專利名稱：一種用甲醇酵母制備抑肽酶衍生物的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種用甲醇酵母表達(dá)制備抑肽酶衍生物的新 方法。
背景技術(shù)：
上世紀(jì)三十年代，人們從牛肺中分離了一種抑制激肽釋放酶(kallikrein)的物 質(zhì)，后來發(fā)現(xiàn)這是牛胰蛋白酶抑制劑(BPTI)。早在1959年德國首先以商品名為Trasylol 上市用于治療胰腺炎。1987年外國科學(xué)家偶然發(fā)現(xiàn)了 Trasylol 具有非常顯著的止血作 用。牛胰蛋白酶抑制劑是一種很強(qiáng)的廣譜絲氨酸蛋白酶抑制劑，它可以抑制胰蛋白酶、胰凝 乳蛋白酶、纖維蛋白溶酶和血漿激肽釋放酶等，人們又稱之為抑肽酶(aprotinin)。天然抑 肽酶是由58個氨基酸殘基組成的單鏈多肽，有三對二硫鍵，其活性中心位于15位賴氨酸。抑肽酶具有抑制纖溶系統(tǒng)的激活、保護(hù)血小板的功能、止血和抑制炎性反應(yīng)等多 種作用，是一種很有價值的藥物。抑肽酶是國家基本醫(yī)療保險藥品中之一，首次收載于中 國藥典(90版)。抑肽酶在預(yù)防和治療各種出血，如纖溶系統(tǒng)亢進(jìn)引起的出血、外傷引起的 出血性休克和產(chǎn)后大出血等，尤其在心臟直視手術(shù)中，能使術(shù)中、術(shù)后出血量減少一半以上 (30%-100%)，縮短手術(shù)時間，減少術(shù)后并發(fā)癥(感染等)發(fā)生率，減少可能由輸血引起病 毒(愛滋病、肝炎)感染的危險性。此外，抑肽酶還可用于其他疾病的治療，如急、慢性胰腺 炎、肺氣腫、喘息性支氣管哮喘的首選藥物，也用于胸、腹膜粘連的預(yù)防；還有抑制膠原酶的 作用，治療急性關(guān)節(jié)炎療效極佳；近來，在抗病毒、抗癌癥方面治療作用的研究報(bào)道越來越 多，顯示出非常廣闊的應(yīng)用前景。目前臨床上使用的抑酶肽都從牛胰或牛肺中提取，價格昂貴，這使得它的應(yīng)用受 到一定的限制。盡管如此，國內(nèi)心胸外科和胰腺手術(shù)仍廣泛使用抑肽酶，僅阜外醫(yī)院每年進(jìn) 口的抑肽酶用量就價值約400萬人民幣(參見中國專利0113609. 1)。近年來，瘋牛病蔓延到許多國家，這使得抑肽酶的原料來源大大減少，況且從牛胰 或牛肺提取的抑肽酶成本高，質(zhì)量不穩(wěn)定，還有潛在瘋牛病的危險。抑肽酶是由58個氨基酸殘基組成的單鏈多肽，從理論上是可以用基因工程 重組的方法制備，國外也有文獻(xiàn)和專利報(bào)道。(參見美國專利4, 894, 436,5, 258, 302, 5，164，482 ；5，591，603,5, 707，831 ；中國專利95106042. 2,96120494. χ,97115348. 5)。他 們企圖用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)或酵母表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)。但是大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá)容易形成包含 體，變復(fù)性也十分困難，收率很低，大腸桿菌分泌表達(dá)，表達(dá)量低。酵母表達(dá)存在嚴(yán)重的N端 不均一的問題。Vedvick等人曾報(bào)道抑肽酶發(fā)酵表達(dá)量可達(dá)0. 93克/升，其生物活性也和 天然的抑肽酶一樣，很遺憾的是其表達(dá)產(chǎn)物N端不均一，有的N端會多2個額外的氨基酸， 有的多4個額外的氨基酸，有的多11個額外的氨基酸，這些產(chǎn)物在在理化性質(zhì)上非常相似， 很難被分離開來，即使分離開，收率也很低。國內(nèi)也有人從事這方面的研究，如甘肅大得利生化制藥廠，他們用細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng) 表達(dá)，表達(dá)量低；還有中國藥科大學(xué)用包涵體表達(dá)，需要復(fù)性，收率低。
