專利名稱：白血病融合基因的聯(lián)合并行檢測(cè)方法及診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及體外診斷檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及多種白血病融合基因的液相芯片聯(lián) 合并行檢測(cè)方法及其診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
白白血病是由于造血干細(xì)胞分化異常和惡性增生而引起的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，是 我國最常見的惡性腫瘤之一。隨著白血病研究的不斷進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)許多白血病患者具有特異 性的染色體易位，導(dǎo)致新的融合基因產(chǎn)生，這些異常基因已成為不同類型白血病的分子生 物學(xué)特異性標(biāo)志。2000年WHO關(guān)于白血病分型的標(biāo)準(zhǔn)中更是將一些常見異常基因歸納為白 血病基本診斷的標(biāo)準(zhǔn)。因此，在分子基因水平對(duì)白血病相關(guān)的融合基因進(jìn)行檢測(cè)，不僅可以 為白血病診斷、分型、臨床治療選擇和預(yù)后判斷提供重要依據(jù)，同時(shí)也為白血病微小殘留病 變提供檢測(cè)基礎(chǔ)。白血病中常見的融合基因有慢性粒細(xì)胞白血病(CML)中的BCR-ABL (b2a2)、 BCR-ABL(b3a2)；急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)中的 BCR-ABL(ela2)、E2A-PBX1、TEL-AML1、 MLL-AF4(elO/e4)；急性粒細(xì)胞白血病(AML)中的 CBFB-MYH11 (A type)、AML1-ET0 ；急性早 幼粒細(xì)胞白血病(APL)中的 PML-RARA (L form)、PML-RARA (S form)。目前，白血病主要是依靠細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等檢測(cè)方 法來進(jìn)行診斷和檢測(cè)分型。細(xì)胞形態(tài)學(xué)受主觀因素影響，臨床診斷的一致率僅為70%左 右。核型分析和顯帶技術(shù)等細(xì)胞遺傳學(xué)方法是在全基因組水平篩查染色體易位，容易漏檢 許多染色體的微小異常。免疫學(xué)方法具有較高的假陽性率和假陰性率，并且無法做到早期 診斷。當(dāng)前國內(nèi)外廣泛使用的分子生物學(xué)檢測(cè)白血病融合基因的方法中，熒光原位雜交技 術(shù)(FISH)只能進(jìn)行定性檢測(cè)、操作復(fù)雜；熒光定量PCR存在著檢測(cè)通量的局限性，所以都還 不能真正滿足臨床診斷檢測(cè)的需要。傳統(tǒng)的固相生物芯片(Biochip)技術(shù)存在著可重復(fù)性 差、靈敏度不夠好以及操作繁瑣的突出弱點(diǎn)。因此臨床上需要有一種檢測(cè)方法，能夠迅速、 穩(wěn)定、準(zhǔn)確地對(duì)白血病的多種融合基因進(jìn)行聯(lián)合并行檢測(cè)，液相芯片技術(shù)(xMAP)正是這樣 一種新型檢測(cè)技術(shù)。液相芯片能夠?qū)ι倭繕颖具M(jìn)行定性、定量檢測(cè)，具有高通量、操作簡便、重復(fù)性好、 靈敏度高、線性范圍寬等突出優(yōu)點(diǎn)。該系統(tǒng)是由許多微球?yàn)橹饕|(zhì)構(gòu)成的，在微球的制造 過程當(dāng)中，摻入了兩種不同的紅色分類熒光，根據(jù)這兩種熒光的比例不同，把球形基質(zhì)分為 100種，可以標(biāo)記上100種不同的探針分子，能同時(shí)對(duì)一個(gè)樣品中多達(dá)100種不同的目標(biāo)分 子進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)物的不同，微球表面可以共價(jià)結(jié)合各種各樣的核酸檢測(cè)探針，在雜交 反應(yīng)進(jìn)行時(shí)再加上熒光標(biāo)記。在同一反應(yīng)體系中可以同時(shí)加入不同的檢測(cè)微球，這樣就可 以利用少量的樣本進(jìn)行快速、高通量的檢測(cè)。反應(yīng)結(jié)束后，通過微流體技術(shù)將微球排成單列 快速流經(jīng)液相芯片檢測(cè)儀，每個(gè)微球可同時(shí)被兩束激光檢測(cè)到，紅色激光激發(fā)微球上的紅 色分類熒光，將各個(gè)不同的反應(yīng)區(qū)分開來而定性；綠色激光則激發(fā)結(jié)合在待測(cè)樣本上的熒 光標(biāo)記進(jìn)行定量。當(dāng)標(biāo)記好的待測(cè)樣本與特定微球上的探針結(jié)合在一起時(shí)，兩束激光所激發(fā)的光均可被檢測(cè)到。最后，通過計(jì)算機(jī)的高速數(shù)字信號(hào)處理器，可以自動(dòng)統(tǒng)計(jì)分析得出特 定微球上的平均熒光強(qiáng)度，從而確定檢測(cè)物的種類和數(shù)量。本發(fā)明基于液相芯片技術(shù)的高通量、操作簡便、重復(fù)性好、靈敏度高、線性范圍寬 等突出優(yōu)點(diǎn)，對(duì)白血病的多種融合基因進(jìn)行聯(lián)合并行檢測(cè)，能夠在臨床檢測(cè)上得到更好的 應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是提供一種白血病融合基因的聯(lián)合并行檢測(cè)方法及診斷試劑盒。該方法及試劑盒包含對(duì)BCR-ABL (b2a2)、BCR-ABL (b3a2)、BCR-ABL (ela2)、 E2A-PBX1、TEL-AMLl、MLL-AF4 (el0/e4)、CBFB-MYH11 (A type)、AMLl-ETO, PML-RARA (L form)、PML-RARA(S form)，10種融合基因聯(lián)合并行檢測(cè)，可以對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病(CML)、 急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、急性粒細(xì)胞白血病(AML)、急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)進(jìn) 行臨床分型，同時(shí)對(duì)患者進(jìn)行療效觀察、預(yù)后及微小殘留疾病進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。本檢測(cè)方法及 診斷試劑盒具有高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確度、檢測(cè)迅速等優(yōu)點(diǎn)。