專利名稱：米多霉素生物合成基因簇的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域的基因簇，具體是一種米多霉素生物合成基因簇。
背景技術(shù)：
核苷類抗生素是一類通常由微生物次級(jí)代謝產(chǎn)生的，在結(jié)構(gòu)上含有修飾的核苷和 核苷酸的分子的總稱。它們具有廣泛的生物活性，包括抗細(xì)菌、抗真菌、抗線蟲、抗腫瘤、 抗病毒、除草、免疫刺激和免疫抑制等活性(J. Antibiot. (1998)41,1711-39)。米多霉素 (mildiomycin)是由生裂鏈輪絲菌(Sti^ptoverticilliumrimofaciens)產(chǎn)生的一種水溶 性堿性抗生素(J. Antibiot. (1978) 31，511-8)，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上包括一個(gè)5-羥甲基胞嘧啶 (自然界中僅發(fā)現(xiàn)存在于T偶數(shù)噬菌體的DNA中)、一個(gè)特殊的帶有Y-羥化的胍基和一個(gè) 帶有絲氨酸殘基的4-氨基-吡喃-3-烯部分(J. Am. Chem. Soc. (1978) 100，4895-7)，屬于 核苷類抗生素(結(jié)構(gòu)見圖1)。米多霉素并不像其它核苷類和氨基糖苷類抗生素那樣容易 通過(guò)細(xì)胞膜，它作用機(jī)制在于能夠抑制蛋白質(zhì)合成中肽鍵的轉(zhuǎn)移(J.Antibiot. (1985)38， 415-9)。米多霉素對(duì)多數(shù)細(xì)菌和真菌都有抑制活性，尤其對(duì)植物白粉病具有強(qiáng)烈的抑制活 性。白粉病是由子囊菌綱白粉菌目(Erysiphales)白粉菌引起的植物真菌性病害。白粉 菌能侵染650多種單子葉植物和9000多種雙子葉植物。目前用于防治白粉病的主要是三 唑類化學(xué)農(nóng)藥，然而，化學(xué)農(nóng)藥對(duì)人類的可持續(xù)發(fā)展的危害日益引起關(guān)注(農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)， (2001) 3，12-8)。米多霉素低毒高效的特點(diǎn)成為良好的抑制植物白粉病的農(nóng)藥。目前，市場(chǎng) 上銷售的是日本武田藥業(yè)(TAKADA)生產(chǎn)的米多霉素可濕性粉劑，由于價(jià)格較高，多用于防 治高檔觀賞植物的白粉病原菌。Kishimoto等人研究發(fā)現(xiàn)，在亞鐵離子存在的情況下，培養(yǎng)基中添加適當(dāng)?shù)臒o(wú)機(jī) 磷酸鹽能夠提高米多霉素的產(chǎn)量(J.Antibiot. (1996)49,775-80) ；Sawade等通過(guò)用環(huán)絲 氨酸(D-Cycloserine)誘變，并在含氨蝶呤(aminopterin)的平板上進(jìn)行篩選米多霉素 高產(chǎn)菌株，得到了產(chǎn)量是原始菌株2. 6倍的高產(chǎn)突變株(J.Antibiot. (1997)50,206-11)。 通過(guò)原生質(zhì)體融合等手段，徐志南教授得到了一株突變株Sv.rimofaciens ZJU5119，其 米多霉素產(chǎn)量比出發(fā)菌株ZD615提高了 170%，達(dá)到了 1015mg/L(浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(工學(xué) 版)(2006)40,1262-6)。Sawada等在Sv. rimofaciens的培養(yǎng)基中添加5-羥甲基胞嘧 啶，5-甲基胞嘧啶(5-methyl-cytosine)、5_ 溴胞嘧啶(5-bromo-cytosine)、5_ 碘胞嘧啶 (5-iodo-cytosine)和5_氟胞嘧啶(5_fluoro-cytosine)，能夠分別得到一系列對(duì)應(yīng)的米 多霉素衍生物(J. Ferment. Technol. (1984) 62，537-43)。通過(guò)改變發(fā)酵條件，我們前期還在 生裂鏈輪絲菌ZJU5119分離到去羥甲基米多霉素、去羥基米多霉素和去羥基去羥甲基米多 霉素(上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(2009)43,1-4)。通過(guò)DNA重組技術(shù)可以對(duì)抗生素化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，提高效價(jià)、擴(kuò)大抗菌譜、降低 毒性，同時(shí)對(duì)調(diào)節(jié)基因的遺傳工程改造還可以提高抗生素的產(chǎn)量，這方面的先驅(qū)Hopwood 等利用來(lái)自不同鏈霉菌菌株的結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)移產(chǎn)生出新的雜合的抗生素(Nature (1985) 314， 642-4)。由于抗生素生物合成的相關(guān)基因，包括結(jié)構(gòu)基因，抗性基因以及調(diào)節(jié)基因一般都成簇存在(Annu. Rev. Microbiol. (1989) 43，173 06)。我們以生裂鏈輪絲菌ZJU5119產(chǎn)生的米多霉素為目標(biāo)分子，從克隆其生物合成基因簇出發(fā)，闡明了合成米多霉素的基因簇。經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，尚未見到有關(guān)于米多霉素生物合成基因簇的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種米多霉素生物合成基因簇。本 發(fā)明提供了米多霉素生物合成相關(guān)的所有基因和蛋白信息，為生物合成米多霉素和遺傳改 造提供了基礎(chǔ)；本發(fā)明的米多霉素生物合成基因簇及其蛋白可廣泛用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)和醫(yī)藥 領(lǐng)域。本發(fā)明是通過(guò)以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明涉及一種米多霉素生物合成基因簇，其序列如SEQID NO 1所示。