本專利描述了用甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)，以分泌的方式高效表達(dá)融合蛋白，然后在用 酶或者化學(xué)方法切開，從而得到N端均一的抑肽酶衍生物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種基因工程方法生產(chǎn)、表達(dá)量高、高純度的抑肽酶衍生物的 新方法。這種抑肽酶衍生物具有完全的天然抑肽酶的生理活性。本發(fā)明提供的抑肽酶衍生物的制備新方法包括以下步驟1.抑肽酶衍生物N端延伸融合蛋白的構(gòu)建經(jīng)過大量查閱文獻(xiàn)資料，我們找到幾種在甲醇畢赤酵母中高效表達(dá)的蛋白，例如， 凝膠蛋白(gelatins)、醇氧化酶、血清白蛋白和水蛭素等，我們將其中的一種蛋白放在抑肽 酶衍生物的N端之前，中間用連接肽相連。連接肽和抑肽酶之間加上切割位點(diǎn)。在融合蛋 白切割位點(diǎn)之前的任何位置，可以插入組氨酸，組氨酸可以是一個或多個，可以連在一起或 者分散插入。2.合成對應(yīng)于抑肽酶衍生物N端延伸融合蛋白的cDNA按照甲醇酵母喜好的密碼子設(shè)計(jì)并人工合成融合蛋白cDNA(APN fusionDNA)。3.融合蛋白基因工程菌的構(gòu)建將APN fusion DNA重組到甲醇酵母分泌表達(dá)載體，用單酶切方法線性化，然后轉(zhuǎn) 化甲醇酵母宿主菌，外源基因整合到宿主菌的染色體上，用適當(dāng)?shù)目剐院Y選陽性克隆，然后 進(jìn)行增殖和表達(dá)篩選，從而得到高表達(dá)的基因工程菌(APNfusion)。4.基因工程菌(APN fusion)高密度發(fā)酵按照Invitrogen公司發(fā)酵操作手冊中的方法對篩選出的APN fusion工程菌上罐 發(fā)酵。甲醇誘導(dǎo)48小時后，經(jīng)過總蛋白測定，SDS-PAGE電泳和掃描分析，培養(yǎng)基上清融合 蛋白的表達(dá)量不低于1.5克/升。5.融合蛋白的純化和裂解，以及抑肽酶衍生物的獲得發(fā)酵液上清過金屬螯合層析柱，經(jīng)洗滌后，洗脫，收集洗脫峰。洗脫液透析后，用酶 或者化學(xué)物質(zhì)裂解反應(yīng)。(如用有毒物質(zhì)裂解，要進(jìn)行脫毒處理)反應(yīng)液稀釋后過金屬螯合 層析柱，洗滌，收集流出液，流出液經(jīng)透析后，過SP-Sepharose柱，經(jīng)洗脫后，取樣分析，得 到抑肽酶衍生物，經(jīng)SDS-PAGE和RP-HPLC檢測，其純度大于98%。 本專業(yè)的技術(shù)人員在不違背本專利的精神的情況下，所作出的變動仍在本專利的 保護(hù)范圍內(nèi)。圖1是本發(fā)明制備方法的流程圖。本發(fā)明方法構(gòu)建的抑肽酶衍生物基因工程菌表達(dá)量高，產(chǎn)生的抑肽酶衍生物純度 高，完全具有天然抑肽酶的生理活性。


圖1.本發(fā)明制備方法的流程 2. APN fusion 的構(gòu)建圖 3. pPICZaA-APN fusion 表達(dá)載體的構(gòu)建圖4.發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)Met- fusion還原型SDS-PAGE電泳圖譜
A.未經(jīng)甲醇誘導(dǎo)時的發(fā)酵上清液，上樣22. 5 μ L ；B、C、D、Ε、F、G、H分別為甲醇誘 導(dǎo)8、16、24、32、40、48小時后的發(fā)酵上清液，上樣22.蛋白質(zhì)中分子量標(biāo)準(zhǔn)(LMW Marker Kit, Amersham Pharmacia Biotech)。圖5. Pro-APN fusion酸裂解還原型SDS-PAGE電泳圖譜A、B為酸裂解的產(chǎn)物，C為融合蛋白，D為aprotinin標(biāo)準(zhǔn)品圖6.抑肽酶衍生物(SEQ ID NO 1)的質(zhì)譜圖7.本發(fā)明實(shí)例中提到的抑肽酶衍生物的氨基酸序列同抑肽酶的氨基酸序列比 較
