 乙烯，其表面修飾的羧基功能集團(tuán)在一定條件下可以共價結(jié)合任何含有氨基的目標(biāo)分子， 故通過設(shè)計探針的5’端氨基修飾，它就可以和微球表面的羧基等基團(tuán)偶聯(lián)并能與被檢測物
5特異性結(jié)合，每種微球可固定結(jié)合一種探針，使每個微球都結(jié)合IO5個探針。3.靶基因的擴(kuò)增①由于拉米夫定耐藥相關(guān)性突變主要集中在HBV RT區(qū)第180位到第250位氨基 酸之間，故把選定此段序列作為PCR擴(kuò)增的靶基因。②設(shè)計、合成上述靶基因擴(kuò)增的引物，并對下游引物進(jìn)行生物素標(biāo)記，使得擴(kuò)增的 PCR產(chǎn)物都標(biāo)記有生物素，便于后繼的熒光檢測。③在檢測低病毒載量的臨床標(biāo)本時，可在此對引物的內(nèi)側(cè)再設(shè)計一對套式引物， 用于變異株的定性檢測。4.基于液相芯片技術(shù)的HBV耐藥變異株定性上機(jī)檢測(即檢測整個病毒群有無某 種變異株)①在96孔板中分別加入生物素化的PCR產(chǎn)物及變性液，在每個孔中加入2000個 微球及雜交液，在54°C下，懸液中微球上的探針與PCR產(chǎn)物雜交結(jié)合。②經(jīng)過幾次洗滌，洗去未結(jié)合的PCR產(chǎn)物，在每個孔中都加入鏈霉素_藻紅蛋白報 告分子(SAPE)顯色。緊接著離心、洗滌，將微球重懸。 ③在Luminex平臺檢測每個孔中微球的信號(隨機(jī)讀取100個微球)，當(dāng)微球成單 列通過Luminex平臺的檢測通道時，用兩束不同顏色的激光進(jìn)行掃描，一束激光檢測特定 光譜地址的微球，確定探針的種類；另一束激光檢測微球上探針信號的強(qiáng)弱，判斷有無變異 株(針對每種類型的變異株，電腦都會獲得一組數(shù)據(jù))。而Luminex系統(tǒng)會自動將100個微 球讀取結(jié)果的中位數(shù)作為輸出結(jié)果。本發(fā)明具有以下優(yōu)點1.本發(fā)明的拉米夫定耐藥相關(guān)HBV突變位點的檢測可以監(jiān)測臨床上CHB抗病毒的 治療，該方法特異性高、靈敏度好、檢測通量大、速度快，微球直徑很小、容易混懸在液體中， 反應(yīng)快速、充分、需要時間短，雜交后無需洗脫，可同時檢測約96種變異情況和96個臨床樣 本，因此可同時設(shè)計其他核苷類似物(阿德福韋和恩替卡韋等)特異性耐藥探針，與特異微 球混合后直接加入整個體系后雜交，整個雜交過程約1-2小時可以完成，不需要芯片制作 等其他繁瑣過程；2.本發(fā)明的芯片MASA檢測臨床LAM耐藥CHB標(biāo)本結(jié)果顯示(表4)，MASA可同時 檢測rtl80和rt204氨基酸變異，并能準(zhǔn)確判斷變異的類型及混合變異；用此方法對25例 LAM耐藥的CHB患者相關(guān)耐藥位點的檢測發(fā)現(xiàn)有15例樣本與20411探針雜交信號明顯升高 (陰性和陽性熒光值中位數(shù)分別為5和106)，有11例樣本與204V探針雜交信號較高(陰 性和陽性熒光值中位數(shù)分別為9和114) (Z值=-4. 588和-4. 520,P < 0. 05差異有統(tǒng)計學(xué) 意義)；有2例發(fā)現(xiàn)與以上兩種探針雜交信號均很高，即有YIDD和YVDD混合變異株存在； 僅有一例樣本與20412探針雜交信號明顯較高。同樣用該方法檢測20例未治療患者的血 清標(biāo)本，均未發(fā)現(xiàn)LAM相關(guān)性變異。芯片檢測結(jié)果與常規(guī)測序結(jié)果的符合率為100%，即本 方法特異性可達(dá)100%，但該方法較測序法敏感，可以檢測到常規(guī)測序無法檢測到的混合變 異，如可同時檢測到Y(jié)IDD合并YVDD混合變異類型，而常規(guī)測序通常只能檢測到混合變異中 比例較高的變異；3.該方法具有很高的靈敏度，當(dāng)病毒群中含有大于5%的某種LAM耐藥相關(guān)HBV 變異株時，即可被本方法檢測到(附圖)，微球表面積大，單個微球可結(jié)合多達(dá)約(1 2) Xl06個目標(biāo)分子，探針和熒光信號強(qiáng)度高，兩束激光同時分別檢測微球分類熒光(特異 性)和報告熒光(敏感性)，只有與分類熒光同時出現(xiàn)的報告熒光信號才被檢測記錄，信噪 比高，只需極少量PCR產(chǎn)物(5ul)就可以檢測。4.本發(fā)明操作簡單、經(jīng)濟(jì)，便于臨床大樣本的應(yīng)用，液相芯片技術(shù)洗脫步驟的減少 使操作省時、省力，能同時進(jìn)行多種突變的檢測而樣品用量極少，同時試劑用量少，節(jié)約成 本，提高了效率。5.從臨床標(biāo)本處理、PCR擴(kuò)增、上機(jī)檢測到獲得檢測結(jié)果僅需5-7小時的時間，可 大大縮短的診斷時間，為患者的救治贏得寶貴時間。