所述米多霉素生物合成基因簇包含16個(gè)基因結(jié)構(gòu)基因11 個(gè):milA, milB, milC, milD, milE, milG, milH, milj, milM, milN 和 milQ ；其中所述基因milA，位于SEQ ID NO 1的第6125 7126位，所述基因milB，位于SEQ ID NO 1的第7252 7761位，所述基因milC，位于SEQ ID NO 1的第7906 9165位，所述基因milD，位于SEQ ID NO 1的第9185 10369位，所述基因milE，位于 SEQ ID NO :1 的第 10380 11198 位，所述基因milG，位于 SEQ ID NO 1 的第 11627 12631 位，所述基因milH，位于 SEQ ID NO 1 的第 12729 14948 位，所述基因milJ，位于 SEQ ID NO 1 的第 16202 17152 位，所述基因milM，位于 SEQ ID NO 1 的第 19548 20714 位，所述基因milN，位于 SEQ ID NO 1 的第 20710 21483 位，所述基因milQ，位于 SEQ ID NO 1 的第 25168 25935 位；調(diào)節(jié)基因2個(gè)milK和milO ；其中所述基因milK，位于 SEQ ID NO 1 的第 17152 18477 位，所述基因mi 10，位于 SEQ ID NO 1 的第 23289 22222 位；抗性基因1個(gè)milP，所述基因milP，位于SEQ ID NO 1的第23298 24878位；其他基因2個(gè)milF、milI ；其中所述基因milF，位于 SEQ ID NO :1 的第 11194 11664 位，所述基因mill，位于 SEQ ID NO 1 的第 14948 16027 位。所述11個(gè)結(jié)構(gòu)基因編碼的蛋白具體為所述基因milA編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO :2所示，該蛋白為CMP羥甲基轉(zhuǎn)移 酶；所述基因milB編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO 3所示，該蛋白為CMP/羥甲基水 解酶；所述基因milC編碼的蛋白的序列如SEQID NO :4所示，該蛋白為胞嘧啶/羥甲基胞嘧啶葡萄糖醛酸合成酶；所述基因milD編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO :5所示，該蛋白為degT/dnrT/ eryCl/strS氨基轉(zhuǎn)移酶；所述基因milE編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO :6所示，該蛋白為氨基糖苷類磷酸轉(zhuǎn)移酶；所述基因milG編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO 8所示，該蛋白為RadicalSAM蛋 白；所述基因milH編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO 9所示，該蛋白為連接酶；所述基因milj編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO :11所示，該蛋白為精氨酸羥化酶；所述基因milM編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO :14所示，該蛋白為Asp/Tyr/Aro 氨基轉(zhuǎn)移酶；所述基因milN編碼的蛋白的序列如SEQID NO :15所示，該蛋白為二氫二吡啶甲酸 合酶；所述基因milQ編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO :18所示，該蛋白為氨基糖苷磷酸 轉(zhuǎn)移酶。所述2個(gè)調(diào)節(jié)基因編碼的蛋白具體為所述基因milK編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO 12所示，該蛋白為 Majorfacilitator superfamily =ICj^S[=| ；所述基因milO編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO 16所示，該蛋白為L(zhǎng)uxR家族調(diào)節(jié)蛋白。所述1個(gè)抗性基因編碼的蛋白具體為所述基因milP編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO 17所示，該蛋白為 ABCtransporter。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果利用本發(fā)明的基因簇可實(shí)現(xiàn)以下 目的包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆DNA可用于從生 裂鏈輪絲菌(Sv. rimofaciens ZJU5119)基因組文庫(kù)中定位更多的文庫(kù)質(zhì)粒。這些文庫(kù)質(zhì) 粒至少包含本發(fā)明中的部分序列，也包含有基因組中以前臨近區(qū)域未克隆的DNA。包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被修飾或突變。這 些途徑包括插入、置換或缺失、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、錯(cuò)誤介導(dǎo)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、位點(diǎn)特異性 突變、不同序列的重新連接、序列的不同部分或其它來(lái)源的同源序列進(jìn)行定向進(jìn)化(DNA Shuffling)，或提供紫外線或化學(xué)試劑誘變等。包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以提供合 適的表達(dá)體系在外源宿主中表達(dá)以得到相應(yīng)的酶或其它更高的生物活性物質(zhì)及產(chǎn)量。這些 外源宿主包括鏈霉菌、大腸桿菌、芽孢桿菌、酵母、植物和動(dòng)物等。包含本發(fā)明所提供的氨基酸序列或至少部分序列可以用來(lái)分離所需要的蛋白質(zhì) 并可用于抗體的制備。包含本發(fā)明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些 氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物學(xué)活性，或者提高了產(chǎn)量或優(yōu)化了蛋白動(dòng)力學(xué)特征或其它致力于得到的性質(zhì)。包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在異源宿主中表達(dá)并通過(guò)DNA芯片技術(shù)了解它們?cè)谒拗鞔x鏈中的功能。包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列編碼的蛋白可以催化合成羥甲基胞嘧啶葡萄糖醛酸，進(jìn)一步催化合成抗生素-米多霉素。包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通過(guò)遺傳重組來(lái)構(gòu)建質(zhì)粒以獲得新型生物合成途徑，也可以通過(guò)插入、置換、缺失或失活進(jìn)而 獲得新型生物合成途徑。包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因或DNA片段可以通過(guò)中斷米多霉素生物合成的一個(gè)或幾個(gè)步驟而得到新的米多霉素結(jié)構(gòu)類似物或前 體。包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以用來(lái)提高米多霉素或其衍生物的產(chǎn)量，例如增加正調(diào)節(jié)基因的拷貝數(shù)或增強(qiáng)其表達(dá)以及負(fù)調(diào)節(jié)基因的敲除 等。本發(fā)明提供了在基因工程微生物中提高產(chǎn)量的途徑。總之，本發(fā)明提供了米多霉素生物合成相關(guān)的所有基因和蛋白信息，為生物合成 米多霉素和遺傳改造提供了基礎(chǔ)；本發(fā)明的米多霉素生物合成基因簇及其蛋白可廣泛用于 農(nóng)業(yè)、工業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域。