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 抑肽酶衍生物N端延伸融合蛋白APN fusion的構(gòu)建及相應(yīng)的核酸序列的設(shè)計(jì)和 合成實(shí)施例1. 1 Met-APN fusion (SEQ ID NO 4)的構(gòu)建及相應(yīng)核苷酸序列的獲得我們設(shè)計(jì)如圖1的序列。該序列的特點(diǎn)如下1)該序列將凝膠蛋白片段(SEQ ID NO 2)通過連接肽和抑肽酶衍生物(SEQID NO 1)相連，連接肽和抑肽酶衍生物之間有一個甲硫氨酸，為溴化氰裂解位點(diǎn)。這里的抑肽 酶衍生物為52Leu抑肽酶。2)為了便于分離純化，在凝膠蛋白片段N端第8個氨基酸后插入6個His(SEQ ID NO 3)。3)在凝膠蛋白片段之前的EAEA序列作為Ste 13的切割識別位點(diǎn)，在EAEA序列之 前加LEKR作為Kex2酶切識別位點(diǎn)。4)為了便于克隆，將Kex2酶切識別位點(diǎn)的LE設(shè)計(jì)為CTCGAG，它可被XhoI識別； 在抑肽酶衍生物序列之后加終止密碼子TGA，緊接著是NotI的酶切位點(diǎn)GCGGCCGC。5)上述DNA序列(Met-APN fusion DNA)是用甲醇酵母偏好密碼子設(shè)計(jì)。Met-APN fusion DNA (SEQ ID NO 5)委托上海生宏生物公司合成。該序列克隆到載體PUC18，經(jīng)DNA 測序分析，與設(shè)計(jì)完全一致。實(shí)施例1. 2 =Pro-APN fusion (SEQ ID NO 7)和 Gly-APN fusion (SEQ ID NO 10) 的構(gòu)建及相應(yīng)核苷酸序列的獲得用酸裂解位點(diǎn)Asp-Pro和Asp-Gly分別替換Met-APNfusion溴化氰裂解位點(diǎn)Met， 同時將52Leu替換為Met，就得到Pro-APN fusion和Gly-APN fusion。通過酸裂解分別可 得到 Pro-aprotinin(SEQ ID NO 6)或 Gly-aprotinin (SEQ IDNO 9)。按照《分子克隆》的方法以Met-APN fusion DNA為最初的模板，分別用PCR的方 法實(shí)現(xiàn)上述替換，得到 Pro-APN fusion DNA (SEQ ID NO 8)和 Gly-APNfusion DNA (SEQ ID NO 11)。實(shí)施例1. 3 =TEV-APN fusion (SEQ ID NO 12)的構(gòu)建及相應(yīng)核苷酸序列的獲得用TEV 酶裂解位點(diǎn) GluAsnLeuTyrPheGlnGlyGly 替換 Met-APN fusion 溴化氰裂 解位點(diǎn)Met，同時將52Leu替換為Met，就得到TEV-APNfusion。通過TEV裂解分別可得到GlyGly-aprotinin(SEQ ID NO: 13)。按照《分子克隆》的方法以Met-APN fusion DNA為最初的模板，分別用PCR的方 法實(shí)現(xiàn)上述替換，得到 TEV-APN fusion DNA (SEQ ID NO: 12)。實(shí)施例2 APN fusion表達(dá)菌株的構(gòu)建1)選用pPICZaA為表達(dá)載體。該載體作為穿梭質(zhì)粒，其特點(diǎn)為，有一個強(qiáng)的啟動 子(A0X1)，可分泌表達(dá)，Zeocirf為其抗性篩選標(biāo)記，容易篩選到高考貝的菌株，可在XhoI 和NotI之間插入外源基因。2)用XhoI-NotI雙切PUC18質(zhì)粒得到DNA片段，克隆到pPICZ α A的XhoI-NotI位 點(diǎn)，構(gòu)建重組質(zhì)粒PPICZaA-APN fusion。3)重組質(zhì)粒經(jīng)測序分析正確后，用SacI酶切線性化處理后，電轉(zhuǎn)化宿主菌X33感 受態(tài)細(xì)胞，并涂布分別含有100、200、300、400μ g/mL Zeocin的四塊YPD平板，大量挑取單 菌落，接種YPD液體培養(yǎng)基，用搖瓶篩選，SDS-PAGE電泳檢測，挑出表達(dá)量最高的一株作為 工程菌株記為 pPICZ a A-APN fusion/x33。實(shí)施例3 APN fusion基因工程菌的高密度發(fā)酵采用分批補(bǔ)料發(fā)酵的方式。