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的白血病融合基因的聯(lián)合并行檢測(cè)方法，包括以下 步驟(1)包含10種不同熒光編碼的羧基微球beads，編號(hào)分別為11、15、17、21、25、33、 37、45、50、56 ；每種微球上分別共價(jià)結(jié)合針對(duì)白血病中染色體易位形成的10種融合基因的 mRNA所設(shè)計(jì)的特異性核酸探針(DNA探針)；(2)針對(duì)不同白血病類型中染色體易位所形成的10種融合基因的mRNA，分別設(shè)計(jì) 上下游引物，對(duì)不同的融合基因mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增出相應(yīng)的產(chǎn)物；(3)含有特異性核酸探針的微球與融合基因mRNA的逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增產(chǎn)物雜交后，加入 鏈霉親和素_藻紅蛋白(Sti^ptavidin-PE)，通過液相芯片法xMAP檢測(cè)熒光信號(hào)；(4)將檢測(cè)到的熒光信號(hào)與內(nèi)參基因的熒光信號(hào)進(jìn)行比較，從而確定檢測(cè)樣品中 是否含有白血病相關(guān)的融合基因，和/或樣品中融合基因的表達(dá)狀況。以上檢測(cè)方法中所述的微球是平均直徑為5. 6 μ m，結(jié)合了不同熒光染料的聚苯烯 微球，即色彩編碼微球(color-coded beads)；白血病中染色體易位形成的融合基因是針 對(duì)以下10種可以自由組合的融合基因BCR-ABL(b2a2)、BCR-ABL(b3a2)、BCR-ABL(ela2)、 E2A-PBX1、TEL-AMLl、MLL-AF4 (el0/e4)、CBFB-MYH11 (A type)、AMLl-ETO, PML-RARA (L form), PML-RARA(S form)。所述的共價(jià)結(jié)合于微球上的10條特異性核酸探針(DNA探針)，包括如下序列(其 中5’端含氨基修飾)BCR-ABL(b2a2) :5，-AminolinkerC12TGAAGGGCTTCTTCCTTATT_3，，如 SEQID NO. 1 所示；BCR-ABL(b3a2) :5，-AminolinkerC12TGAAGGGCTTTTGAACTCTG_3，，如 SEQID N0. 2 所示；BCR-ABL(ela2) :5，-AminolinkerC12TGAAGGGCTTCTGCGTCTCC_3，，如 SEQID N0. 3 所示；E2A-PBX1 :5，-AminolinkerC12TACTCAAAACACTGTAGGAG_3，，如 SEQ ID N0. 4 所示；
TEL-AMLl :5，-AminolinkerC12TCCAAGTATGCATTCTGCTA-3‘,如 SEQ ID NO. 5 所示；MLL-AF4(elO/e4) :5，-AminolinkerC12AGTAGGTCTGCTTAAAGTCC_3，，如SEQID NO. 6 所示；CBFB-MYH11(A type) :5， -AminolinkerC12GCTCATGGACCTCCATTTCC_3，，如 SEQID NO. 7所示；AMLl-ETO :5，-AminolinkerC12TCAGTACGATTTCGAGGTTC_3，，如 SEQ ID NO. 8 所示；
PML-RARA(L form) :5， -AminolinkerC12GTCTCAATGGCTGCCTCCCC_3，，如 SEQID NO. 9所示；PML-RARA(S form) :5， -AminolinkerC12GTCTCAATGGCTTTCCCCTG_3，，如 SEQID NO. 10所示；或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長的序列；或者與上述序列同源性大于85%的序列；或者與上述序列的堿基互補(bǔ)序列；或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。所述的針對(duì)不同融合基因的mRNA所設(shè)計(jì)的上下游引物，包括如下序列(其中上游 引物5’端含生物素標(biāo)簽)BCR-ABL(b2a2)上游引物 5，-biotin TGTGTGAAACTCCAGACTGTCC-3，，如 SEQID NO. 11 所示；下游引物 5’ -GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3’，如 SEQ ID N0. 12 所示；BCR-ABL(b3a2)上游引物 5， -biotin GGTTTCTGAATGTCATCGTCC-3，，如 SEQID N0. 13 所示；下游引物 5’ -GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3’，如 SEQ ID N0. 14 所示；BCR-ABL (ela2)上游引物 5，-biotin ACTGCCCGGTTGTCGTGT-3，，如 SEQ IDN0. 15 所示；下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3’，如 SEQ ID N0. 16 所示；E2A-PBX1 上游引物 5，-biotin CACCAGCCTCATGCACAAC-3，，如 SEQ ID N0. 17 所 示；下游引物 5，-CACGCCTTCCGCTAACAG-3，，如 SEQ ID N0. 18 所示；TEL-AMLl 上游引物 5，_biotin ACCTCTCTCATCGGGAAGACC-3，，如 SEQ ID N0. 19 所 示；下游引物 5，-TGGCATCGTGGACGTCTCTAG-3，，如 SEQ ID N0. 20 所示；MLL-AF4(elO/e4)上游引物 5，_biotin CCACCTCCGGTCAATAAG-3，，如 SEQ IDN0. 21 所示；下游引物 5，-CTAGGCGTATGTATTGCTGTC-3，，如 SEQ ID N0. 22 所示；CBFB-MYH11 (A type)上游引物 5，-biotinAAGAGGCTCGGAGAAGGACAC-3，，如 SEQID N0. 23 所示；下游引物 5，-CTCTTCCAGCTGCGTCTTCATC-3，，如 SEQ ID N0. 24 所示；AML1-ET0 上游引物 5，_biotin CAAGTCGCCACCTACCACAGAG-3，，如 SEQ IDN0. 25 所 示；下游引物 5，-GTGGCATTGTTGGAGGAGTCAG-3，，如 SEQ ID N0. 26 所示；PML-RARA(L form)上游弓丨物 5， -biotinCCCGTCATAGGAAGTGAGGT-3，，如 SEQ IDN0. 27 所示；下游引物 5，-CCATAGTGGTAGCCTGAGGACT-3，，如 SEQ ID N0. 28 所示；PML-RARA(S form)上游弓丨物 5，-biotin CAGGACCTCAGCTCTTGCAT-3，，如 SEQ IDN0. 29 所示；下游引物 5，-CCATAGTGGTAGCCTGAGGACT-3，，如 SEQ ID N0. 30 所示；或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長的序列；或者與上述序列同源性大于85%的序列；或者與上述序列的堿基互補(bǔ)序列；
