專利名稱：一種雙歧桿菌凍干菌粉的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開一種雙歧桿菌凍干菌粉的制備方法，應(yīng)用于生物技術(shù)領(lǐng)域，為雙歧桿菌活菌 制劑產(chǎn)品的開發(fā)及其在食品、保健品、醫(yī)藥等方面的應(yīng)用提供了高效的凍干菌粉制作工藝。
背景技術(shù)：
1899年，Tisser首先由母乳營養(yǎng)兒的糞便中分離一種厭氧的革蘭陽性桿菌，菌體輕度彎 曲，末端常見分叉，故名雙歧桿菌。雙歧桿菌是革蘭氏陽性多形態(tài)桿菌，呈Y字形、V字形、 彎曲狀、刮勺狀等形態(tài)，其典型的特征是有分叉的桿菌，因而取名為bifidus，拉丁語源是裂 開、分開之意。雙歧桿菌不形成芽孢，亞甲蘭染色菌體著色不規(guī)則，無運(yùn)動性，專性厭氧， 過氧化酶陰性，不還原硝酸鹽，吲哚反應(yīng)陰性，明膠液化陰性，聯(lián)苯胺反應(yīng)陰性；最適生長 溫度37 4rC，最適發(fā)酵溫度35 4(TC，最低生長溫度25 28°C，最高生長溫度43 45°C; 起始生長pH值為6.7 7.0，在pH值為4.5 5.0以下或pH值為8.0 8.5以上的環(huán)境中都不 生長。雙歧桿菌對糖類碳水化合物的分解代謝途徑不同于乳酸菌的同型或異型發(fā)酵，而是經(jīng) 由特殊的雙歧支路，其中果糖-6-磷酸酮酶是其關(guān)鍵性的酶。對葡萄糖代謝是按果糖-6-磷酸 酮酶途徑水解，最后生成乙酸和乳酸，二者摩爾比為1.5: 1，不生成C02、 丁酸、丙酸； DNA堿基組成摩爾百分比為57 68。雙歧桿菌屬于丙酸桿菌科，共有11個種、30個亞種 和型，如分叉雙歧桿菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春長雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌等。不 同種類的雙歧桿菌對糖的發(fā)酵能力不同，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。觸酶試驗(yàn)多為陽性，多數(shù)能分解尿素， 不產(chǎn)生靛基質(zhì)和硫化氫。無內(nèi)、外毒素。雙歧桿菌一般對卡那霉素、新霉素、鏈霉素、多粘 菌素、慶大霉素、滅滴靈等耐受。對夾竹桃霉素、林可霉素、萬古霉素、青霉素G、氨芐青 霉素、紅霉素、呋喃坦啶敏感。
在20世紀(jì)初，曾試圖用雙歧桿菌肉湯培養(yǎng)物移植到數(shù)量較少的嬰兒腸道中，用以提高 嬰兒對腸道疾病的抵抗力。20世紀(jì)50年代后，多次國際會議討論雙歧桿菌對機(jī)體的有益作 用，對其生理意義的認(rèn)識不斷深入，在用于預(yù)防和治療微生態(tài)失調(diào)及某些疾病中取得了一定 成績，雙歧桿菌引起國際上廣泛關(guān)注。
新出生兒生后數(shù)小時，雙歧桿菌即可在腸道中定植，此后終生相伴。新生兒胎糞是無菌 的，出生后數(shù)小時可檢出腸道桿菌、細(xì)球菌、鏈球菌，其數(shù)量不斷增加，24h大腸桿菌占優(yōu) 勢。出生第2天可檢出少量雙歧桿菌，但增長十分迅速，第4 5天開始占優(yōu)勢，此時最先 出現(xiàn)的腸道桿菌等數(shù)量逐漸下降，于第6 8天則建立了以雙歧桿菌占絕對優(yōu)勢的菌群，專性厭氧菌特別是雙歧桿菌發(fā)酵產(chǎn)生大量醋酸和乳酸，而母乳的緩沖能力較弱，腸道pH迅速 下降，在出生后第7天時母乳營養(yǎng)兒糞便pH為5.1，從而兼性厭氧菌受到抑制。雙歧桿菌借 助其表面的磷壁酸牢固粘附于腸黏膜上皮細(xì)胞，并在那里定植增殖。
