專利名稱：：一種抗cd25抗體的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的大規(guī)模培養(yǎng)工藝高效表達(dá)抗體的方法。
背景技術(shù)：
：器官移植是20世紀(jì)醫(yī)學(xué)的重大成就之一，是多種臟器終末性疾病目前唯一的治療手段。僅我國(guó)每年新增的肝、腎及心臟功能衰竭患者就達(dá)數(shù)百萬(wàn)，其中大部分可通過(guò)器官移植延長(zhǎng)生命。以腎移植為例，全球目前共累計(jì)施行了50余萬(wàn)名腎移植術(shù)，在中國(guó)這一數(shù)字超過(guò)了3萬(wàn)名。2000年中國(guó)的腎移植數(shù)突破5000例，僅次于美國(guó)，位居世界第二。面對(duì)每年新增20萬(wàn)的尿毒癥患者，同種腎移植已經(jīng)成為治療慢性腎功能衰竭的一種非常重要的手段。我國(guó)近年來(lái)除傳統(tǒng)的腎移植外，心臟移植、肝臟移植呈加速增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，2003年一年的肝臟移植例數(shù)超過(guò)2000例，比以往各年的總和還要多。影響器官移植療效的主要問(wèn)題除供體短缺外，即為免疫排斥的問(wèn)題；而免疫排斥又加重了本已短缺的器官來(lái)源。從供體器官來(lái)源來(lái)分，器官移植可分為同種同基因移植(如自體移植、孿生子之間的移植)、同種異基因移植、以及異種移植。目前絕大多數(shù)臟器移植均為同種異基因移植。由于人體主要組織相容抗原(MHC抗原)的高度多樣性，不可避免地造成供體臟器抗原與受體免疫系統(tǒng)不相容，手術(shù)后產(chǎn)生嚴(yán)重排斥反應(yīng)。為維持移植物的存活，移植術(shù)前及術(shù)后必須常規(guī)應(yīng)用免疫抑制劑，抑制免疫系統(tǒng)對(duì)移植物的攻擊能力。傳統(tǒng)的免疫抑制劑包括糖皮質(zhì)激素(強(qiáng)的松類)、環(huán)孢菌素A、硫唑嘌呤等小分子化學(xué)藥物。這些藥物的發(fā)明，對(duì)器官移植的發(fā)展起到了明顯的促進(jìn)作用，然而，由于其特異性較低，對(duì)肝、腎及神經(jīng)系統(tǒng)的毒性較大，嚴(yán)重影響了移植受者的生存質(zhì)量，造成遠(yuǎn)期并發(fā)癥如器官功能慢性喪失、易發(fā)感染及腫瘤性疾病等。隨著人們對(duì)于免疫應(yīng)答反應(yīng)過(guò)程的不斷研究，免疫排斥的機(jī)理得到進(jìn)一步闡明，因此，近年來(lái)許多研究者試圖針對(duì)免疫排斥過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，采取干預(yù)措施，試圖特異性地消除受者免疫系統(tǒng)針對(duì)移植物的免疫反應(yīng)，盡可能地保留機(jī)體的抗感染、抗腫瘤等免疫功能，同時(shí)減少其它毒副反應(yīng)的發(fā)生。急性排斥反應(yīng)是最常見(jiàn)的一種移植排斥反應(yīng)，在未經(jīng)治療者此反應(yīng)可發(fā)生在移植后數(shù)天之內(nèi)；而經(jīng)過(guò)免疫抑制治療者，可在數(shù)月或數(shù)年后突然發(fā)生，臨床上表現(xiàn)為發(fā)熱、全身不適，移植物腫大和疼痛同時(shí)伴有移植物功能突然減退。急性排斥反應(yīng)屬于遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的細(xì)胞免疫現(xiàn)象，是移植物的HLA抗原刺激受者T淋巴細(xì)胞使之分化增殖，產(chǎn)生大量具有特異性的致敏淋巴細(xì)胞，可直接殺傷或通過(guò)釋放各種淋巴因子殺傷靶細(xì)胞，排斥移植物。現(xiàn)認(rèn)為體液免疫也參與急性排斥反應(yīng)。組織病理學(xué)改變?yōu)檠軆?nèi)膜損傷和纖維素樣壞死伴單核細(xì)胞浸潤(rùn)。急性排斥反應(yīng)經(jīng)過(guò)及時(shí)正確的處理，80-90%能被逆轉(zhuǎn)。白細(xì)胞分化抗原CD25，又稱Tac抗原，是白細(xì)胞介素-2(IL-2)受體的a亞單位(P55a，Ra亞單位)。T淋巴細(xì)胞表面IL-2受體由a(p55)、p(p75)、Y(p64)三個(gè)亞單位組成，a亞單位(又稱Tac或CD25)僅表達(dá)于激活淋巴細(xì)胞表面。正常的IL-2受體是由三個(gè)亞單位ou(3、Y三鏈以大量共價(jià)鍵組合而成，在靜息T細(xì)胞表面表達(dá)率很低，活化的T細(xì)胞表面則有較充分的表達(dá)。其a亞單位是可誘導(dǎo)的，不能被其他受體分占，只能構(gòu)成低親和力受體；卩和Y鍵則能構(gòu)成中等親和力受體，能被其他受體結(jié)合。(x、|3、Y三者的聚合體才能構(gòu)成完整的高親和力受體。作為IL-2的受體，CD25與IL-2結(jié)合后，雖不能傳導(dǎo)信息，但能啟動(dòng)T細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期。在腎移植受體內(nèi)，由于異體移植腎刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，由免疫細(xì)胞如T細(xì)胞、NK細(xì)胞、LAK細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-2能與經(jīng)抗原活化的T淋巴細(xì)胞表面的受體(CD25)相結(jié)合，誘導(dǎo)T細(xì)胞的快速增殖，產(chǎn)生排斥反應(yīng)。