或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。所述的內(nèi)參基因Abelson基因的引物和探針序列如下上游引物5，-biotin GCGCAAAATGTTGGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 31 所示；下游引物5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，，如 SEQ ID NO. 32 所示；探針5，-AminolinkerC12CTGAAGGGCTTCTTCCAGAT-3，，如 SEQ ID NO. 33 所示；或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長的序列；或者與上述序列同源性大于85%的序列；或者與上述序列的堿基互補(bǔ)序列；或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。本發(fā)明另一個(gè)解決的問題是，提供一種檢測(cè)白血病多種融合基因的診斷試劑盒， 包含共價(jià)結(jié)合了白血病融合基因mRNA特異性探針的微球混合物、結(jié)合了 Abelson基因探針 的微球、白血病融合基因mRNA的上下游引物、Abelson基因的上下游引物、鏈霉親和素-藻 紅蛋白Str印tavidin-PE、質(zhì)控品(陰性對(duì)照和陽性對(duì)照)。以上試劑盒中所述的質(zhì)控品包含陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，其中陽性對(duì)照為含有各種融合基因質(zhì)粒的混合液(包括含Abelson基因的質(zhì)粒)，陰性對(duì)照品為不含有融合基因及 Abelson基因的質(zhì)粒；所述的微球混合物，根據(jù)不同檢測(cè)樣品的需要自由組合。本發(fā)明的一種檢測(cè)白血病多種融合基因的診斷試劑盒，可用于檢測(cè)體外樣品，對(duì) 白血病進(jìn)行分型，早期診斷，療效觀察，預(yù)后與微小殘留疾病的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。由于本發(fā)明利用了液相芯片技術(shù)，使檢測(cè)方法及試劑盒具有高靈敏度、高特異性、 高通量、穩(wěn)定性好、檢測(cè)迅速、準(zhǔn)確等突出優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)Π籽∪诤匣蜻M(jìn)行定性和定量檢 測(cè)，能在臨床檢測(cè)上得到更好的應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明，但并不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。所述的 實(shí)施例只提供闡明核酸探針、試劑盒及其制作和應(yīng)用方法而不為其所限制。期間各種變化 形式在本發(fā)明和所述的權(quán)項(xiàng)的范圍內(nèi)是可預(yù)期的。實(shí)驗(yàn)材料引物和探針均由invitrogen公司合成；Trizol購自invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄 cDNA合成試劑盒、PCR試劑購置于Fermentas公司；不同編號(hào)的微球(表面羧基修飾)、鏈 霉親和素_藻紅蛋白均購置于QIAGEN公司；1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二 亞胺鹽酸鹽(EDC)購置于Pierce公司；2-(N-嗎啉)-乙磺酸(MES)、N-月桂?；彼徕c (Sarkosyl)、四甲基氯化銨(TMAC)均購置于sigma公司。緩沖液和雜交液的配制偶聯(lián)緩沖液，ρΗ4·5 250mlMES4. 88g ；1.5 X TMAC 雜交溶液 250ml5M TMAC225ml20% Sarkosyl1.88mlIM Tris-HCl, ρΗ8. O 18.75ml
0. 5M EDTA, ρΗ8· 0 3. OmlH2O1. 37ml ；1.5 X TMAC 雜交溶液 250ml5M TMAC150ml20% Sarkosyl1.25mlIM Tris-HCl, pH8. 0 12.5ml0. 5M EDTA, pH8. 0 2. OmlH2O84. 25ml ；TE 緩沖液，pH8. 0500mlIM Tris-HCl, pH8. 0 5ml0. 5M EDTA, pH8. 0 ImlH2O444ml實(shí)例1 :4種白血病融合基因的液相芯片聯(lián)合并行檢測(cè)方法具體的檢測(cè)方法包括如下步驟一 .檢測(cè) BCR-ABL (b2a2)、TEL-AMLl、CBFB-MYH11 (A type)、PML-RARA (L form)四 種融合基因的微球混合液的制備1.按照以下序列合成寡核苷酸探針BCR-ABL (b2a2) 5，-AminolinkerC12TGAAGGGCTTCTTCCTTATT_3，TEL-AML 15， -AminolinkerC12TCCAAGTATGCATTCTGCTA-3‘CBFB-MYH11(A type) 5，-AminolinkerC12GCTCATGGACCTCCATTTCC_3，PML-RARA (L form) 5，-AminoIinkerC 12GTCTCAATGGCTGCCTCCCC-3，Abelson 基因 5，-AminolinkerC12CTGAAGGGCTTCTTCCAGAT-3'2.將含有氨基修飾的寡核苷酸探針分別與編號(hào)為11、25、37、50、64號(hào)的5種羧基 微球偶聯(lián)2. 1取出一小份_20°C保存的新鮮干粉狀EDC平衡到室溫；2. 2 用 dH20 分另Ij 溶解 BCR-ABL (b2a2)、TEL-AML 1、CBFB-MYH11 (A type)、 PML-RARA(Lform),Abelson 的寡核苷酸探針，濃度為 lmM(lnmol/y 1)；2. 3分別全速渦旋編號(hào)為11、25、37、50、64號(hào)的5種羧基微球儲(chǔ)存懸液至少3min， 產(chǎn)生均一的微球懸液；2. 4分別取2. 5 X IO6微球儲(chǔ)存懸液到五個(gè)離心管中；2. 510，OOOg,離心，l_2min ；2. 6移除上清液，用50 μ 1 0. IM MES, ρΗ4. 5的偶聯(lián)緩沖液，重懸微球，渦旋震蕩20 秒；2. 7將五種濃度為ImM寡核苷酸探針分別用dH20以1 10的比例稀釋，使其濃度為 0. Inmol/μ 1 ；2. 8每種探針各加入2 μ 1 (濃度為0. Inmol/μ 1)到混勻的相應(yīng)的微球里，渦旋混 合；2. 9用dH20配制10mg/ml的新鮮EDC溶液(注意保持EDC粉末干燥，便于下一步 EDC的使用)；