腸道正常微生物群是一組龐大的生態(tài)組織，種群超過400種，其中數(shù)量較多的雙歧桿菌 屬革蘭陽性厭氧無芽孢桿菌，是人和許多哺乳動物腸道中的優(yōu)勢菌之一，參與免疫、營養(yǎng)、 消化和保護(hù)等一系列生理過程。
雙歧桿菌具有多種生理功能，是目前公認(rèn)的益生菌。有關(guān)雙歧桿菌能提高人體腸道抗病 力這方面的生理功能有不少的研究和報(bào)道，雙歧桿菌對腐敗菌及病原菌、病原性埃希氏大腸 桿菌、金黃色葡萄球菌、痢疾志賀氏菌、傷寒沙門氏菌、變形菌、白假絲酵母等具有抑制作 用。雙歧桿菌不僅產(chǎn)生各種維生素如VB1、 VB2、 VB6、 VB12、煙酸和葉酸等以供人體所 需，還能通過抑制某些維生素分解菌來保障維生素的供應(yīng)。雙歧桿菌可促進(jìn)腸管蠕動，又由 于雙歧桿菌產(chǎn)生的有機(jī)酸可使腸管內(nèi)滲透壓增高，水分分泌亢進(jìn)，糞便中水分增高而緩解便 秘。雙歧桿菌還能在腸道內(nèi)可吸收利用一些腸道內(nèi)腐生菌產(chǎn)生的大量吲哚、硫化氫、胺等有 害代謝產(chǎn)物，抑制產(chǎn)胺的腐敗菌，降低腸道內(nèi)的pH值，使氨變?yōu)殡y于吸收的離子型，達(dá)到 降低血氨和保護(hù)肝功能的功效。雙歧桿菌在腸道內(nèi)通過誘導(dǎo)免疫原反應(yīng)增強(qiáng)人體免疫機(jī) 能。雙歧桿菌通過抑制腐生菌的生長和分解致癌物質(zhì)而起到預(yù)防腸道癌和腸道腫瘤的作用。
雙歧桿菌制品是利用宿主自身的優(yōu)勢生理細(xì)菌-雙歧桿菌作發(fā)酵劑，通過工業(yè)化發(fā)酵擴(kuò) 大生產(chǎn)制成活菌制劑，再回歸宿主原來的生境，達(dá)到調(diào)節(jié)或維持機(jī)體正常生理狀態(tài)的制品。 目前國內(nèi)外市場上有關(guān)雙歧桿菌的商品根據(jù)其機(jī)能可分為雙歧桿菌食品、含有雙歧桿菌及其 生長促進(jìn)物質(zhì)的特定保健性食品、雙歧桿菌藥品。根據(jù)所使用的菌種數(shù)的不同，又可以分為 單菌株制劑和聯(lián)菌株制劑。我國《益生菌類保健食品申報(bào)與評審規(guī)定(試行)》列出了可用 于保健食品的益生菌菌種名單(2005年7月1日實(shí)施)，g卩兩岐雙岐桿菌Bifidobacterium bifidum;嬰兒雙岐桿菌Bifidobacterium infantis;長雙岐桿菌Bifidobacterium longum;短雙 岐桿菌Bifidobacterium breve;青春雙岐桿菌Bifidobacterium adolescentis;德氏乳桿菌保加 禾lj亞禾中Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus; 嗜酸學(xué)L桿菌Lactobacillus acidophilus; 干 酪享L桿菌干酪亞禾中Lactobacillus casei subsp. Casei;嗜熱鏈球菌Streptococcus thermophilus; 羅伊氏乳桿菌Lactobacillus reuteri。其中兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、短雙歧桿菌、長雙 歧桿菌、青春雙歧桿菌均屬于雙歧桿菌。