由于CD25主要表達(dá)于激活的T淋巴細(xì)胞，因此，如果能夠針對(duì)CD25分子，設(shè)計(jì)特異性的藥物，僅抑制這群T細(xì)胞的活性，或清除該群T細(xì)胞，則能夠在同種異體器官移植時(shí)，特異性地抑制針對(duì)移植物的免疫反應(yīng)。單克隆抗體技術(shù)由于其高度的特異性和耙向性，很自然地被列為首選方案?？笴D25單抗與Tac的特異性結(jié)合阻斷了IL-2與IL-2受體復(fù)合物的結(jié)合，從而抑制了IL-2通過(guò)高親和性IL-2受體誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，也就抑制了排斥反應(yīng)過(guò)程中細(xì)胞免疫的關(guān)鍵通道。其發(fā)揮免疫抑制的主要機(jī)制是通過(guò)與IL-2受體Tac亞單位的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)性地抑制IL-2依賴的T細(xì)胞增生；在體外可通過(guò)抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)引起抗Tac單抗介導(dǎo)的T細(xì)胞溶解(這可能是該藥免疫抑制的另一種機(jī)制)。間接的免疫調(diào)理機(jī)制如IL-2表達(dá)水平下調(diào)；通過(guò)Fc段及Fc受體相互作用，選擇性地滅活和破壞Tac陽(yáng)性的淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致反應(yīng)性T細(xì)胞集落被清除，從而增強(qiáng)或放大選擇性的免疫抑制效應(yīng)。然而，鼠源抗體在應(yīng)用于人體時(shí)會(huì)引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，嚴(yán)重阻礙了鼠源抗CD25單抗作為新型免疫抑制劑的療效。隨著人源化抗體技術(shù)的成熟，國(guó)外研究者對(duì)鼠源抗體進(jìn)行了人源化改造，使其在保持原有特異性的同時(shí)，對(duì)人體的免疫原性大大降低，從而開(kāi)發(fā)為理想的抗免疫排斥藥物(Immunosuppressionforneuralxenografts:acomparisonofcyclosporinandanti-CD25monoclonalantibody.HoneyCR,ShenH.JNeurosurg1999Jul;91(1):109隱13.Daclizumab.LindaR.W,DianaF.Drugs1999,58(6):1029-42.Placebo-controlledstudyofahumanizedanti-TACmonoclonalantibo"3yindualtherapyforpreventionofacuterejectionafterrenaltransplantation.CharpentierB，ThervetE.TransplantProc1998Jun;30(4):1331-2)。目前，F(xiàn)DA及歐盟已批準(zhǔn)2個(gè)抗CD25的單克隆抗體，一種是人源化單抗(Daclizumab);另一種是人一鼠嵌合型抗CD25單抗(Basiliximab)。這兩個(gè)抗體均已成功地用于防止腎移植后的急性排異反應(yīng)。其治療指數(shù)寬，不良反應(yīng)小，半衰期長(zhǎng)，Basiliximab半衰期約為6天，Daclizumab半衰期超過(guò)20天(Daclizumab:outcomeofphaseIIItrialsandmechanismofaction.DoubleTherapyandtheTripleTherapyStudyGroups.VincentiF,NashanB,LightS.TransplantProc1998Aug;30(5):2155-8Reductionofacuterenalallograftrejectionbydaclizumab.DaclizumabDoubleTherapyStudyGroup.NashanB,LightS,HardieIR，LinA,JohnsonJR.Transplantation1999Jan15;67(1):110-5Thesafetyandefficacyofatwo-dosedaclizumab(zenapax)inductiontherapyinlivertransplantrecipients.EckhoffDE,McGuireB,SellersM，ContrerasJ，F(xiàn)renetteL，YoungC，HudsonS，By腿JS.Transplantation2000May15;69(9):1867-72Resultsof3-yearphaseIIIclinicaltrialswithdaclizumabprophylaxisforpreventionofacuterejectionafterrenaltransplantation.BumgardnerGL，HardieI，etc.Transplantation2001Sep15;72(5):839-45.Daclizumab:areviewofitsuseinthemanagementoforgantransplantation.CarswellCI，PloskerGL,WagstaffAJ,BioDrugs2001;15(ll):745-73)。