2. 10加入2. 5 μ 1 10mg/ml EDC的的新鮮EDC溶液分別到五種微球中(25 μ g終濃 度約為0. 5 μ g/ μ 1)渦旋混勻；2. 11室溫避光孵育30min ；2. 12用dH20配制第二份10mg/ml的EDC新鮮溶液(注意EDC粉末如果潮解，則 應(yīng)丟棄，建議每一步偶聯(lián)過程都使用新鮮的EDC粉末)；2. 13五種微球中各加入2. 5 μ 110mg/ml的EDC新鮮溶液，渦旋混勻；2. 14室溫避光孵育30min ；2. 15五種偶聯(lián)微球中各加入Iml 0. 02% Tween-20 ；2. 1610，OOOg，離心，l_2min ；2. 17移除上清，分別用Iml 0. 1 % SDS重懸五種偶聯(lián)微球，振蕩混勻；2. 1810，000g，離心，l-2min ；2. 19移除上清，分別加入100 μ 1 TE, ρΗ8· 0，渦旋混合20s,重懸微球；2. 20用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)五種偶聯(lián)了寡核苷酸探針的微球；a.用dH20將偶聯(lián)微球以1 100稀釋；b.渦旋震蕩充分混勻；c.取10 μ 1到細(xì)胞計(jì)數(shù)器上；d.數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)器上4個(gè)角大格的微球總量；e.微球/ μ 1 = (4大格微球總量)X 2. 5 X 100 (稀釋倍數(shù))。3.微球混合液的配制將上述偶聯(lián)了寡核苷酸探針的微球，如下列分別為BCR_ABL(b2a2)探針微球11、 TEL-AMLl 探針微球 25、CBFB-MYH11(A type)探針微球 37、PML-RARA (L form)探針微球 50、 Abelson探針微球64，等比例混合，各種微球的終濃度為1500個(gè)/ μ 1，2_8°C避光保存。二.樣本的制備1-4號(hào)白血病患者的臨床樣本分別按照下面的步驟提取RNA 1.淋巴細(xì)胞提取取新鮮全血2ml加Iml 3%檸檬酸鈉，混勻后3000r/min離心， 10min，4°C，取血球?qū)由蠝\黃色層即為淋巴細(xì)胞；2.取1個(gè)離心管(經(jīng)DEPC水處理)加入淋巴細(xì)胞液150 μ 1.然后加Iml TRIZ0L， 室溫放置5min，使其充分裂解；3. 12，OOOrpm 離心 5min，取上清；4.每Iml Trizol中加入200 μ 1氯仿，劇振蕩混勻后室溫放置15min ；5. 4°C 12，OOOg 離心 15min ；6.吸取上層水相，至另一離心管中；7.每Iml Trizol中加入500 μ 1異丙醇混勻，室溫放置5-lOmin ；8. 4"C 12，OOOg 離心 lOmin，棄上清，RNA 沉于管底；9.按每Iml Trizol中加入Iml 75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀；10. 4"C 8，OOOg 離心 5min，盡量棄上清；11.室溫晾干或真空干燥5-lOmin ；12.可用 50ul H2OjTE buffer 或 0. 5% SDS 溶解 RNA 樣品，55_60°C，5-lOmin (H20、 TE或0. 5% SDS均須用DEPC處理并高壓)；
13.測(cè)OD值定量RNA濃度。三.多重RT-PCR按照如下方法對(duì)上述的1-4號(hào)樣本的mRNA進(jìn)行多重逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增l.cDNA第一鏈的合成①取一經(jīng)DEPC處理過的微量離心管，置于冰上，建立下列反應(yīng)體系；Total RNA5 10 μ g/3 μ 1
Oligo (dT) 18Primer (0. 5 μ g/ μ 1)1 μ 1EDPC-treated waterforword to12 μ 1輕輕混勻反應(yīng)液，用冷凍離心機(jī)稍微離心收集管壁上的反應(yīng)液到管底；②離心管于70°C溫育5分鐘，之后迅速取出置于冰中冷卻，用冷凍離心機(jī)稍微離 心收集管壁上的反應(yīng)液到管底；③將離心管放置于冰上，按順序加入以下反應(yīng)液；5Xreaction buffer4 μ 1RNase Inhibitor (20U/μ 1) 1 μ 1IOmMdNTPsMix2μ 1輕輕混勻反應(yīng)液，用冷凍離心機(jī)稍微離心收集管壁上的反應(yīng)液到管底；④離心管于37°C溫育5分鐘；⑤力口入 1 μ 1 RevertAidTM Reverse Transcriptase (200U/ μ 1)，終體積為 20 μ 1 ；⑥離心管于42°C反應(yīng)60分鐘；⑦離心管于70°C加熱10分鐘終止反應(yīng)，之后迅速取出置于冰中冷卻；2.多重 PCR2. 1按照如下序列合成引物BCR-ABL(b2a2) 上游引物 5，-biotin TGTGTGAAACTCCAGACTGTCC-3，下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，TEL-AMLl上游引物 5，-biotin ACCTCTCTCATCGGGAAGACC-3，下游引物 5，-TGGCATCGTGGACGTCTCTAG-3，CBFB-MYHlKA type)上游引物 5，-biotinAAGAGGCTCGGAGAAGGACAC-3，下游引物 5，-CTCTTCCAGCTGCGTCTTCATC-3，PML-RARA(L form)上游引物 5，-biotinCCCGTCATAGGAAGTGAGGT-3，下游引物 5，-CCATAGTGGTAGCCTGAGGACT-3，Abelson 基因上游引物 5，-biotin GCGCAAAATGTTGGAGATC-3，下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，2. 2PCR反應(yīng)體系如下cDNA10 μ 110XPCR Buffer10 μ 1MgCl2 (25mmol/L)4μ 1dNTPs (IOmM)0. 5 μ 1Taq Polymerase (5u/μ 1) 0. 5 μ 1Primer mix5 μ 1
dd H2O20 μ 1終體積為50 μ 1PCR 擴(kuò)增程序:95 V IOmin ；95 V 30s, 64-50°C lmin，72°C 30min ；前 14 個(gè)循環(huán)，每
循環(huán)一次，退火溫度降低l°c，后21個(gè)循環(huán)，退火溫度保持在50°C中進(jìn)行；72°C 7min ；4°C保溫。四.寡核苷酸探針和PCR產(chǎn)物的雜交1.選取步驟一中配制的寡核苷酸探針微球混合物；2.渦旋震蕩20s，混勻微球；3.制備微球工作液，用1. 5 X TMAC雜交溶液稀釋偶聯(lián)微球至濃度為150個(gè)微球/ μ 1。(注每個(gè)反應(yīng)需要33 μ 1的微球工作液)；4.渦旋震蕩20s，混勻微球工作液；5.向樣本孔、陽性對(duì)照孔、陰性對(duì)照孔內(nèi)分別加入33μ 1微球工作液；6.向每個(gè)樣品孔內(nèi)分別加入1-4號(hào)患者樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和TE溶液(ρΗ為 8. 0)，總體積為17 μ 1 ；7.用排槍上下吸打，溫柔混勻反應(yīng)液；8.蓋上反應(yīng)蓋避免蒸發(fā)，在95-100°C下孵育l_3min，使樣品中的寡核苷酸去掉二 級(jí)結(jié)構(gòu)；9.在雜交溫度下孵育反應(yīng)板15min ；10.制備新鮮的檢測(cè)混合液，用IXTMAC雜交溶液稀釋鏈霉親和素藻紅蛋白溶液 至10 μ g/ml (每個(gè)反應(yīng)需要25 μ 1的檢測(cè)混合液)；11.向每孔加入25 μ 1的檢測(cè)混合液，用排槍上下吸打，溫柔混勻；12.在雜交溫度下孵育5min ；上述步驟可以通過PCR儀按以下方案編程將其合并95°C，l_3min;雜交溫度，forever；13.在液相芯片儀(LiquiChip 200，QIAGEN公司)上，保持雜交溫度，對(duì)各反應(yīng)孔 進(jìn)行檢測(cè)分析，測(cè)定熒光MFI值(平均熒光強(qiáng)度)。