其中嬰兒雙歧桿菌和短雙歧桿菌只在嬰兒的腸道內(nèi) 存在并占優(yōu)勢，隨著人的年齡增高則逐漸減少和消失；成人的腸道內(nèi)則以青春雙歧和長雙歧 為主，由于長雙歧所帶有的葡萄糖苷酶存在一定的異議，因而應(yīng)用較少。而青春雙歧桿菌的 免疫激活的活性優(yōu)于其它雙歧桿菌，應(yīng)用變得越來越廣泛。20世紀(jì)60年代后，我國開始了這一領(lǐng)域的研究，試圖利用雙歧桿菌等微生態(tài)制活菌制 劑達(dá)到有病治病、未病防病、無病保健三重效應(yīng)，展現(xiàn)出了可喜前景。國內(nèi)有許多企業(yè)利用 雙歧桿菌凍干粉為原料生產(chǎn)生物制品，作為藥品主要控制其單位活菌數(shù)量，活菌數(shù)量直接影 響藥品的功能。因此，在凍干粉生產(chǎn)過程中提高活菌數(shù)量尤為重要?；罹苿┰谙M(fèi)之前應(yīng) 當(dāng)維持較高的活菌水平，而當(dāng)前的許多產(chǎn)品都不能有效地防止活菌數(shù)的衰減。如何篩選菌種 適應(yīng)在擴(kuò)增培養(yǎng)工藝操作中，優(yōu)化發(fā)酵的過程中影響活菌數(shù)量質(zhì)量如發(fā)酵溫度、培養(yǎng)pH值 和培養(yǎng)基中雙歧因子等主要因素是非常重要的。另外，利用真空冷凍干燥技術(shù)生產(chǎn)活菌制劑 是多種保藏方法中較為理想的一種，但冷凍和干燥過程會造成部分微生物細(xì)胞的損傷、死亡 及某些酶蛋白分子的鈍化，而且如果凍干工藝中保護(hù)劑選擇不當(dāng)，則發(fā)酵活力隨之下降。所 以，要獲得足夠存活的數(shù)量和質(zhì)量活菌并延長活菌保藏期，以便充分發(fā)揮其生理功能，并降 低成本，已成為雙歧桿菌活菌制劑產(chǎn)品研究開發(fā)及其應(yīng)用的技術(shù)關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是公開一種雙歧桿菌凍干菌粉的制備方法，是一種高密度高穩(wěn)定性高活性 凍干菌粉的制備方法，通過30 40°C10 30小時高密度培養(yǎng)使發(fā)酵液菌體濃度達(dá) 1.0xl08cfu/g，通過高效發(fā)酵液分離技術(shù)使菌泥濃度達(dá)1.0xl09cfu/g，通過高活性乳化及真空 冷凍干燥等優(yōu)化工藝后，得到1.0xl010dWg能在-18度儲存18個月其活性和穩(wěn)定性不受影響 的雙歧桿菌凍干菌粉。
本發(fā)明是在對雙歧桿菌菌株特性研究的基礎(chǔ)上，通過添加雙歧因子及優(yōu)化工藝對其高密 度高活性發(fā)酵培養(yǎng)，通過特殊保護(hù)劑進(jìn)行高穩(wěn)定性高活性乳化、凍干等技術(shù)和工藝，抗凍保 護(hù)劑，以期最大限度地獲得較高活性的發(fā)酵培養(yǎng)和活性穩(wěn)定性保護(hù)功能，減少菌體在制備過 程中的死亡，提高細(xì)胞的存活率并延長活菌保藏期，為雙歧桿菌凍干菌粉的制備和應(yīng)用提供 技術(shù)和工藝。