圖1為米多霉素和去羥甲基米多霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖；圖2生裂鏈輪絲菌產(chǎn)生米多霉素及去羥甲基米多霉素的LC-MS檢測(cè)結(jié)果圖；圖3為米多霉素的異源表達(dá)示意圖；圖4為米多霉素生物合成基因簇邊界的確定示意圖；圖5為與米多霉素生物合成的相關(guān)基因分析示意圖；圖6為MilC蛋白催化胞嘧啶葡萄糖醛酸和羥甲基胞嘧啶葡萄糖醛酸的合成示意 圖；圖7為MilG蛋白負(fù)責(zé)4’ -酮基羥甲基胞嘧啶葡萄糖醛酸的合成示意圖；圖8為推導(dǎo)的米多霉素生物合成途徑示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用 于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例 如 Sambrook 等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York Co Id SpringHarbor Laboratory Press， 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。以下結(jié)合圖1 8對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明圖1中米多霉素R = CH2OH ；去羥甲基米多霉素R = H(1)米多霉素的發(fā)酵及LC-MS檢測(cè)將米多霉素的產(chǎn)生菌生裂鏈輪絲菌ZJU5119接種到TSBY(10. 3%蔗糖)培養(yǎng)基 于含有彈簧的三角瓶中30°C培養(yǎng)6天。調(diào)節(jié)發(fā)酵液ph至5，離心取上清進(jìn)行LC-MS檢測(cè)，所用儀器為安捷倫公司的Agilent IlOOseries LC/MSD Trap system。采用Agilent TC-C18(5ym，4. 6X25(kim反向柱，流動(dòng)相為IOm M三氯乙酸(Sigma公司)/HPLC級(jí)乙腈 (Merck公司)(92 8，ν/ν)，流速為0. 3ml/min。質(zhì)譜檢測(cè)是在離子阱的正離子模式下進(jìn) 行。干燥氣流為81/min，噴霧器壓力為40psi。干燥氣溫為325°C。多級(jí)質(zhì)譜斷裂分析轟擊 電壓在1.0 1.8V之間。以米多霉素標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)自武田藥業(yè)公司)為對(duì)照，結(jié)果見圖2，可 見生裂鏈輪絲菌ZJU5119不僅能夠產(chǎn)生米多霉素，同時(shí)能夠產(chǎn)生米多霉素的衍生物_去羥 甲基米多霉素。(2)米多霉素的異源表達(dá)利用來(lái)自殺稻瘟菌素生物合成基因簇上的胞嘧啶核苷單磷酸水解酶基因blsM及其同源基因設(shè)計(jì)兼并引物，從生裂鏈輪絲菌ZJU5119的基因組文庫(kù)中篩選出六個(gè)相互重疊 的包含有blsM同源基因的科斯質(zhì)粒。基因敲除milA和milB證明了它們是合成米多霉素 生物合成的必須基因。將包含milA和milB基因的一個(gè)科斯質(zhì)粒14A6提供原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 的方式轉(zhuǎn)入到鏈霉菌模式菌株變鉛青鏈霉菌1326 (Str印tomyces Iividans 1326)中，并將 轉(zhuǎn)化子在YEME培養(yǎng)基中(Difco酵母提取粉3g、Difco蛋白胨5g、0xoid麥芽糖3g、葡萄糖 10g、蔗糖340g、蒸餾水1000ml，滅菌后補(bǔ)加2ml 2 5M MgCl2)發(fā)酵6天。生物測(cè)定將指示菌紅酵母接種到10. 3% YEME液體培養(yǎng)基中，30°C搖床(220rpm/ min)培養(yǎng)約24小時(shí)，離心收集菌體，用LB培養(yǎng)基洗滌一次，融化PDA培養(yǎng)基并冷卻至50°C 左右，每20ml培養(yǎng)基中加入100 μ 1上述指示菌，立即混勻后倒入培養(yǎng)皿，使其凝固。收集 20 μ 1發(fā)酵液，利用滅菌后的牛津杯放置在制備好的含紅酵母指示菌的PDA平板上，30°C培 養(yǎng)1 2天后觀察指示菌生長(zhǎng)被抑制的結(jié)果。HPLC-MS分析將收集的發(fā)酵液用草酸調(diào)節(jié)pH 5. 0，12, OOOg離心5分鐘，用陽(yáng)離 子交換小柱(Supelclean LC-SCX，500mg/3ml，Supelco公司)處理上清。小柱先用3ml 甲醇活化，上樣后分別用2ml純水和2ml 0. 5%氨水洗滌，最后收集3%氨水洗脫組份供 測(cè)定分析。在檢測(cè)米多霉素中所用的高壓液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用是安捷倫公司的Agilent IlOOseries LC/MSD Trap system。采用 AgilentTC_C18 (5 μ m，4· 6X 250mm)反向柱，流動(dòng)相 為IOm M三氯乙酸(Sigma公司)/HPLC級(jí)乙腈(Merck公司)(92 8，ν/ν)，流速為0. 3ml/ min。質(zhì)譜檢測(cè)是在離子阱的正離子模式下進(jìn)行。干燥氣流為81/min，噴霧器壓力為40psi。 干燥氣溫為325°C。多級(jí)質(zhì)譜斷裂分析轟擊電壓在1. 0 1. 8V之間。如圖3A所示，指示菌為紅酵母，I米多霉素；II和III分別是從兩個(gè)攜帶14A6的變 鉛青鏈霉菌的發(fā)酵提取物；IV從攜帶空載體的變鉛青鏈霉菌的發(fā)酵提取物；科斯質(zhì)粒14A6 的變鉛青鏈霉菌1326的轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液和米多霉素標(biāo)準(zhǔn)品一樣產(chǎn)生了抑菌圈，而空載體的 轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵液不能夠產(chǎn)生抑菌圈。