這兩種抗體都是利用基因工程技術(shù)，采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)酵技術(shù)表達(dá)的重組蛋白。Daclizumab(商品名Zenapax)由美國(guó)ProteinDesignLabs公司開(kāi)發(fā)，后將其授權(quán)給Hoffmann-LaRoche(羅氏)公司生產(chǎn)，已于1997年獲得FDA的批準(zhǔn)，用于預(yù)防腎移植的急性排斥反應(yīng)。該抗體包含90y。的人IgG序列和10%的鼠序列，其中人序列由人IgGl的恒定區(qū)和Eu骨髓瘤抗體可變框架區(qū)組成，鼠序列由鼠抗Tac抗體的CDR構(gòu)成，分子量144KDa。鑒于Declizumab在臨床前及臨床研究中表現(xiàn)出確切的效果，Zenapax1997年12月10日獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，適應(yīng)癥為"預(yù)防同種異體腎移植患者的急性器官排斥反應(yīng)，可與包括環(huán)孢素和皮質(zhì)類固醇激素的免疫抑制方案合用"。ProteinDesignLabs在開(kāi)發(fā)之初，選擇了NSO細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，采用了無(wú)血清懸浮批次培養(yǎng)的方式。NSO作為宿主細(xì)胞，具有以下先天性的缺陷NSO宿主細(xì)胞的a-1,3半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶會(huì)產(chǎn)生具有高免疫原性的Galal，3-Gal(31，4-GlcNac，這種在人體內(nèi)不存在的糖基化修飾應(yīng)用于人體時(shí)，具有刺激機(jī)體產(chǎn)生診斷這類異種抗原的免疫反應(yīng)，從而降低藥物的療效，甚至發(fā)生嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)。NSO細(xì)胞中，糖基化末端的唾液酸形式主要為N-glyculyl-neuraminicacid(NGNA)(N-乙酰神經(jīng)氨酸)，與人體的N-acetyl-neuraminicacid(NANA)(N-乙酰神經(jīng)氨酸)不同，因此利用NSO細(xì)胞作為宿主細(xì)胞培養(yǎng)得到的抗CD25單抗用于人體后也具有潛在的免疫原性，可能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)而影響療效甚至發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)。NSO細(xì)胞內(nèi)具有逆轉(zhuǎn)錄病毒的顆粒，在以該細(xì)胞作為宿主細(xì)胞的抗CD25單抗工業(yè)化制備的過(guò)程中，大量的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒分泌到培養(yǎng)上清中，如果終產(chǎn)品中殘留有未清除獲滅活的病毒，會(huì)導(dǎo)致臨床治療中不確定的風(fēng)險(xiǎn)。因此下游的純化過(guò)程需要通過(guò)非常復(fù)雜的步驟去除或滅活上清中的病毒，而且這些步驟必須通過(guò)有效的驗(yàn)證。
發(fā)明內(nèi)容為了克服利用NSO細(xì)胞作為宿主細(xì)胞培養(yǎng)抗CD25單抗的缺點(diǎn)，需要利用合適的宿主細(xì)胞并優(yōu)化培養(yǎng)條件從而減少細(xì)胞表達(dá)的蛋白與人體天然存在蛋白的差異，提高其對(duì)人體的安全性。本發(fā)明的發(fā)明人利用CHO細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，并按照2006年10月20日申請(qǐng)的專利申請(qǐng)?zhí)枮?00610147535.7發(fā)明名稱為《采用動(dòng)物細(xì)胞流加培養(yǎng)方式高效表達(dá)重組蛋白的方法》中公開(kāi)的三步流加法培養(yǎng)包含有抗CD25抗體序列的CHO細(xì)胞，與利用NSO細(xì)胞作為宿主細(xì)胞培養(yǎng)相比，結(jié)果顯示，獲得的與人體天然糖基化形式一致的抗體糖基化形式大大增加，從而降低了導(dǎo)致免疫原性的可能，而且半乳糖不完全修飾的比例也顯著降低。經(jīng)檢測(cè)證實(shí)，構(gòu)建的工程細(xì)胞中無(wú)內(nèi)源性的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，利用該工程細(xì)胞培養(yǎng)獲得的抗體沒(méi)有病毒的污染。本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)培養(yǎng)方法進(jìn)行進(jìn)一步改進(jìn)，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明公開(kāi)了一種利用CHO細(xì)胞流加培養(yǎng)方式高效表達(dá)抗CD25抗體的方法，為三步流加培養(yǎng)法，即a)細(xì)胞培養(yǎng)溫度36。C一38。