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的 一種雙歧桿菌凍干菌粉的制備方法，其工藝流程包括菌種發(fā)酵培 養(yǎng)、發(fā)酵液分離、菌泥乳化和乳化液真空冷凍干燥，其特征在于所述的雙歧桿菌凍干菌粉 的菌種發(fā)酵培養(yǎng)，將雙歧桿菌菌種接入三角瓶液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基中接入的菌種 重量百分含量為0.1% 0.01%，在30 40'C下培養(yǎng)10 30小時，再接入大發(fā)酵罐的培養(yǎng)基 中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)基中的接種重量百分含量為1% 5%， 35 4(TC培養(yǎng)10 30小時；所 述培養(yǎng)基的重量百分比組成為雙歧因子1 5%、葡萄糖1 2%、蛋白胨0.5 2%、酵母膏 0.5 2%、檸檬酸二銨0.1 0.2%、磷酸氫二鉀0.1 0.2%、無水乙酸鈉0.1 1%、硫酸鎂0.05 0.1%、吐溫-80 0.0001%、其余為水，115'C滅菌15分鐘，并以補(bǔ)加氫氧化鈉溶液控制培養(yǎng)酸
5度使發(fā)酵液pH值為5.5~6.5。
所述菌種大發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)工藝，發(fā)酵液pH值為5.5 6.5、 OD600為2.0以上， 鏡檢兩歧雙歧桿菌形態(tài)正常，無雜菌，終止發(fā)酵。
所述發(fā)酵液分離工藝采用陶瓷膜孔徑大小0.01 lnm，在0.05MPa 0. 5MPa水壓條件下 過濾分離菌體，或以4000 10000rpm條件下進(jìn)行以管式或碟片式離心機(jī)分離菌體，并以無菌 水洗滌1 2次，得到菌泥。
所述菌泥乳化工藝，按照活菌菌泥菌泥保護(hù)劑-0.1 : 1 1 : 0.1的比例將菌泥與菌泥 保護(hù)劑混合乳化，菌泥保護(hù)劑配方各組份重量百分比為脫脂奶粉1 10%、乳糖1 10%、 玉米淀粉1 10%、抗氧化劑0.1 1%、吐溫-80 0.01 0.05%，其余為水，菌泥保護(hù)劑在105 'C 115'C條件下滅菌15分鐘后冷卻至5 2(TC備用；所述的抗氧化劑在異維生素C、谷氨酸 和甘氨酸中選擇一種。
所述乳化液真空冷凍干燥工藝為在一60 一4(TC預(yù)凍1 5小時后真空冷凍干燥，冷凍 干燥溫度為一60'C，真空度為1 8pa，真空冷凍干燥10 30小時；干燥后得到活菌數(shù)大于 1.0xl()Ucfii/g的高活性兩歧雙歧桿菌凍干菌粉。
所述菌種發(fā)酵培養(yǎng)、發(fā)酵液分離和菌泥乳化工藝操作環(huán)境條件要求為在溫度低于25度、 濕度膽<35%的潔凈環(huán)境中進(jìn)行。
所述的雙歧桿菌在兩歧雙歧桿菌Bifidobacterium bifidum、青春雙歧桿菌Bifidobacterium adolescentis、短雙歧桿菌Bifidobacterium breve、嬰兒雙歧桿菌Bifidobacterium infantis和長 雙歧桿菌Bifidobacterium longum中選擇一種或幾種。
所述的雙歧桿菌，其篩選優(yōu)良菌株均經(jīng)過如下試驗(yàn)①對酸、膽汁及滲透壓的抵抗力， ②對人體腸道細(xì)胞的黏附，③消化攝人的安全性， 對金黃色葡萄球菌、致病性大腸桿菌、 白色念珠菌和加德納菌等致病菌的抑制，⑤在結(jié)腸的短暫定植，⑥證實(shí)健康效果的臨床研究 等。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明方法制備得到的大于1.0xl010cfU/g雙歧桿菌凍干菌粉，能 在-18度儲存18個月，其活性和穩(wěn)定性不受影響的，為雙歧桿菌活菌制劑產(chǎn)品的開發(fā)及其在 食品、保健品、醫(yī)藥等方面的應(yīng)用提供了高效的凍干菌粉制作技術(shù)。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不 用于限制本發(fā)明保護(hù)的范圍，本發(fā)明保護(hù)的范圍以本發(fā)明申請的權(quán)利要求書說闡述的為準(zhǔn)。 下例實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條