圖3B為米多霉素和14A6和空載體的變鉛青鏈霉菌轉(zhuǎn) 化子在YEME培養(yǎng)基中的發(fā)酵提取物的HPLC圖譜；顯示了 14A6的變鉛青鏈霉菌轉(zhuǎn)化子發(fā)酵 液提取物中的米多霉素的峰，而空載體的轉(zhuǎn)化子沒(méi)有此峰。這樣通過(guò)生物測(cè)定和HPLC-MS的數(shù)據(jù)證明了科斯質(zhì)粒14A6能夠賦予變鉛青鏈霉 菌1326米多霉素的生產(chǎn)能力，也就表明了 14A6包含了米多霉素生物合成所必須的全部功 能基因。(3)米多霉素生物合成基因簇的邊界確定突變株LL2 (敲除milA)喪失了生產(chǎn)米多霉素的能力，僅能夠產(chǎn)生去羥甲基米多霉素，證明了 milA是必須基因，因此對(duì)其上游基因進(jìn)行了敲除，通過(guò)篩選得到了生裂鏈輪絲 菌突變株LL4 (敲除orf-1的突變株)和LL23 (敲除orf-5至orf_l的突變株)，生物測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明它們?nèi)匀荒軌虍a(chǎn)生米多霉素，因此米多霉素生物合成基因簇的上游邊界確定 在orf-Ι和miIA之間。LLl7 (敲除orf+Ι至orf+2的突變株)、LL18 (敲除orf+3至orf+6 的突變株)和LL9((敲除orf+7的突變株)的生測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明它們?nèi)匀荒軌蛘．a(chǎn)生米 多霉素；(見圖4A LL4 敲除orf-Ι的突變株；LL23 敲除orf-Ι至orf-5的突變株；LL17 敲除orf+Ι至orf+2的突變株；LL18 敲除orf+3至orf+6的突變株；LL9 敲除orf+7的突 變株；WT 野生型；CK 瓊脂塊對(duì)照)；而milQ的突變株LLll喪失了生產(chǎn)米多霉素的能力(圖4B，從下至上分別為米多霉素；生裂鏈輪絲菌野生型ZJU5119和生裂鏈輪絲菌LLll :milQ突變株發(fā)酵液的HPLC圖 譜)。因此，把米多霉素生物合成基因簇下游邊界確定在milQ和orf+Ι之間。這樣，米多霉 素的生物合成基因簇就確定在milA至milQ范圍內(nèi)。(4)米多霉素生物合成基因簇的功能分析通過(guò)對(duì)生裂鏈輪絲菌ZJU5119的米多霉素生物合成基因簇上的基因進(jìn)行系統(tǒng)的 敲除和各個(gè)突變株的發(fā)酵產(chǎn)物檢測(cè)，這些基因在米多霉素生物合成中的相關(guān)可通過(guò)圖5所 示的內(nèi)容闡述，其中，結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因和抗性基因等用不同的顏色表示。+表示基因的 敲除喪失了米多霉素的生產(chǎn)能力；-表示基因敲除對(duì)米多霉素的生產(chǎn)沒(méi)有影響；/表示基因 的敲除降低了米多霉素的產(chǎn)量。包括相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因11個(gè)(包括milA、milB、milC、milD、 milE、milG、milH、milj、milM、milN、和milQ)，它們的突變株喪失了米多霉素的生產(chǎn)能力； 負(fù)責(zé)米多霉素生物合成的調(diào)節(jié)基因(milO和milK)，LuxR家族的調(diào)節(jié)蛋白MilO的突變株樣 喪失了米多霉素的生產(chǎn)能力，而主要易化家族蛋白MilK突變株的米多霉素產(chǎn)量降低；米多 霉素生物合成的抗性基因milP的突變株不能夠生產(chǎn)米多霉素；功能未知的基因milF、milI 和milL，其中敲除milL的突變株仍然能夠正常的產(chǎn)生米多霉素，而敲除milF和mill突變 株喪失了米多霉素的生產(chǎn)能力，這說(shuō)明了 milF和mill和米多霉素生物合成的相關(guān)性，證明 了它們是米多霉素生物合成基因簇的一部份。(5)體外反應(yīng)進(jìn)一步證明MilC的功能MilC是由463個(gè)氨基酸編碼的蛋白質(zhì)，序列比對(duì)的結(jié)果顯示它和殺稻瘟菌素生物 合成中的 BlsD(AAP03118)具有一定的同源性(Identities = 144/338(42% )，Positives =180/338(53% ), e-value = 2e_49)，BlsD被認(rèn)為是一種UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)在殺 稻瘟菌素生物合成中cytosylglucuronic acid (CGA)的合成，稱之為CGA合成酶。Guo等在 1991年發(fā)現(xiàn)S :griseochromogenes中存在著催化胞嘧啶和UDP葡萄糖醛酸合成CGA的酶， 并在1994年從菌體中純化了 CGA合成酶，研究發(fā)現(xiàn)，UDP-葡萄糖(UDP-glucose)、UDP-半 乳糖(UDP-galactose)和 UDP-半乳糖醛酸(UDP-galacturonic acid)都不是 CGA 的合適 底物，同時(shí)除了胞嘧啶外，腺嘌呤(adenine)、尿嘧啶(uracil)、4_硝基酚(4-nitrophenol) 和α-萘酚(α-naphthol)都不是合適的糖基配體。Cone等在分析殺稻瘟菌素生物合成 基因簇的時(shí)候發(fā)現(xiàn)，把包含blsD的6 5kb DNA片段克隆到pIJ702上，并在S =Iividans 中表達(dá)，有胞嘧啶存在條件下，能夠產(chǎn)生CGA，表明BlsD就是Guo等人純化的CGA合成酶。 然而，Guo等人純化的CGA合成酶大小是43kD與通過(guò)氨基酸序列計(jì)算出的Bl sD大小 34 5kD 并不一致[J =Bacteriol 1994 (176) 1282-6 ；ChemBioChem 2003(4) :821_9]。通過(guò)MilC做BLASTP僅能找到BlsD，并且在保守域的搜索中也沒(méi)有如何結(jié)果。于是我們采用 了 PSI-BLAST。Position specific iterative BLAST (PSI-BLAST)是位點(diǎn)特異的迭代blast 搜索，主要針對(duì)蛋白序列。第一次blast搜索后，結(jié)果中最相似的序列重新構(gòu)建PSSM(位 點(diǎn)特異性打分矩陣)，然后再使用該矩陣進(jìn)行第二輪blast搜索，再調(diào)整矩陣，搜索，如此迭 代。最終高度保守的區(qū)域就會(huì)得到比較高的分值，而不保守的區(qū)域則分?jǐn)?shù)降低，趨近O。這 樣可以提高blast搜索的靈敏度。在檢索結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)了一些相似的N-己酰氨基葡萄 糖轉(zhuǎn)移酶(N-acetylglucosaminyl transferase)序列，這讓我們相信MilC可能與CGA合 成有關(guān)(UDP-葡萄糖醛酸為底物)，負(fù)責(zé)糖基的轉(zhuǎn)移。盡管UDP-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶在哺 乳動(dòng)物的異生物質(zhì)代謝(Xenobiotic metabolism)中非常普遍，在真菌中也有發(fā)現(xiàn)，但在細(xì) 菌中卻很少報(bào)道。