五.檢測(cè)結(jié)果及分析檢測(cè)結(jié)果(熒光MFI值)如下 結(jié)果分析 1號(hào)患者類型為白血病融合基因TEL-AMLl陽性，2號(hào)患者類型為白血病融合基因 BCR-ABL (b2a2)陽性，3號(hào)患者類型為白血病融合基因CBFB-MYH11 (A type)陽性，4號(hào)患者 類型為白血病融合基因PML-RARA(L form)陽性；同時(shí)，將患者呈現(xiàn)陽性的融合基因的熒光 MFI值與內(nèi)參Abelson基因的熒光MFI值相比，可得出融合基因的表達(dá)狀況。實(shí)例2 10種白血病融合基因的液相芯片聯(lián)合并行檢測(cè)方法具體的檢測(cè)方法包括如下步驟一 .檢測(cè) BCR-ABL (b2a2)、BCR-ABL (b3a2)、BCR-ABL (ela2)、E2A-PBX1、TEL-AMLl、 MLL-AF4(elO/e4)、CBFB-MYH11 (A type)、AMLl-ETO, PML-RARA (L form)、PML-RARA (Sform) 十種融合基因的微球混合液的制備1.按照以下序列合成寡核苷酸探針BCR-ABL(b2a2) 5 ‘ -Amino1inkerCl2TGAAGGGCTTCTTCCTTATT-3‘BCR-ABL(b3a2) 5， -AminolinkerC12TGAAGGGCTTTTGAACTCTG_3，BCR-ABL(ela2) 5' -Amino1inkerCl2TGAAGGGCTTCTGCGTCTCC-3‘E2A-PBX 15， -AminolinkerC12TACTCAAAACACTGTAGGAG-3‘TEL-AML 15’ -AminolinkerCl2TCCAAGTATGCATTCTGCTA-3‘MLL-AF4(elO/e4) 5‘ -AminolinkerCl2AGTAGGTCTGCTTAAAGTCC-3‘CBFB-MYH11(A type) 5，-AminolinkerC12GCTCATGGACCTCCATTTCC_3，AML1-ET05’ -AminolinkerCl2TCAGTACGATTTCGAGGTTC-3‘PML-RARA(L form) 5' -Amino1inkerCl2GTCTCAATGGCTGCCTCCCC-3‘PML-RARA(S form) 5' -Amino1inkerCl2GTCTCAATGGCTTTCCCCTG-3‘Abelson 基因5，-AminolinkerC12CTGAAGGGCTTCTTCCAGAT_3，2.將以上含有氨基修飾的寡核苷酸探針分別與編號(hào)為11、15、17、21、25、33、37、 45、50、56、64號(hào)的11種羧基微球偶聯(lián)2. 1取出-小份_20°C保存的新鮮干粉狀EDC平衡到室溫；2. 2 用 dH20 分別溶解 BCR-ABL (b2a2)、BCR-ABL (b3a2) ,BCR-ABL (ela2)、E2A_PBX1、 TEL-AMLl、MLL-AF4(elO/e4)、CBFB-MYH11 (A type)、AMLl-ETO, PML-RARA (L form)、 PML-RARA(S form)、Abelson 的寡核苷酸探針，濃度為 lmM(lnmol/y 1)；2. 3分別全速渦旋編號(hào)為11、15、17、21、25、33、37、45、50、56、64號(hào)的11種羧基微 球儲(chǔ)存懸液至少3min，產(chǎn)生均一的微球懸液；2. 4分別取2. 5 X IO6微球儲(chǔ)存懸液到11個(gè)離心管中；2. 510，OOOg，離心，l_2min ；2. 6移除上清液，用50 μ 1 0. IM MES, ρΗ4. 5的偶聯(lián)緩沖液，重懸微球，渦旋震蕩20秒；
2. 7將11種濃度為ImM寡核苷酸探針分別用dH20以1 10的比例稀釋，使其濃 度為 0. Inmol/μ 1 ；2. 8每種探針各加入2 μ 1 (濃度為0. Inmol/μ 1)到混勻的相應(yīng)的微球里，渦旋混 合；2. 9用dH20配制10mg/ml的新鮮EDC溶液(注意保持EDC粉末干燥，便于下一步EDC 的使用)；2. 10加入2. 5 μ 1 10mg/ml EDC的的新鮮EDC溶液分別到11種微球中(25 μ g終 濃度約為0. 5 μ g/ μ 1)渦旋混勻；2.11室溫避光孵育30min ；2. 12用dH20配制第二份10mg/ml的EDC新鮮溶液(注意EDC粉末如果潮解，則 應(yīng)丟棄，建議每一步偶聯(lián)過程都使用新鮮的EDC粉末)；2. 1311種微球中各加入2. 5μ 1 10mg/ml的EDC新鮮溶液，渦旋混勻；2. 14室溫避光孵育30min ；2. 1511 種偶聯(lián)微球中各加入 Iml 0. 02% Tween-20 ；2. 1610，OOOg,離心，l_2min ；2. 17移除上清，分別用Iml 0. 1 % SDS重懸11種偶聯(lián)微球，振蕩混勻；2. 1810，OOOg,離心，l_2min ；2. 19移除上清，分別加入100 μ 1 TE, ρΗ8· 0，渦旋混合20s,重懸微球；2. 20用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)11種偶聯(lián)了寡核苷酸探針的微球；a.用dH20將偶聯(lián)微球以1 100稀釋；b.渦旋震蕩充分混勻；c.取10 μ 1到細(xì)胞計(jì)數(shù)器上；d.數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)器上4個(gè)角大格的微球總量；e.微球/ μ 1 = (4大格微球總量)X 2. 5 X 100 (稀釋倍數(shù))。3.微球混合液的配制將上述偶聯(lián)了寡核苷酸探針的微球，如下列BCR-ABL(b2a2)探針微球11、 BCR-ABL (b3a2)探針微球 15、BCR_ABL (ela2)探針微球 17、E2A_PBX1 探針微球 21、TEL_AML1 探針微球 25、MLL-AF4(elO/e4)探針微球 33、CBFB-MYH11 (A type)探針微球 37、AML1-ET0 探針微球 45、PML-RARA (L form)探針微球 50、PML-RARA (S form)探針微球 56、Abelson 探 針微球64，等比例混合，各種微球的終濃度為1500個(gè)/μ 1，2-8°C避光保存。二 .樣本的制備1-10號(hào)白血病患者的臨床樣本分別按照下面的步驟提取RNA 1.淋巴細(xì)胞提取取新鮮全血2ml加Iml 3%檸檬酸鈉，混勻后3000r/min離心， 10min，4°C，取血球?qū)由蠝\黃色層即為淋巴細(xì)胞；2.取1個(gè)離心管(經(jīng)DEPC水處理)加入淋巴細(xì)胞液150 μ 1，然后加Iml TRIZ0L， 室溫放置5min，使其充分裂解；3. 12，OOOrpm 離心 5min，取上清；4.每Iml Trizol中加入200 μ 1氯仿，劇振蕩混勻后室溫放置15min ；5. 4"C 12，OOOg 離心 15min ；