圖1-圖4是變異株質(zhì)粒敏感性檢測圖(圖中變異株占病毒群的比例分別為0%、 5%、10%、20%、40%、60%、80%和100% ；野毒株占病毒群的比例分別為100%、95%、 90%、80%、60%、40%、20%和 0% ) 。
具體實施例方式本發(fā)明方法所采用儀器包括1. 10 μ 1,100 μ 1,200 μ 1 及 1000 μ 1 單通道可調(diào)移液器，10 μ 1,200 μ 1 八通道可
調(diào)移液器各一把2. Luminex 100分析儀及配套設(shè)備，Luminex version 1. 7以上版本軟件3. PCR 儀(PTC-100，Bio-Rad 公司)、電泳儀，電泳槽4.高速離心機(jī)，配備96孔板水平轉(zhuǎn)頭5.水浴鍋實施例1乙肝病毒拉米夫定耐藥變異株的檢測探針的確定本發(fā)明利用生物信息學(xué)確定乙肝病毒拉米夫定耐藥位點如表1所示，在HBV的RT 區(qū)180位、204位及其附近的核苷酸序列。表1構(gòu)建的HBV全基因質(zhì)粒RT區(qū)180位、204位及其附近的核苷酸序列
權(quán)利要求
乙肝病毒拉米夫定耐藥變異株的檢測探針，其特征在于，所述的檢測探針是SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ IDNO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18或者SEQ ID NO 19中的一種或者幾種。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測探針，其特征在于，該探針由SEQID NO 12,SEQ ID NO 13、 SEQ ID NO 14 中的一種或者幾種和 SEQ ID NO 15,SEQ ID N016、SEQ ID NO 17,SEQ ID NO 18或者SEQ ID NO 19中的一種或者幾種組成。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測探針，其特征在于，該探針由SEQID NO 12,SEQ ID NO 13、 SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18 和 SEQ ID NO 19八種寡核苷酸分子組成。
4.權(quán)利要求1所述檢測探針的應(yīng)用，其特征在于，將該檢測探針用于確定乙肝病毒拉 米夫定耐藥變異株。
5.權(quán)利要求1所述檢測探針的應(yīng)用方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)將探針與微球結(jié)合；(2)擴(kuò)增樣本核酸序列中拉米夫定耐藥位點；(3)將(1)所得的產(chǎn)物與(2)的產(chǎn)物雜交，根據(jù)雜交反應(yīng)結(jié)果判斷樣本的拉米夫定耐藥性。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，探針中每一種特定寡聚核苷酸與特定微球結(jié)合。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(2)中采用聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(3)中根據(jù)雜交后微球所上探針的種類 和數(shù)量判斷樣本的拉米夫定耐藥性。
9.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的拉米夫定耐藥位點是HBVRT區(qū)的第 180位或者第250位氨基酸殘基。
全文摘要
本發(fā)明屬醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及乙肝病毒拉米夫定耐藥變異株的檢測探針及其應(yīng)用方法。本發(fā)明的乙肝病毒拉米夫定耐藥變異株的檢測探針，是SEQ ID NO12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQIDNO 17、SEQ ID NO 18或者SEQ ID NO 19中的一種或者幾種。將本發(fā)明的檢測探針與液相芯片技術(shù)結(jié)合，可以快速、準(zhǔn)確確定樣本的乙肝病毒拉米夫定耐藥性，特異性高、靈敏度好、檢測通量大，大大節(jié)約了確定耐藥變異株種類所需的成本。
文檔編號C12R1/93GK101988130SQ20091005583
公開日2011年3月23日 申請日期2009年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月3日
發(fā)明者劉紅艷, 夏佳慧, 尹永喜, 張繼明, 李義良, 李新艷, 毛日成, 范麗麗 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院