6件。各比例和百分比均基于重量單位，除非特別說明。 實(shí)施例l:兩歧雙歧桿菌凍干菌粉制備
將篩選出的兩歧雙歧桿菌菌種先接入三角瓶液體培養(yǎng)基，后接入發(fā)酵罐中分別在30
4(TC下培養(yǎng)10 30小時進(jìn)行逐級擴(kuò)增培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方重量百分比組成為雙歧因子2%、 葡萄糖2%、蛋白胨1.5%、酵母膏1%、檸檬酸二銨0.1%、磷酸氫二鉀0.2%、無水乙酸鈉0.1%、 硫酸鎂0.05%、吐溫-80 0.0001%、其余為水，115。C滅菌15分鐘，并以補(bǔ)加NaOH溶液控制 培養(yǎng)酸度使發(fā)酵液pH值為5.5~6.5，菌種發(fā)酵擴(kuò)增培養(yǎng)，培養(yǎng)10 30小時，OD600為2.0 以上，鏡檢兩歧雙歧桿菌形態(tài)正常，無雜菌，終止發(fā)酵。以8000rpm條件下進(jìn)行以碟片式離 心機(jī)分離菌體，并以無菌水洗滌2次，得到菌泥。
菌泥保護(hù)劑配方各組份重量百分比為脫脂奶粉5%、乳糖10%、玉米淀粉5%、異維生 素CO.P/。、吐溫-80 0.01%，其余為水，菌泥保護(hù)劑在105t: 115'C條件下滅菌15分鐘后 冷卻至5 2(TC備用。按照活菌菌泥菌泥保護(hù)劑=1 : 1的比例將菌泥與菌泥保護(hù)劑混合乳 化。在一60 _4(TC預(yù)凍1 5小時后真空冷凍干燥，冷凍千燥溫度為一6(TC，真空度為l 8pa，真空冷凍干燥10 30小時條件下干燥后得到高活性兩歧雙歧桿菌凍干菌粉。
菌種發(fā)酵培養(yǎng)、發(fā)酵液分離和菌泥乳化工藝操作環(huán)境條件要求為在溫度低于25度、濕度 朋<35%的潔凈環(huán)境中進(jìn)行。
制備得到的產(chǎn)品中活菌數(shù)大于1.0xl0"cfu/g，用雙鋁膜密封真空包裝，每袋50g或根據(jù) 客戶要求包裝。
實(shí)施例2:青春雙歧桿菌凍干菌粉制備
將篩選出的青春雙歧桿菌菌種先接入三角瓶液體培養(yǎng)基，后接入發(fā)酵罐中分別在30 40。C下培養(yǎng)10 30小時進(jìn)行逐級擴(kuò)增培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方重量百分比組成為雙歧因子1%、 葡萄糖1%、蛋白胨0.5%、酵母膏2%、檸檬酸二銨0.2%、磷酸氫二鉀0.1%、無水乙酸鈉1%、 硫酸鎂0.1%、吐溫-80 0.0001%，其余為水，115'C滅菌15分鐘，并以補(bǔ)加NaOH溶液控制 培養(yǎng)酸度使發(fā)酵液pH值為5.5~6.5，菌種發(fā)酵擴(kuò)增培養(yǎng)，培養(yǎng)10 30小時，OD600為2.0 以上，鏡檢青春雙歧桿菌形態(tài)正常，無雜菌，終止發(fā)酵。在0.05MPa 0.5MPa水壓條件下進(jìn) 行以管式或碟片式離心機(jī)分離菌體，并以無菌水洗滌1 2次，得到菌泥。