1)種子液的制備取甘油保存管，按1 100的比例接人裝20mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中， 30°C，250r/min，培養(yǎng)16-24小時。然后按1 10的比例接人裝500mL種子培養(yǎng)基的IOOOmL 三角瓶中，30°C，250r/min，培養(yǎng)12小時。鏡檢無雜菌。2) 9L分批補(bǔ)料高密度發(fā)酵按1 10的接種比例，將種子液接入已預(yù)先滅菌裝有4. 5L分批發(fā)酵培養(yǎng)的9L發(fā) 酵中進(jìn)行分批補(bǔ)料培養(yǎng)(溫度控制在30°C，用氨水將pH調(diào)為至5. O左右)，當(dāng)碳源耗盡后 (Do陡然上升，Imin內(nèi))，流加補(bǔ)料生長培養(yǎng)基(流加速率維持溶氧大于20% )。當(dāng)菌體濕重 為200克/L左右停止補(bǔ)料，甘油耗盡后，補(bǔ)入甲醇誘導(dǎo)表達(dá)(pH用25%氨控制為3. 0，溫度 控制在20°C )，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、罐壓、空氣流量和流加甲醇速率使溶氧大于20%，并且停止 補(bǔ)加甲醇后，溶氧在Imin內(nèi)可升高10 %。在發(fā)酵的過程中，空氣流量保持在5-20L/min，罐 壓保持在0.5-0.8bar。每八小時取樣一次。離心的上清液，用上清液做SDS-PAGE電泳，每 孔加入20 μ L上清液，用靠馬斯亮藍(lán)染色。圖4.發(fā)酵液中APN fusion的還原型SDS-PAGE 電泳圖譜。實(shí)施例3:APN fusion分離純化、裂解和抑肽酶衍生物的獲得APN fusion 分離純化發(fā)酵上清液過含有20mM磷酸鈉鹽緩沖液(pH 7. 8)預(yù)平衡的Ni (II)-Chelating Sepharose FF柱，以含20mM磷酸鈉鹽緩沖液(pH7. 8)洗滌10個柱體積后，以20mM檸檬酸 鈉鹽緩沖液(PH 3.0)洗脫，收集洗脫峰。融合蛋白的裂解Met-APN fusion是按下述方式裂解的用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將上述洗脫峰真空濃縮到0. 3克/mL，再加入甲酸為濃縮液體積的二倍，混勻后，按10mg/334mg(融合蛋白)的比例加入溴化氰，在22°C、保溫16-18小時。然 后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮到原來的體積。Pro-APN fusion 和 Gly-APN fusion 是按下述方式裂解的將Pro-APN fusion或Gly-APN fusion過金屬鰲合層析的洗脫液，加入濃鹽酸到 終濃度0.01N，80°C，保溫2-4小時。取樣電泳直到完全裂解。調(diào)pH到中性。抑肽酶衍生物 的獲得稀釋后過預(yù)先用緩沖液(20mM PB，pH 7. 8)平衡附(II)-Sepharose FF，經(jīng)洗脫后， 收集洗脫液。洗脫液過預(yù)先用緩沖液平衡SP Sepharose FF柱，再用緩沖液(0. 6M NaCl, 20mM PB，pH 6.0)洗脫，收集流出液，取樣分析，得到抑肽酶衍生物。經(jīng)SDS-PAGE和RP-HPLC 檢測，其純度均大于98%。實(shí)施例4 抑肽酶衍生物的生物活性按照中國藥典上的方法，利用抑肽酶衍生物對胰蛋白酶的抑制實(shí)驗(yàn)和滴定分析來 測定。就是抑制胰酶催化的N-苯甲酰基-L-精氨酸乙脂(BAEE)的水解，通過酸堿滴定測 定反應(yīng)中釋放的羧基基團(tuán)。胰蛋白酶的殘留活性是活性化合物抑制活性的度量標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)時，我們用天然抑肽酶(珠海麗珠集團(tuán)的赫泰林)作對照，結(jié)果表明用這種基 因工程方法制備的抑肽酶衍生物的比活與天然的抑肽酶一樣。序列表(1) 一般資料(i).申請人肖建國(ii).發(fā)明題目一種甲醇酵母制備抑肽酶衍生物的新方法(iii).序列數(shù)目11(2) SEQ ID NO 1 的資料⑴.序列特征a.長度58個氨基酸b.類型氨基酸c.鏈型單鏈d.拓?fù)鋵W(xué)未知(ii).分子類型多肽(iii).序列描述SEQ ID NO 11 RPDFCLEPPY TGPCKARIIR YFYNAKAGLC QTFVYGGCRA KRNNFKSAED 5051 CLRTCGGA58(3) SEQ ID NO 2 的資料(1).序列特征a.長度17個氨基酸b.類型氨基酸c.拓?fù)鋵W(xué)未知(2).分子類型多肽(3).序列描述0096]