敲除milC的突變株喪失了米多霉素的生產(chǎn)能力，證明了它的必要性。為了進(jìn)一步 研究milC的確切功能，進(jìn)行了蛋白的表達(dá)和純化，我們把MilC基因克隆到原核表達(dá)載體 pET28a+上，并在大腸桿菌中進(jìn)行超表達(dá)。然而，幾乎所有的重組蛋白均以包含體形式存在。 經(jīng)過(guò)復(fù)性純化后得到了可溶的重組MilC蛋白，如圖6A所示，其中，MW:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)； 泳道1 透析后重新折疊的可溶性蛋白；泳道2 從可溶性蛋白中純化的MilC。分別以胞嘧啶和羥甲基胞嘧啶為底物，分析它們?cè)贛ilC的催化下與UDP-葡萄糖 醛酸(UDP-glucoronic acid)的作用，結(jié)果見圖6B，(以失活的MilC作為對(duì)照)。在A中， 經(jīng)過(guò)30分鐘的溫浴，做為對(duì)照的加入煮沸失活的MilC的HPLC圖譜顯示仍然只有底物胞 嘧啶和UDP-葡萄糖醛酸(下部)，而在上部的HPLC圖譜中可以發(fā)現(xiàn)，不僅存在著胞嘧啶和 UDP-葡萄糖醛酸，而且出現(xiàn)了兩個(gè)產(chǎn)物UDP和cytosylglucuronic acid (CGA)，它們的保留 時(shí)間，紫外吸收和MS都與標(biāo)準(zhǔn)品一致。在B中，經(jīng)過(guò)30分鐘的溫浴，做為對(duì)照的加入煮沸 失活的MilC的HPLC圖譜顯示仍然只有底物羥甲基胞嘧啶和UDP-葡萄糖醛酸(下部)，而 在上部的HPLC圖譜中可以發(fā)現(xiàn)，不僅存在著羥甲基胞嘧啶和UDP-葡萄糖醛酸，而且出現(xiàn)了 兩個(gè)產(chǎn)物UDP和HM-cytosylglucuronic acid(HM-CGA)。可見，胞嘧啶和羥甲基胞嘧啶都能 夠在MilC的作用下與UDP-葡萄糖醛酸反應(yīng)，分別生成CGA和HM-CGA。在對(duì)糖基供體的實(shí) 驗(yàn)中，MilC不能夠催化UDP-葡萄糖(UDP-glucose)和胞嘧啶或羥甲基胞嘧啶的反應(yīng)。MilC的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的研究具有非常重要的意義，因?yàn)樗梢员砻鲗?duì)于胞嘧啶和 羥甲基胞嘧啶哪一個(gè)是酶的最適底物。因此，我們?cè)诜磻?yīng)體系中加入過(guò)量的UDP-葡萄糖醛 酸，來(lái)計(jì)算胞嘧啶和羥甲基胞嘧啶對(duì)MilC的米氏常數(shù)，結(jié)果見圖6C和表1，可見，MilC對(duì)胞 嘧啶和羥甲基胞嘧啶來(lái)說(shuō)有著近似的Km值，但胞嘧啶的Kcat值卻是羥甲基胞嘧啶的1. 9 倍，可見對(duì)MilC來(lái)說(shuō)胞嘧啶是更適合的底物。表IMilC對(duì)胞嘧啶和羥甲基胞嘧啶的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較
胞嘧唳羥甲基胞嘧唳
Kcat (loD1. 070 + 0. 00370. 5623 + 0. 0257
Km(ym)200. 0士 18. 26206. 8士24. 49<formula>formula see original document page 11</formula>MilC在米多霉素生物合成途徑中所催化的反應(yīng)如圖6D所示。(6)檢測(cè)到中間產(chǎn)物進(jìn)一步證明Radical SAM家族蛋白MilG的功能milG編碼一 335氨基酸殘基的蛋白，通過(guò)對(duì)MilG的Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn)它屬于 一類被稱為 Radical SAM 的超家族蛋白(Radical SAM superfamily，PF04055)。這類蛋白 通過(guò)一個(gè)特殊的鐵硫中心來(lái)還原性的分解S-腺苷甲硫氨酸(SAM)產(chǎn)生自由基。這類蛋白 家族的發(fā)現(xiàn)表明了自由基依賴的催化反應(yīng)對(duì)以前未能解決的一些復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)途徑的 重要性，同時(shí)也反映了這個(gè)家族蛋白既古老而又保守的性質(zhì)。Radical SAM能夠催化多種反 應(yīng)，包括特殊的甲基化反應(yīng)、異構(gòu)化反應(yīng)、硫的攙入、成環(huán)反應(yīng)、厭氧氧化反應(yīng)和蛋白自由基 的形成等。它們?cè)贒NA前體物、維生素、輔酶、抗生素和除草素的生物合成和生物降解過(guò)程 中起著重要作用，如賴氨酸2，3變位酶(lysine 2，3-aminomutase)、孢子光合產(chǎn)物裂解酶 (spore photoproduct lyase)、丙||酸甲酸罾角軍(pyruvate formatelyase)、厭氧核H核 Ρ酸還原Bl (anaerobic ribonucleotide reductase)禾口生物素合成Sl (biotin synthase) 等(Chem =Rev 2003(103) :2129_48)。圖7A(MIL 米多霉素；WT 生裂鏈輪絲菌野生型ZJU5119 ；LL8 生裂鏈輪絲菌milG 突變株LL8，羥甲基胞嘧啶葡萄糖醛酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)顯示在圖上)顯示敲除milG的生裂鏈輪 絲菌喪失了生產(chǎn)米多霉素的能力，同時(shí)，在突變株的發(fā)酵液中，中間產(chǎn)物羥甲基胞嘧啶葡萄 糖醛酸([M+H]/Z 318)得到了大量積累，這表明了 MilG可能是以羥甲基胞嘧啶葡萄糖醛酸 為底物，同時(shí)，在整個(gè)米多霉素生物合成基因簇中，milG是唯一一個(gè)可能編碼參與氧化反應(yīng) 的基因，因此推斷MilG負(fù)責(zé)催化羥甲基胞嘧啶葡萄糖醛酸的糖上碳4位羥基氧化成羰基， milG是米多霉素生物合成所必須的基因，在米多霉素生物合成途徑中它所負(fù)責(zé)的功能如圖 7B所示。(7)米多霉素生物合成基因簇中各種基因的作用根據(jù)前面對(duì)蛋白MilA、MilB和MilC的功能研究，已經(jīng)能夠明確了從CMP出發(fā)至合 成出(羥甲基)CGA的步驟。而米多霉素生物合成基因簇邊界的確定、各個(gè)基因的敲除和生 物信息學(xué)的利用提供了米多霉素生物合成基因簇中各個(gè)基因的作用。milG的功能由羥甲基CGA出發(fā)合成米多霉素需要在碳4位上轉(zhuǎn)入氨基，而轉(zhuǎn)氨 基之前的羥基必須被氧化成羰基。