菌泥保護(hù)劑配方各組份重量百分比為脫脂奶粉8%、乳糖8%、玉米淀粉5%、異維生素 C0.1%、吐溫-80 0.05%，其余為水，菌泥保護(hù)劑在105'C 115t:條件下滅菌15分鐘后冷卻 至5 2(TC備用。按照活菌菌泥菌泥保護(hù)劑=1 : 2的比例將菌泥與菌泥保護(hù)劑混合乳化。
其他同實(shí)施例1。
制備得到的產(chǎn)品中活菌數(shù)大于1.0xl()Hcft!/g，用雙鋁膜密封真空包裝，每袋50g或根據(jù)客戶要求包裝。
實(shí)施例3:嬰兒雙歧桿菌凍干菌粉制備
將篩選出的嬰兒雙歧桿菌菌種先接入三角瓶液體培養(yǎng)基，后接入發(fā)酵罐中分別在30 4(TC下培養(yǎng)10 30小時進(jìn)行逐級擴(kuò)增培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方重量百分比組成為雙歧因子5%、 葡萄糖2%、蛋白胨1.5%、酵母膏2%、檸檬酸二銨0.1%、磷酸氫二鉀0.2%、無水乙酸鈉0.5%、 硫酸鎂0.08%、吐溫-80 0.0001%，其余為水，115'C滅菌15分鐘，并以補(bǔ)加NaOH溶液控制 培養(yǎng)酸度使發(fā)酵液pH值為5.5~6.5，菌種發(fā)酵擴(kuò)增培養(yǎng)，培養(yǎng)10 30小時，OD600為2.0 以上，鏡檢嬰兒雙歧桿菌形態(tài)正常，無雜菌，終止發(fā)酵。以8000rpm條件下進(jìn)行以碟片式離 心機(jī)分離菌體，并以無菌水洗滌2次，得到菌泥。
菌泥保護(hù)劑配方各組份重量百分比為脫脂奶粉1%、乳糖10%、玉米淀粉10%、異維生 素C0.8。/。、吐溫-80 0.06%，其余為水，菌泥保護(hù)劑在105'C 115'C條件下滅菌15分鐘后 冷卻至5 2(TC備用。按照活菌菌泥菌泥保護(hù)劑=2: 1將菌泥與菌泥保護(hù)劑混合乳化。
其他同實(shí)施例1。
制備得到的產(chǎn)品中活菌數(shù)大于1.0xlO"cftj/g，用雙鋁膜密封真空包裝，每袋50g或根據(jù)客 戶要求包裝。
實(shí)施例4:長雙歧桿菌凍干菌粉制備
將篩選出的長雙歧桿菌菌種先接入三角瓶液體培養(yǎng)基，后接入發(fā)酵罐中分別在30 40°C 下培養(yǎng)10 30小時進(jìn)行逐級擴(kuò)增培養(yǎng)，雙歧因子3%、葡萄糖1.5%、蛋白胨1.2%、酵母膏 1.5%、檸檬酸二銨0.15%、磷酸氫二鉀0.12%、無水乙酸鈉0.6%、硫酸鎂0.08%、吐溫-80 0.0001%，其余為水，115'C滅菌15分鐘，并以補(bǔ)加NaOH溶液控制培養(yǎng)酸度使發(fā)酵液pH值 為5.5~6.5，菌種發(fā)酵擴(kuò)增培養(yǎng)，培養(yǎng)10 30小時，OD600為2.0以上，鏡檢長雙歧桿菌形 態(tài)正常，無雜菌，終止發(fā)酵。在0.05MPa 0.5MPa水壓條件下進(jìn)行以管式或碟片式離心機(jī)分 離菌體，并以無菌水洗滌1 2次，得到菌泥。
菌泥保護(hù)劑配方各組份重量百分比為脫脂奶粉4%、乳糖6%、玉米淀粉7%、異維生素 C0.8%、吐溫-80 0.04%,其余為水，菌泥保護(hù)劑在105。C 115'C條件下滅菌15分鐘后冷卻 至5 2(TC備用。按照活菌菌泥菌泥保護(hù)劑=3 :1的比例將菌泥與菌泥保護(hù)劑混合乳化。
其他同實(shí)施例1。
制備得到的產(chǎn)品中活菌數(shù)大于1.0xl0UdWg，用雙鋁膜密封真空包裝，每袋50g或根據(jù)客 戶要求包裝。