6.吸取上層水相，至另一離心管中；7.每Iml Trizol中加入500 μ 1異丙醇混勻，室溫放置5-lOmin ；8. 40C 12，OOOg 離心 lOmin，棄上清，RNA 沉于管底；9.按每Iml Trizol中加入Iml 75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀；10. 4"C 8，OOOg 離心 5min，盡量棄上清；11.室溫晾干或真空干燥5-10min ；12.可用 50ul H2O, TE buffer 或 0. 5% SDS 溶解 RNA 樣品，55_60°C，5-lOmin (H20、 TE或0.5% SDS均須用DEPC處理并高壓)；13.測(cè)OD值定量RNA濃度。三.多重RT-PCR按照如下方法對(duì)上述的1-10號(hào)樣本的mRNA進(jìn)行多重逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增1. cDNA第一鏈的合成①取一經(jīng)DEPC處理過的微量離心管，置于冰上，建立下列反應(yīng)體系；Total RNA5 10 μ g/3 μ 1Oligo (dT) 18Primer (0. 5 μ g/ μ 1) 1 μ 1EDPC-treated water forword to 12 μ 1輕輕混勻反應(yīng)液，用冷凍離心機(jī)稍微離心收集管壁上的反應(yīng)液到管底；②離心管于70°C溫育5分鐘，之后迅速取出置于冰中冷卻，用冷凍離心機(jī)稍微離心收集管壁上的反應(yīng)液到管底；③將離心管放置于冰上，按順序加入以下反應(yīng)液；5Xreaction buffer4μ 1RNase Inhibitor (20U/μ 1) 1 μ 1IOmM dNTPs Mix2 μ 1輕輕混勻反應(yīng)液，用冷凍離心機(jī)稍微離心收集管壁上的反應(yīng)液到管底；④離心管于37°C溫育5分鐘；⑤力口入 1 μ 1 RevertAidTM Reverse Transcriptase (200U/ μ 1)，終體積為 20 μ 1 ；⑥離心管于42°C反應(yīng)60分鐘；⑦離心管于70°C加熱10分鐘終止反應(yīng)，之后迅速取出置于冰中冷卻；2.多重 PCR2. 1按照如下序列合成引物BCR-ABL(b2a2)上游引物 5，-biotin TGTGTGAAACTCCAGACTGTCC-3，下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，BCR-ABL(b3a2)上游引物 5，-biotin GGTTTCTGAATGTCATCGTCC-3，下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，BCR-ABL(ela2)上游引物 5，-biotin ACTGCCCGGTTGTCGTGT-3，下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，E2A-PBX1上游引物 5，-biotin CACCAGCCTCATGCACAAC-3，下游引物 5，-CACGCCTTCCGCTAACAG-3，TEL-AMLl上游引物 5，-biotin ACCTCTCTCATCGGGAAGACC-3，
下游引物 5，-TGGCATCGTGGACGTCTCTAG-3，MLL-AF4(elO/e4) 上游引物 5，-biotin CCACCTCCGGTCAATAAG-3，下游引物 5，-CTAGGCGTATGTATTGCTGTC-3，CBFB-MYHlKA type)上游引物 5，-biotinAAGAGGCTCGGAGAAGGACAC-3，下游引物 5，-CTCTTCCAGCTGCGTCTTCATC-3，AMLl-ETO上游引物 5，-biotinCAAGTCGCCACCTACCACAGAG-3，下游引物 5，-GTGGCATTGTTGGAGGAGTCAG-3，PML-RARA(L form) 上游引物 5，-biotinCCCGTCATAGGAAGTGAGGT-3，下游引物 5，-CCATAGTGGTAGCCTGAGGACT-3，PML-RARA(S form) 上游引物 5，-biotin CAGGACCTCAGCTCTTGCAT-3，下游引物 5，-CCATAGTGGTAGCCTGAGGACT-3，Abelson 基因上游引物 5，-biotin GCGCAAAATGTTGGAGATC-3，下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，2. 2PCR反應(yīng)體系如下cDNA10 μ 110XPCR Buffer10 μ 1MgCl2 (25mmol/L)4μ 1dNTPs (IOmM)0. 5 μ 1Taq Polymerase (5u/μ 1) 0. 5 μ 1Primer mix 11 μ 1dd H2O14 μ 1終體積為50 μ 1PCR 擴(kuò)增程序:95 V IOmin ；95 V 30s, 64-50°C lmin，72°C 30min ；前 14 個(gè)循環(huán)，每
循環(huán)一次，退火溫度降低l°c，后21個(gè)循環(huán)，退火溫度保持在50°C中進(jìn)行；72°C 7min ；4°C保
ilm ο四.寡核苷酸探針和PCR產(chǎn)物的雜交1.選取步驟一中配制的寡核苷酸探針微球混合物；2.渦旋震蕩20s，混勻微球；3.制備微球工作液，用1. 5 X TMAC雜交溶液稀釋偶聯(lián)微球至濃度為150個(gè)微球/ μ 1。(注每個(gè)反應(yīng)需要33 μ 1的微球工作液)；4.渦旋震蕩20s，混勻微球工作液；5.向樣本孔、陽性對(duì)照孔、陰性對(duì)照孔內(nèi)分別加入33μ 1微球工作液；6.向每個(gè)樣品孔內(nèi)分別加入1-10號(hào)患者樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和TE溶液(ρΗ為 8. 0)，總體積為17 μ 1 ；7.用排槍上下吸打，溫柔混勻反應(yīng)液；8.蓋上反應(yīng)蓋避免蒸發(fā)，在95-100°C下孵育l_3min，使樣品中的寡核苷酸去掉二 級(jí)結(jié)構(gòu)；9.在雜交溫度下孵育反應(yīng)板15min ；10.制備新鮮的檢測(cè)混合液，用IXTMAC雜交溶液稀釋鏈霉親和素藻紅蛋白溶液至10 μg/ml (每個(gè)反應(yīng)需要25 μ 1的檢測(cè)混合液)；11.向每孔加入25μ 1的檢測(cè)混合液，用排槍上下吸打，溫柔混勻；12.在雜交溫度下孵育5min ；上述步驟可以通過PCR儀按以下方案編程將其合并95°C，l_3min;雜交溫度，forever；13.在液相芯片儀(LiquiChip 200，QIAGEN公司)上，保持雜交溫度，對(duì)各反應(yīng)孔 進(jìn)行檢測(cè)分析，測(cè)定熒光MFI值。五.檢測(cè)結(jié)果及分析檢測(cè)結(jié)果(熒光MFI值)如下 結(jié)果分析 同時(shí)，將患者陽性融合基因的熒光MFI值與內(nèi)參Abelson基因的熒光MFI值相比， 可得出融合基因的表達(dá)狀況。在閱讀了以上關(guān)于本發(fā)明的陳述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各 種修改或變化，這些等價(jià)形式同樣歸屬于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書中所限定的范圍。序列表<110>江蘇邁迪基因生物科技有限公司<120>白血病融合基因的聯(lián)合并行檢測(cè)方法及診斷試劑盒<130>NP-09-12968<160>33<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>(1). . . (20)<400>1tgaagggctt cttccttatt20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>(1). . . (20)<400>2tgaagggctt ttgaactctg20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>(1). . . (20)<400>3tgaagggctt ctgcgtctcc20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>(1). . . (20)<400>4tactcaaaac actgtaggag20<210>5<211>20<212>DNA<213> 人工序列<220><221>misc_feature