MilG是一類Radical SAM，它能夠利用自由基來(lái)催化許 多在化學(xué)上及其難以發(fā)生的反應(yīng)。而MilG的中斷突變株生裂鏈輪絲菌LL8的發(fā)酵產(chǎn)物中 羥甲基CGA的大量積累則支持了我們的判斷。同時(shí)，在其它的突變株中未能找到積累的中 間產(chǎn)物的原因可能就是MilG作用后的中間產(chǎn)物的不穩(wěn)定性。通過(guò)和殺稻瘟菌素的生物合 成基因簇的對(duì)比，同樣發(fā)現(xiàn)的一個(gè)Radical SAM-BlsE，考慮到米多霉素和殺稻瘟菌素的結(jié) 構(gòu)上相似性，MilG和BlsE可能就就負(fù)責(zé)(羥甲基)CGA的糖基的碳4為上羥基的氧化，轉(zhuǎn) 化為羰基。milM和milN的功能對(duì)于精氨酸側(cè)鏈和葡萄糖醛酸的縮合反應(yīng)，類似于MilN催 化的二氫吡啶甲酸合成，即半醛和酮酸的縮合。而MilM這個(gè)氨基轉(zhuǎn)移酶可以將精氨酸脫去氨基轉(zhuǎn)化為α酮酸，而MilN催化α酮酸和脫羧的己糖的反應(yīng)。milM和milN的基因中斷 突變株都失去了生產(chǎn)米多霉素的能力。milE和milQ的功能關(guān)于糖基部分2位碳與3位碳間雙鍵的形成也是米多霉素 生物合成途徑中非常特殊的反應(yīng)，盡管現(xiàn)在沒(méi)有直接的證據(jù)顯示哪個(gè)基因與此相關(guān)，但通 過(guò)生物合成基因簇邊界確定和基因中斷實(shí)驗(yàn)，我們認(rèn)為很可能是MilE和MilQ這兩個(gè)磷酸 轉(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)這個(gè)雙鍵的形成。milE和milQ的基因中斷突變株都失去了生產(chǎn)米多霉素的能力。milD, mill和milH的功能對(duì)于絲氨酸殘基側(cè)鏈的形成，MilD是個(gè)degT/dnrJ/ eryC/strS類型的氨基轉(zhuǎn)移酶，它可以在被MilG氧化成羰基的4位碳上轉(zhuǎn)入氨基。Mill包 含一磷酸泛酰巰基乙胺結(jié)合位點(diǎn)，磷酸泛酰巰基乙胺是一些多酶復(fù)合體中的酰基載體蛋白 的輔基，它作為一個(gè)結(jié)合活化的脂肪酸和氨基酸基團(tuán)的擺臂，因此Mill可能參與的絲氨酸 的活化。MilH作為一個(gè)具有ATP結(jié)合位點(diǎn)的連接酶可能催化絲氨酸殘基和糖上碳4位的氨 基之間的縮合反應(yīng)，形成類似肽鍵的酰胺鍵。對(duì)比殺稻瘟菌素的生物合成，MilH的同源蛋 白BlsK可能同樣負(fù)責(zé)氨基酸殘基和糖的結(jié)合，同樣，在殺稻瘟菌素的生物合成以及嘌呤霉 素的生物合成途徑中，催化這一反應(yīng)的都是連接酶，而并不是NRPS(ChemBiOChem2003(4) 821-9)。負(fù)責(zé)米多霉素生物合成的調(diào)節(jié)基因milO和milK，LuxR家族的調(diào)節(jié)蛋白MilO的突 變株樣喪失了米多霉素的生產(chǎn)能力，而主要易化家族蛋白MilK突變株的米多霉素產(chǎn)量降 低。這說(shuō)明了兩個(gè)調(diào)節(jié)基因在米多霉素生物合成途徑中的重要作用。米多霉素生物合成的 抗性基因milP的突變株不能夠生產(chǎn)米多霉素，所用它是合成的必不可少基因；milj做為米 多霉素生物合成基因簇中唯一的氧化還原酶基因負(fù)責(zé)精氨酸的羥化反應(yīng)。敲除milF突變 株喪失了米多霉素的生產(chǎn)能力，這說(shuō)明了 milF和米多霉素生物合成的相關(guān)性，證明了它是 米多霉素生物合成基因簇的一部份。根據(jù)體外酶活實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)突變實(shí)驗(yàn)和生物信息學(xué)分析整個(gè)基因簇的的功能，總結(jié) 如圖8所示。實(shí)施例步驟一，米多霉素產(chǎn)生菌生裂鏈輪絲菌ZJU5119總DNA的提取接種鏈輪絲菌至TSBY(10. 3%蔗糖)培養(yǎng)基于含有彈簧的三角瓶中30°C培養(yǎng)48h。 離心收集菌體,重懸于 5ml SET 緩沖液中(75mM NaCl, 25mM EDTA pH8. 0,20mM Tris-HCl ρΗ7· 5)。加入100 μ 1溶菌酶溶液(50mg/ml)，置37°C約60分鐘。溶菌后然后加入140 μ 1 蛋白酶K溶液(20mg/ml)混均勻，再加600 μ 1 10% SDS，通過(guò)顛倒混勻，置55°C溫浴2h，期 間偶爾顛倒幾次。再加入2ml 5M NaCl，徹底混勻，冷卻置37°C后，加入5ml氯仿，于室溫輕 輕混勻。20°C、4500g離心15分鐘。轉(zhuǎn)移上清至新管中，加入0. 6倍體積的異丙醇顛倒混 勻，約3分鐘后用玻棒挑取至含70% (ν/ν)乙醇的新管中洗滌，重復(fù)2次，空氣中干燥，溶解 在TE中。步驟二，生裂鏈輪絲菌基因組文庫(kù)的構(gòu)建(1)鏈輪絲菌總DNA的部分酶解和大片段DNA的回收將提取的鏈輪絲菌總DNA用Sau3AI部分酶解，用1 %低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠，在裝有 0. 5 倍 TBE 電泳緩沖液的脈沖場(chǎng)電泳(Pulse Field Gel Electrophoresis,PFGE,Bio-Rad)中分離?；厥占s40kb大小的DNA片段。用熱敏的堿性磷酸酶(APex Heat-Labile Alkaline Phosphatase, EPICENTRE Biotechnologies公司)處理是末端去磷酸化，供載體的連接及 包裝轉(zhuǎn)染用。(2)柯斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建和處理為了方便在鏈霉菌中做異源表達(dá)，從pOJ446和pSET152質(zhì)粒出發(fā)，構(gòu)建了新的可 整合在鏈霉菌染色體的穿梭柯斯質(zhì)粒載體，P0J446被XbaI和XhoI雙酶切后，包含多柯斯 位點(diǎn)的部分和來(lái)自PSET152的用同樣酶切的包含整合酶和attP位點(diǎn)的片段連接。將提取 的pJTU2554質(zhì)粒用單酶切位點(diǎn)的HpaI酶切成線性片段，然后用CIAP (NEB公司)酶處理末 端使其去磷酸化，然后再用BamHI酶切成兩條片段。(3)連接和包裝將處理好的鏈輪絲菌基因組DNA(大小約40kb)和柯斯質(zhì)粒載體按照1 1分子 數(shù)比例用T4連接酶(NEB公司)連接。將在冰上溶解的噬菌體包裝蛋白(MaxPlaxLambda Packing Extracts, EPICENTRE Biotechnologies公司)加入連接產(chǎn)物中，混勻，避免產(chǎn)生 氣泡，短暫離心，在30°C中溫浴90分鐘，再加入另一份包裝蛋白，繼續(xù)溫浴90分鐘后加入噬 菌體稀釋緩沖液(Phage Dilution Buffer, IOOmM NaCl, IOmM MgCl, IOmM Tris-HCl ρΗ8· 3) 至lml，并加入25 μ 1氯仿，4°C保存。