0097]
0098]
0099]
0100] 0101] 0102]
0103]
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0105]
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0125]
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0127]
0128]
0129]
0130]
0131]
0132]
0133]
0134]
1 GPPGEPGNGS PGNQGQP17
(4)SEQ ID NO 3序列的資料
(1).序列特征
a.長度23個氨基酸
b.類型氨基酸
c.拓?fù)鋵W(xué)未知
(2).分子類型多肽
(3).序列描述=SEQID NO 3
1 GPPGEPGNHH HHHHGSPGNQ GQP23
(5)SEQ ID NO 4序列的資料
(1).序列特征
a.長度88個氨基酸
b.類型氨基酸
c.拓?fù)鋵W(xué)未知
(2).分子類型多肽
(3).序列描述=SEQID NO 4
1 GPPGEPGNHH HHHHGSPGNQ GQPGGSGGGM RPDFCLEPPY TGPCKARIIR 50 51 YFYNAKAGLC QTFVYGGCRA KRNNFKSAED CLRTCGGA88
(6)SEQ ID NO 5序列的資料
(1).序列特征
a.長度:299bp
b.類型核苷酸
c.拓?fù)鋵W(xué)線性
(2).分子類型人工合成DNA
(3).序列描述=SEQID NO 5 1 CTCGAGAA 51 TCATCATC
GAGAGGCTGAAGCTGGTCCACCCGGTGAGCCAGGTAACCA50CATCATGGATC TCCTGGTAACCAAGGACAGCCCGGTGGTT100TATGAGACCTGACTTCTGTTTAGAGCCACCATACACTGGA150CCCGTATTATTAGATACTTTTACAACGCTAAGGCCGGACT200TTCGTTTACGGTGGATGTAGAGCTAAGAGAAACAACTTCA250GGACTGTTTAAGAACCTGTGGTGGTGCTTGAGCGGCCGC299的資料
(i).序列特征
a.長度59個氨基酸
b.類型氨基酸
c.鏈型單鏈
d.拓?fù)鋵W(xué)未知 ( ).分子類型多肽 (iii).序列描述=SEQ ID NO0135]
0136]
0137]
0138]
0139]
0140]
0141]
0142]
0143]
0144]
0145]
0146]
0147]
0148]
0149]
0150]
0151]
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0154]
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0156]
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0158]
0159]
0160] 0161] 0162]
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0167]
0168]
0169]
0170]
0171]
0172]
0173]
1 PRPDFCLEPP YTGPCKARII RYFYNAKAGL CQTFVYGGCR AKRNNFKSAE 50 51 DCMRTCGGA59
(8)SEQ ID NO 7序列的資料
(1).序列特征
a.長度89個氨基酸
b.類型氨基酸
c.拓?fù)鋵W(xué)未知
(2).分子類型多肽
(3).序列描述=SEQID NO 7
1 GPPGEPGNHH HHHHGSPGNQ GQPGGSGGGD PRPDFCLEPP YTGPCKARII 50