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<223> 引物<400>18 cacgccttcc gctaacag18<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>19acctctctca tcgggaagac c21<210>20<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>20tggcatcgtg gacgtctcta g21<210>21<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>21ccacctccgg tcaataag18<210>22<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>22ctaggcgtat gtattgctgt c21
<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>23aagaggctcg gagaaggaca c21<210>24<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>24ctcttccagc tgcgtcttca tc22<210>25<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>25caagtcgcca cctaccacag ag22<210>26<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>26gtggcattgt tggaggagtc ag22<210>27<211>20<212>DNA
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<223> 引物<400>31gcgcaaaatg ttggagatc19<210>32<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>32ggagcttttc acctttagtt atgc24<210>33<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>(1). . . (20)<400>33ctgaagggct tcttccagat 20
權(quán)利要求
一種白血病融合基因的聯(lián)合并行檢測(cè)方法，包括以下步驟(1)包含10種不同熒光編碼的羧基微球Beads，每種微球上分別共價(jià)結(jié)合針對(duì)白血病中染色體易位形成的10種融合基因的mRNA所設(shè)計(jì)的特異性核酸探針；(2)針對(duì)不同白血病類型中染色體易位所形成的10種融合基因的mRNA，分別設(shè)計(jì)上下游引物，對(duì)不同的融合基因mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增出相應(yīng)的產(chǎn)物；(3)含有特異性核酸探針的微球與融合基因mRNA的逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增產(chǎn)物混合雜交，加入鏈霉親和素-藻紅蛋白Streptavidin-PE后，通過液相芯片法xMAP檢測(cè)熒光信號(hào)；(4)將檢測(cè)到的熒光信號(hào)與內(nèi)參基因的熒光信號(hào)進(jìn)行比較，從而確定檢測(cè)樣品中是否存在白血病融合基因，以及樣品中融合基因的表達(dá)狀況。
2.如權(quán)利要求1所述的白血病融合基因的聯(lián)合并行檢測(cè)方法，其特征在于，所述的微 球是色彩編碼微球Color-coded beads，其平均直徑為5. 6 μ m，是結(jié)合了不同熒光染料的聚 苯烯微球。
3.如權(quán)利要求1所述的白血病融合基因的聯(lián)合并行檢測(cè)方法，其特征在于，所述的白 血病中染色體易位形成的融合基因是針對(duì)以下10種可以自由組合的融合基因BCR-ABL b2a2、BCR-ABL b3a2、BCR-ABL ela2、E2A-PBX1、TEL-AMLU MLL_AF4elO/e4、 CBFB-MYH11 A type、AML1-ET0、PML-RARA L form,PML-RARA S form。
4.如權(quán)利要求1所述的白血病融合基因的聯(lián)合并行檢測(cè)方法，其特征在于，所述的共 價(jià)結(jié)合于微球上的10條特異性核酸探針，包括如下序列，其中5’端含氨基修飾BCR-ABL b2a2 :5，-AminolinkerC12TGAAGGGCTTCTTCCTTATT_3，，如 SEQ IDN0. 1 所示； BCR-ABL b3a2 :5，-AminolinkerC12TGAAGGGCTTTTGAACTCTG_3，，如 SEQ ID NO. 2 所示； BCR-ABL ela2 :5，-AminolinkerC12TGAAGGGCTTCTGCGTCTCC_3，，如 SEQ ID NO. 3 所示； E2A-PBX1 :5，-AminolinkerC12TACTCAAAACACTGTAGGAG-3，，如 SEQ ID NO. 4 所示； TEL-AMLl :5，-AminolinkerC12TCCAAGTATGCATTCTGCTA_3，，如 SEQ ID NO. 5 所示； MLL-AF4elO/e4 :5，-AminolinkerC12AGTAGGTCTGCTTAAAGTCC_3，，如 SEQ IDN0. 6 所示； CBFB-MYH11A type :5，-AminolinkerC12GCTCATGGACCTCCATTTCC_3，，如 SEQID N0. 7 所示；AML1-ET0 :5，-AminolinkerC12TCAGTACGATTTCGAGGTTC-3，，如 SEQ ID N0. 8 所示； PML-RARA L form :5’ -AminolinkerC12GTCTCAATGGCTGCCTCCCC_3，，如 SEQ IDN0. 9 所示；PML-RARA S form :5，-AminolinkerC12GTCTCAATGGCTTTCCCCTG_3，，如 SEQ IDN0. 10 所示；或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長的序列； 或者與上述序列同源性大于85%的序列； 或者與上述序列的堿基互補(bǔ)序列； 或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