(4)轉(zhuǎn)染與保存將大腸桿菌EPI300培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 8 1. 0作為感受態(tài)菌，可在4°C保存72h。 將包裝產(chǎn)物與感受態(tài)菌混合，37°C溫浴20分鐘后涂含阿伯拉抗生素的LB平板。37°C培養(yǎng) 過(guò)夜。挑取單克隆至含抗生素的LB培養(yǎng)基96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)18小時(shí)，加入滅菌的甘油至 終濃度20%，于-70°C中保存。步驟三，基因組文庫(kù)的篩選采用PCR的方法從基因組文庫(kù)中篩選所需要的柯斯質(zhì)粒。為篩選基因組文庫(kù)，從 每個(gè)板的96孔孔中取出等量菌液混合，接種培養(yǎng)，提取質(zhì)粒為一個(gè)模板進(jìn)行PCR篩選，在得 到的陽(yáng)性平板中，從每排的12個(gè)孔中取出等量菌液混合，接種培養(yǎng)，提取質(zhì)粒為一個(gè)模板 進(jìn)行PCR篩選。然后在那些陽(yáng)性的排中進(jìn)行單個(gè)的PCR篩選，直至篩出所有陽(yáng)性克隆。步驟四，雙交換基因置換質(zhì)粒的構(gòu)建(以PJTU412為載體，目的基因被壯觀霉素抗 性基因替換)基因置換載體的構(gòu)建采用PCR-Targeting方法。因?yàn)闃?gòu)建文庫(kù)所用的柯斯質(zhì)粒 (PJTU2554)在鏈霉菌中屬于整合型載體，會(huì)將整個(gè)質(zhì)粒片段整合到染色體上的aatB位置， 所以不適合用于基因置換。因此，首先要構(gòu)建中間載體，本研究采用的是以PJTU412為載 體，它是一種大腸桿菌鏈霉菌的穿梭質(zhì)粒，具有在鏈霉菌中遺傳不穩(wěn)定的特點(diǎn)，在非抗性選 擇的條件下，質(zhì)粒極容易丟失。將基因組文庫(kù)中篩選到的負(fù)責(zé)米多霉素生物合成的柯斯質(zhì) 粒酶切，連接到經(jīng)相應(yīng)限制性內(nèi)切酶酶切的PJTU412載體上，構(gòu)建了中間載體。分別將各中 間載體轉(zhuǎn)化至含有PIJ790質(zhì)粒的大腸桿菌BW25113中(E. coli BW25113/pIJ790)中制備 成感受態(tài)細(xì)胞，以通過(guò)PCR擴(kuò)增的pIJ779或pIJ778中含有的aadA基因(帶有與目的替換 基因兩側(cè)同源的尾端)DNA進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，得到基因置換質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ET12567中 以消除DNA甲基化影響。步驟五，融合蛋白的表達(dá)
(1)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建本實(shí)施例均以pET28a+(NOVagen公司)為表達(dá)載體，將待表達(dá)的基因用高保真的KOD酶和帶有限制性酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增出，酶切后連接至相應(yīng)酶切處理的表達(dá)載體上，構(gòu) 建成融合表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DHlOB中，測(cè)序正確后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含有pLysE質(zhì) 粒大腸桿菌BL21 (DE3) (Novagen公司)。(2)融合蛋白的表達(dá)含有融合表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 (DE3) (Novagen公司)接種到含氯霉素和卡那 霉素的LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過(guò)夜。然后將IOml的種子接種到IL的含相應(yīng)抗生素的LB培 養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 6，將培養(yǎng)溫度降至28°C，加入IPTG至終濃度為ImM，繼續(xù)培養(yǎng)5小 時(shí)。(3)融合蛋白的純化12，OOOg離心5分鐘收集菌體，然后重懸于25ml的裂解緩沖液(20mM磷酸鈉，0. 5M NaCl，pH7. 4)，反復(fù)凍融兩次，放置在冰浴中，用超聲波儀破碎細(xì)胞和打斷DNA分子(60s 10 次，每次間隔60s)，然后在4°C，16，OOOg離心45分鐘。對(duì)可溶性融合蛋白，取上清過(guò)鎳金屬鰲合小柱(HisTrap HP column, GEHealthcare公司)，用AKTA FPLC(GE Healthcare公司)純化，采用線性方式用洗脫液 (20mM磷酸鈉，0. 5M NaCl, 0. 5M咪唑，pH7. 4)洗脫，收集蛋白，用SDS-PAGE電泳來(lái)鑒定。純 化后的蛋白用脫鹽柱(HisTrap Desalting column,GE Healthcare公司)進(jìn)行緩沖液置換， 置換為50mM的Tris-HCl (pH7. 4)緩沖液，加入甘油至濃度20%，保存于_80°C。對(duì)不可溶蛋 白，則收集細(xì)胞破碎后的沉淀物，按照蛋白復(fù)性試劑盒(Protein Refolding Kit, Novagen 公司)的說(shuō)明書進(jìn)行蛋白復(fù)性，然后在按照上述對(duì)可溶的重組蛋白的純化方法進(jìn)行純化。 蛋白定量采用 Bradford 方法(Bradford Protein Assay Kit, Bio-Rad 公司)。序列表<110>上海交通大學(xué)<120>米多霉素生物合成基因簇<160>18<170>PatentIn version 3.5<210>1<211>43561<212>DNA<213> 生裂鏈輪絲菌 ZJU5119(Str印toverticillium rimofaciens ZJU5119)<400>1ccaagcttgg gctgcaggtc gactctagag atatcggatc accgtcagct tctcgcaggt 60ctcgccctcg gcggcgatga cctgcccggc ctcgaaggcc accggctcga aggcgcccgc 120gagttcggcc agtaaggcct cgtcggcctc gcgcaggaag ggcagttcgc gcaggtcctc 180ggggacgacg cggtgcgcgc cgccctcgct gtagcagctg atgcggtcgt cgccgaggat 240gaacgtccgg cggcggttga cgcggtagac accggactcg acgtcgaccc agggcagcgc 300gcgcagcaga tagcgcggcg tgatcccgcg catctgcggg gtggtcttgg tggtcgtggc 360caactgccgt gcggcatcgg gcgcgagact gagacgatcg ttcatgcggt cctcctcgaa 420