實(shí)施例5:短雙歧桿菌凍干菌粉制備
將篩選出的短雙歧桿菌菌種先接入三角瓶液體培養(yǎng)基，后接入發(fā)酵罐中分別在30 4(TC
8下培養(yǎng)10 30小時進(jìn)行逐級擴(kuò)增培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方重量比組成為雙歧因子3%、葡萄糖1.8%、 蛋白胨2%、酵母膏1.5%、檸檬酸二銨0.2%、磷酸氫二鉀0.2%、無水乙酸鈉0.8%、硫酸鎂 0.06%、吐溫-80 0.0001%，其余為水。115'C滅菌15分鐘，并以補(bǔ)加NaOH溶液控制培養(yǎng)酸 度使發(fā)酵液pH值為5.5~6.5，菌種發(fā)酵擴(kuò)增培養(yǎng)，培養(yǎng)10 30小時，OD600為2.0以上， 鏡檢短雙歧桿菌形態(tài)正常，無雜菌，終止發(fā)酵。以8000rpm條件下進(jìn)行以碟片式離心機(jī)分離 菌體，并以無菌水洗滌2次，得到菌泥。
菌泥保護(hù)劑配方各組份重量百分比為脫脂奶粉2%、乳糖2%、玉米淀粉3%、異維生素 C0.15%、吐溫-80 0.02%，其余為水，菌泥保護(hù)劑在105'C 115'C條件下滅菌15分鐘后冷 卻至5 2(TC備用。按照活菌菌泥菌泥保護(hù)劑-1 : 10的比例將菌泥與菌泥保護(hù)劑混合乳 化。
其他同實(shí)施例1。
制備得到的產(chǎn)品中活菌數(shù)大于1.0xl()Ucfb/g，用雙鋁膜密封真空包裝，每袋50g或根據(jù)客 戶要求包裝。
本發(fā)明要求保護(hù)的范圍不受所述具體實(shí)施方案的限制，本發(fā)明提供的具體實(shí)施例僅作為 進(jìn)一步說明本發(fā)明的例子，本領(lǐng)域技術(shù)人員參照本案說明書的描述可以很容易對本發(fā)明作出 多種改進(jìn)及組份的替換，這些無需創(chuàng)造性勞動的改進(jìn)和替換也應(yīng)落入本發(fā)明所附權(quán)利要求書 的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1. 一種雙歧桿菌凍干菌粉的制備方法，其工藝流程包括菌種發(fā)酵培養(yǎng)、發(fā)酵液分離、菌泥乳化和乳化液真空冷凍干燥，其特征在于所述菌種發(fā)酵培養(yǎng)工藝將雙歧桿菌菌種接入三角瓶液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在30～40℃下培養(yǎng)10～30小時，再接入大發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，35～40℃培養(yǎng)10～30小時；所述培養(yǎng)基的重量百分比組成為雙歧因子1～5％、葡萄糖1～2％、蛋白胨0.5～2％、酵母膏0.5～2％、檸檬酸二銨0.1～0.2％、磷酸氫二鉀0.1～0.2％、無水乙酸鈉0.1～1％、硫酸鎂0.05～0.1％、吐溫-800.0001％、其余為水，115℃滅菌15分鐘，并以補(bǔ)加氫氧化鈉溶液控制培養(yǎng)酸度使發(fā)酵液pH值為5.5～6.5；所述菌泥乳化工藝，按照活菌菌泥∶菌泥保護(hù)劑＝0.1∶1～1∶0.1的比例將菌泥與保護(hù)劑混合乳化，菌泥保護(hù)劑配方各組份重量百分比為脫脂奶粉1～10％、乳糖1～10％、玉米淀粉1～10％、抗氧化劑0.1～1％、吐溫-800.01～0.05％，其余為水，菌泥保護(hù)劑在105℃～115℃條件下滅菌15分鐘后冷卻至5～20℃?zhèn)溆茫凰龅目寡趸瘎┰诋惥S生素C、谷氨酸和甘氨酸中選擇一種。