5.如權(quán)利要求1所述的白血病融合基因的聯(lián)合并行檢測(cè)方法，其特征在于，所述的針 對(duì)不同融合基因的mRNA所設(shè)計(jì)的上下游引物，包括如下序列，其中上游引物5’端含生物素 標(biāo)簽BCR-ABL b2a2 上游引物 5，-biotin TGTGTGAAACTCCAGACTGTCC-3，，如 SEQ IDN0. 11 所示；下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，，如 SEQ ID NO. 12 所示；BCR-ABL b3a2 上游引物 5，-biotin GGTTTCTGAATGTCATCGTCC-3，，如 SEQ IDN0. 13 所 示；下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，，如 SEQ ID NO. 14 所示； BCR-ABL ela2 上游引物 5，_biotin ACTGCCCGGTTGTCGTGT-3，，如 SEQ ID NO. 15 所示； 下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，，如 SEQ ID NO. 16 所示；E2A-PBX1 上游引物 5，-biotin CACCAGCCTCATGCACAAC-3，，如 SEQ ID NO. 17 所示；下 游引物 5，-CACGCCTTCCGCTAACAG-3，，如 SEQ ID NO. 18 所示；TEL-AMLl 上游引物 5，-biotin ACCTCTCTCATCGGGAAGACC-3，，如 SEQ ID NO. 19 所示； 下游引物 5，-TGGCATCGTGGACGTCTCTAG-3，，如 SEQ ID NO. 20 所示；MLL-AF4elO/e4 上游引物 5，_biotin CCACCTCCGGTCAATAAG-3，，如 SEQ IDN0. 21 所示； 下游引物 5，-CTAGGCGTATGTATTGCTGTC-3，，如 SEQ ID NO. 22 所示；CBFB-MYHllAtype 上游引物 5，-biotinAAGAGGCTCGGAGAAGGACAC-3，，如 SEQID NO. 23 所示；下游引物 5，-CTCTTCCAGCTGCGTCTTCATC-3，，如 SEQ ID NO. 24 所示；AMLl-ETO 上游引物 5，-biotin CAAGTCGCCACCTACCACAGAG-3，，如 SEQ ID NO. 25 所示； 下游引物 5，-GTGGCATTGTTGGAGGAGTCAG-3，，如 SEQ ID NO. 26 所示；PML-RARA L form 上游引物 5，-biotinCCCGTCATAGGAAGTGAGGT_3，，如 SEQ IDN0. 27 所 示；下游引物 5，-CCATAGTGGTAGCCTGAGGACT-3，，如 SEQ ID NO. 28 所示；PML-RARA S form 上游引物 5，-biotin CAGGACCTCAGCTCTTGCAT-3，，如 SEQ IDN0. 29 所示；下游引物 5，-CCATAGTGGTAGCCTGAGGACT-3，，如 SEQ ID NO. 30 所示； 或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長的序列； 或者與上述序列同源性大于85%的序列； 或者與上述序列的堿基互補(bǔ)序列； 或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
6.如權(quán)利要求1所述的白血病融合基因的聯(lián)合并行檢測(cè)方法，其特征在于，所述的內(nèi) 參基因?yàn)锳belson基因，其引物和探針序列如下上游引物 5，-biotin GCGCAAAATGTTGGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 31 所示；下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，，如 SEQ ID NO. 32 所示；探針 5，-AminolinkerC12CTGAAGGGCTTCTTCCAGAT-3，，如 SEQ ID NO. 33 所示；或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長的序列；或者與上述序列同源性大于85%的序列；或者與上述序列的堿基互補(bǔ)序列；或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
7.—種檢測(cè)白血病融合基因的診斷試劑盒，其特征在于，包含了權(quán)利要求1中所述的 共價(jià)結(jié)合了白血病融合基因特異性探針的微球混合物及結(jié)合了 Abelson基因探針的微球、 權(quán)利要求1中所述的白血病融合基因mRNA的上下游引物及Abelson基因的上下游引物、鏈 霉親和素-藻紅蛋白、質(zhì)控品。
8.如權(quán)利要求7中所述的檢測(cè)白血病融合基因的診斷試劑盒，其特征在于，所述的微 球混合物，根據(jù)不同檢測(cè)樣品的需要自由組合。
9.如權(quán)利要求7中所述的檢測(cè)白血病融合基因的診斷試劑盒，其特征在于，所述的質(zhì)控品包含陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，其中陽性對(duì)照為含有各種融合基因質(zhì)粒的混合液，包括含 Abelson基因的質(zhì)粒；陰性對(duì)照品為不含有融合基因及Abelson基因的質(zhì)粒溶液。
10. 一種如權(quán)利要求7所述的檢測(cè)白血病融合基因的診斷試劑盒在檢測(cè)體外樣品，對(duì) 白血病進(jìn)行分型、早期診斷、療效觀察、預(yù)后與微小殘留疾病的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種白血病融合基因的聯(lián)合并行檢測(cè)方法及診斷試劑盒，聯(lián)合并行檢測(cè)方法的特征是能夠一次性檢測(cè)白血病相關(guān)的多種融合基因。通過對(duì)白血病融合基因mRNA設(shè)計(jì)引物和探針，將探針與微球共價(jià)結(jié)合形成的探針微球混合物，與逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，加入鏈霉親和素藻紅蛋白后，可檢測(cè)出不同微球的熒光信號(hào)，從而確定待檢測(cè)樣品中是否含有白血病融合基因及融合基因的表達(dá)狀況。本發(fā)明所述的方法及試劑盒具有高靈敏度、高通量性、檢測(cè)快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)Χ喾N白血病融合基因同時(shí)進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101838682SQ20091005697
公開日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2009年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月20日
發(fā)明者孫黎, 徐春雷, 邵棠 申請(qǐng)人:江蘇邁迪基因生物科技有限公司