51RYFYNAKAGL CQTFVYGGCR AKRNNFKSAE DCMRTCGGA89
(9)SEQ ID NO 8序列的資料
(1).序列特征
a.長度:302bp
b.類型核苷酸
c.拓?fù)鋵W(xué)線性
(2).分子類型人工合成DNA
(3).序列描述=SEQID NO 8 1 CTCGAGAA
52TCATCATC
301 GC (IO)SEQ ID NO 9 的資料 (i).序列特征
a.長度59個氨基酸
b.類型氨基酸
c.鏈型單鏈
d.拓?fù)鋵W(xué)未知 ( ).分子類型多肽 (iii).序列描述=SEQ ID NO
GAGAGGCTGAAGCTGGTCCACCCGGTGAGCCAGGTAACCA50CATCATGGATCTCCTGGTAACCAAGGACAGCCCGGTGGTT100TGATCCTAGACCTGACTTCTGTTTAGAGCCACCATACACT150AGGCCCGTATTATTAGATACTTTTACAACGCTAAGGCCGG200ACTTTCGTTTACGGTGGATGTAGAGCTAAGAGAAACAACT250TGAGGACTGTATGAGAACCTGTGGTGGTGCTTGAGCGGCC300 3029
1 GRPDFCLEPP YTGPCKARII RYFYNAKAGL CQTFVYGGCR AKRNNFKSAE 51 DCMRTCGGA
(Il)SEQ ID N0:10序列的資料 (1).序列特征
a.長度89個氨基酸
b.類型氨基酸
50 59
90174]C.拓?fù)鋵W(xué)未知0175](2)分子類型多肽0176](3)序列描述:SEQ ID NO 100177]1GPPGEPGNHH HHHHGSPGNQ GQPGGSGGGD GRPDFCLEPP YTGPCKARII500178]51RYFYNAKAGL CQTFVYGGCR AKRNNFKSAE DCMRTCGGA890179](12)SEQ ID NO 11序列的資料0180](1)序列特征0181]a.長度:302bp0182]b.類型核苷酸0183]C.拓?fù)鋵W(xué)線性0184](2)分子類型人工合成DNA0185](3)序列描述:SEQ ID NO 110186]1CTCGAGAAAAGAGAGGCTGA AGCTGGTCCACCCGGTGAGCCAGGTAACCA500187]53TCATCATCATCATCATGGAT CTCCTGGTAACCAAGGACAGCCCGGTGGTT1000188]101CCGGTGGTGGTGATGGTAGA CCTGACTTCTGTTTAGAGCCACCATACACT1500189]151GGACCATGCAAGGCCCGTAT TATTAGATACTTTTACAACGCTAAGGCCGG2000190]201ACTGTGTCAAACTTTCGTTT ACGGTGGATGTAGAGCTAAGAGAAACAACT2500191]251TCAAGTCTGCTGAGGACTGT ATGAGAACCTGTGGTGGTGCTTGAGCGGCC3000192]301GC3020193](12)SEQ ID NO 12序列的資料0194](1)序列特征0195]a.長度320bp0196]b.類型核苷酸0197]C.拓?fù)鋵W(xué)線性0198](2)分子類型人工合成DNA0199](3)序列描述:SEQ ID NO 120200]1CTCGAGAAAAGAGAGGCTGA AGCTGGTCCACCCGGTGAGCCAGGTAACCA500201]54TCATCATCATCATCATGGAT CTCCTGGTAACCAAGGACAGCCCGGTGGTT1000202]101CCGGTGGTGGTGAGAACCTG TACTTTCAAGGTGGTAGACCTGACTTCTGT1500203]151TTAGAGCCACCATACACTGG ACCATGCAAGGCCCGTATTATTAGATACTT2000204]201TTACAACGCTAAGGCCGGAC TGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGATGTA2500205]251GAGCTAAGAGAAACAACTTC AAGTCTGCTGAGGACTGTATGAGAACCTGT3000206]301GGTGGTGCTTGAGCGGCCGC3200207](IO)SEQ ID NO 13的資料0208]⑴序列特征0209]a.長度60個氨基酸0210]b.類型氨基酸0211]C.鏈型單鏈0212]d.拓?fù)鋵W(xué)未知