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙歧桿菌凍干菌粉的制備方法，其特征在于所述菌種大發(fā) 酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)工藝，發(fā)酵液pH值為5.5 6.5、 OD600為2.0以上，鏡檢兩歧雙歧桿 菌形態(tài)正常，無雜菌，終止發(fā)酵。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙歧桿菌凍干菌粉的制備方法，其特征在于所述發(fā)酵液分 離工藝采用陶瓷膜孔徑大小0.01 lpm，在0.05MPa 0. 5MPa水壓條件下過濾分離菌體， 或以4000 10000rpm條件下進(jìn)行以管式或碟片式離心機(jī)分離菌體，并以無菌水洗滌1 2 次，得到菌泥。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙歧桿菌凍干菌粉的制備方法，其特征在于所述乳化液真 空冷凍干燥工藝為在一60 一4(TC預(yù)凍1 5小時后真空冷凍干燥，冷凍干燥溫度為一 6CTC，真空度為1 8pa，真空冷凍干燥10 30小時；干燥后得到活菌數(shù)大于1.0xlO"cfU/g 的雙歧桿菌凍千菌粉。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種雙歧桿菌凍干菌粉的制備方法，其特征在于所述菌 種發(fā)酵培養(yǎng)、發(fā)酵液分離和菌泥乳化工藝操作環(huán)境條件要求為在溫度低于25度、濕度 膽<35%的潔凈環(huán)境中進(jìn)行。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙歧桿菌凍干菌粉的制備方法，其特征在于所述的雙歧桿 菌在兩歧雙歧桿菌Bifidobacterium bifidum、青春雙歧桿菌Bifidobacterium adolescentis、 短雙歧桿菌Bifidobacterium breve、嬰兒雙歧桿菌Bifidobacterium infantis和長雙歧桿菌 Bifidobacterium longum中選擇一種或幾種。
全文摘要
本發(fā)明為一種雙歧桿菌凍干菌粉的制備方法，其工藝流程包括菌種發(fā)酵培養(yǎng)、發(fā)酵液分離、菌泥乳化和乳化液真空冷凍干燥，其特征在于菌種發(fā)酵培養(yǎng)將雙歧桿菌菌種接入三角瓶液體培養(yǎng)基中30～40℃下培養(yǎng)10～30小時，115℃滅菌15分鐘；再接入大發(fā)酵罐35～40℃下發(fā)酵培養(yǎng)10～30小時；115℃滅菌15分鐘，發(fā)酵液pH值為5.5～6.5、OD600為2.0以上；乳化液真空冷凍干燥先在-60～-40℃預(yù)凍1～5小時，后在-60℃、1～8Pa真空度下真空冷凍干燥10～30小時。本發(fā)明方法制備的雙歧桿菌凍干菌粉能在-18℃儲存18個月，其活性和穩(wěn)定性不受影響。
文檔編號C12N1/20GK101486987SQ20091005687
公開日2009年7月22日 申請日期2009年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月12日
發(fā)明者方曙光 申請人:上海譜萊生物技術(shù)有限公司