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一種米多霉素生物合成基因簇，其特征在于，序列如SEQ ID NO1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的米多霉素生物合成基因簇，其特征是，所述基因簇包含16個(gè) 基因結(jié)構(gòu)基因 11 個(gè):milA, milB, milC, milD, milE, milG, milH, milj, milM, milN 和 milQ ； 其中所述基因milA，位于SEQ ID NO :1的第6125 7126位， 所述基因milB，位于SEQ ID NO 1的第7252 7761位， 所述基因milC，位于SEQ ID NO 1的第7906 9165位， 所述基因milD，位于SEQ ID NO 1的第9185 10369位， 所述基因milE，位于SEQ ID NO :1的第10380 11198位， 所述基因milG，位于SEQ ID NO 1的第11627 12631位， 所述基因milH，位于SEQ ID NO 1的第12729 14948位， 所述基因milJ，位于SEQ ID NO :1的第16202 17152位， 所述基因milM，位于SEQ ID NO 1的第19548 20714位， 所述基因milN，位于SEQ ID NO 1的第20710 21483位， 所述基因milQ，位于SEQ ID NO 1的第25168 25935位； 調(diào)節(jié)基因2個(gè)milK和milO ；其中 所述基因milK，位于SEQ ID NO 1的第17152 18477位， 所述基因mi 10，位于SEQ ID NO 1的第23289 22222位； 抗性基因1個(gè):mi IP ；所述基因milP，位于SEQ ID NO 1的第23298 24878位； 其他基因2個(gè)milF、milI ；其中所述基因milF，位于SEQ ID NO :1的第11194 11664位， 所述基因mill，位于SEQ ID NO 1的第14948 16027位。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的米多霉素生物合成基因簇，其特征是，所述11個(gè)結(jié)構(gòu)基因編 碼的蛋白具體為所述基因milA編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO :2所示，該蛋白為CMP羥甲基轉(zhuǎn)移酶； 所述基因milB編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO :3所示，該蛋白為CMP/羥甲基水解酶； 所述基因milC編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO :4所示，該蛋白為胞嘧啶/羥甲基胞嘧 啶葡萄糖醛酸合成酶；所述基因milD編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO 5所示，該蛋白為degT/dnrT/eryCl/ strS氨基轉(zhuǎn)移酶；所述基因milE編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO :6所示，該蛋白為氨基糖苷類磷酸轉(zhuǎn)移酶；所述基因milG編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO :8所示，該蛋白為RadicalSAM蛋白； 所述基因milH編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO :9所示，該蛋白為連接酶； 所述基因milj編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO :11所示，該蛋白為精氨酸羥化酶； 所述基因milM編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO :14所示，該蛋白為Asp/Tyr/Aro氨基 轉(zhuǎn)移酶；所述基因milN編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO 15所示，該蛋白為二氫二吡啶甲酸合酶；所述基因milQ編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO 18所示，該蛋白為氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的米多霉素生物合成基因簇，其特征是，所述2個(gè)調(diào)節(jié)基因編碼 的蛋白具體為所述基因milK編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO :12所示，該蛋白為Majorfacilitator superfamily家族蛋白；所述基因milO編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO :16所示，該蛋白為L(zhǎng)uxR家族調(diào)節(jié)蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的米多霉素生物合成基因簇，其特征是，所述1個(gè)抗性基因編碼 的蛋白具體為所述基因milP編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO 17所示，該蛋白為ABCtransporter。
全文摘要
一種生物技術(shù)領(lǐng)域的米多霉素生物合成基因簇，該基因簇的序列如SEQ IDNO1所示；該基因簇包含16個(gè)基因結(jié)構(gòu)基因11個(gè)milA，milB，milC，milD，milE，milG，milH，milJ，milM，milN和milQ；調(diào)節(jié)基因2個(gè)milK和milO；抗性基因1個(gè)milP；其他基因2個(gè)milF、milI。本發(fā)明提供了米多霉素生物合成相關(guān)的所有基因和蛋白信息，為生物合成米多霉素和遺傳改造提供了基礎(chǔ)；本發(fā)明的米多霉素生物合成基因簇及其蛋白可廣泛用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N15/52GK101812472SQ200910056338
公開日2010年8月25日 申請(qǐng)日期2009年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月13日
發(fā)明者徐志南, 李力, 賀新義, 鄧子新 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)