(ii).分子類型多肽(iii).序列描述SEQ ID NO 131 GGRPDFCLEP PYTGPCKARI IRYFYNAKAG LCQTFVYGGC RAKRNNFKSA 50DCMRTCGGA
權(quán)利要求
一種用甲醇酵母制備抑肽酶衍生物等的新方法，其特征在于包括以下步驟1)合成抑肽酶衍生物融合蛋白的cDNA；2)將所述cDNA在甲醇酵母中的分泌表達(dá)；3)分離純化抑肽酶衍生物融合蛋白；4)用酶或化學(xué)物質(zhì)裂解融合蛋白及抑肽酶衍生物的純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1涉及的抑肽酶衍生物可以是人源的，也可以是牛源的。第52位氨 基酸可為其它任何氨基酸(包括lie、Leu和Glu等)或仍為Met。第15位氨基酸也可以 被其他任何氨基酸替換。也可以在N多出一個氨基酸如，Pro-aprotinin(SEQ ID NO 6)或 Gly-aprotinin(SEQ ID NO 9)等。
3.根據(jù)權(quán)利要求1涉及的抑肽酶衍生物等，不局限于抑肽酶衍生物，也可以是其它蛋 白，如表皮生長因子等。
4.根據(jù)權(quán)利要求1涉及的抑肽酶衍生物融合蛋白，是指抑肽酶衍生物N端融合一段多 肽和蛋白質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4涉及的融合蛋白可在甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)，也包括其他表達(dá) 系統(tǒng)例如原核表達(dá)系統(tǒng)、真核表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)、植物表達(dá)系統(tǒng)和其他的酵母表達(dá)系 統(tǒng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4涉及的多肽或蛋白質(zhì)可以是凝膠蛋白、水蛭素或血清白蛋白等可在 相應(yīng)的系統(tǒng)高效表達(dá)的蛋白或它們的片段等。
7.根據(jù)權(quán)利要求4涉及的多肽或蛋白質(zhì)的內(nèi)部或兩端可插入6XHis。
8.根據(jù)權(quán)利要求1獲得的融合蛋白可用金屬螯合層析的方法純化。
9.根據(jù)權(quán)利要求4涉及的融合蛋白，在N端多肽或蛋白質(zhì)和抑肽酶或其衍生物之間有 酶或化學(xué)物質(zhì)的切割位點(diǎn)，切開后制備的抑肽酶或其衍生物的N端不會有新的氨基酸，與 天然抑肽酶的N端完全一致，如有新的氨基酸，但不影響其生物活性。
10.根據(jù)權(quán)利要求9涉及的切割方法可以是酶包括TEV酶、凝血酶和腸激酶等，也可以 是化學(xué)物質(zhì)包括酸水解、溴化氰和Hydroxylamine等。
11.根據(jù)權(quán)利要求1制備的抑肽酶衍生物在多方面的藥物中應(yīng)用，如在外科用于止血、 抑制炎癥，治療休克；治療胰腺炎、肺氣腫和喘息性支氣管哮喘，治療急性關(guān)節(jié)炎，抗病毒和 惡性腫瘤等。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用甲醇酵母基因工程重組制備抑肽酶衍生物的新方法。運(yùn)用此方法制備的抑肽酶衍生物純度高、N端均一、具有天然抑肽酶的生物活性；運(yùn)用此方法構(gòu)建的甲醇酵母工程菌菌株上罐發(fā)酵時，抑肽酶衍生物以分泌的方式高效表達(dá)。
文檔編號C12R1/645GK101880701SQ200910057189
公開日2010年11月10日 申請日期2009年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月6日
發(fā)明者曹之舫, 林斌輝, 潘長工, 肖建國, 阮振興, 陳長華, 黃秀東 申請人:肖建國