C，PH值6.5—6.9，培養(yǎng)24—48小時(shí)，當(dāng)動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)至2.0—3.5X106cells/ml時(shí)，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)加流加培養(yǎng)基，進(jìn)行流加培養(yǎng)，流加稀釋率為0.1—0.3/天，流加培養(yǎng)時(shí)間72—96小時(shí)；b)細(xì)胞培養(yǎng)溫度降至32.5。C一35。C，PH值7.0—7.3，進(jìn)行流加培養(yǎng)，流加稀釋率為0.1—0.2/天，流加培養(yǎng)時(shí)間120—144小時(shí)；c)停止流加，細(xì)胞培養(yǎng)溫度升至36。C一38。C，PH值7.0—7.3，進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為24—48小時(shí)，其特征在于步驟a)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加半乳糖20100mg/L，流加培養(yǎng)基中添加葡萄糖3—12mmol/L和谷氨酰胺5.0—7.8mmol/L，控制培養(yǎng)過(guò)程中葡萄糖濃度維持在0.5-2.0g/L。更優(yōu)選，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加半乳糖50mg/L，流加培養(yǎng)基中添加葡萄糖7mmol/L和谷氨酰胺6.0mmol/L，控制培養(yǎng)過(guò)程中葡萄糖濃度維持在0.8-1.0g/L。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)產(chǎn)物糖基化的比例進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明無(wú)血清培養(yǎng)基中添加半乳糖可以顯著增加G2型糖基化的比例，從而降低由糖基化差異帶來(lái)的免疫原性及抗體的功能差異問(wèn)題。培養(yǎng)過(guò)程及產(chǎn)品的病毒檢測(cè)通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，包括細(xì)胞形態(tài)觀察、紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)、傳代細(xì)胞培養(yǎng)、透射電鏡檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒、動(dòng)物和雞胚試驗(yàn)、動(dòng)物抗體產(chǎn)生試驗(yàn)、逆轉(zhuǎn)錄酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明CHO細(xì)胞均為陰性，達(dá)到了本發(fā)明的目的。圖l:CHO細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測(cè)結(jié)果。圖2:NSO細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測(cè)結(jié)果。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例、實(shí)驗(yàn)例進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而應(yīng)當(dāng)理解，列舉這些實(shí)施例、實(shí)驗(yàn)例只是為了起說(shuō)明作用，而并不是用來(lái)限制本發(fā)明。實(shí)施例l真核表達(dá)載體的構(gòu)建抗體序列參見(jiàn)，中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?9109618.3，發(fā)明名稱為《新的白細(xì)胞介素-2受體特異性免疫球蛋白》中公開(kāi)的序列。表達(dá)載體的構(gòu)建方法參見(jiàn)中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?2112493.0，發(fā)明名稱為《重組的抗CD25單克隆抗體、其編碼序列及應(yīng)用》中公開(kāi)的方法。實(shí)施例2人源化抗體的穩(wěn)定表達(dá)與純化參見(jiàn)中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?2112493.0，發(fā)明名稱為《重組的抗CD25單克隆抗體、其編碼序列及應(yīng)用》中公開(kāi)的方法。實(shí)施例3優(yōu)化的大規(guī)模無(wú)血清培養(yǎng)采用專利200610147535.7"—種高效表達(dá)重組蛋白的方法"中三段流加法進(jìn)行，培養(yǎng)過(guò)程中，發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行了以下的優(yōu)化在步驟l)中，于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加半乳糖50mg/L，流加培養(yǎng)基中添加葡萄糖7mmol/L和谷氨酰胺6.0mmol/L，控制培養(yǎng)過(guò)程中葡萄糖濃度維持在0.8-1.0g/L。實(shí)施例4優(yōu)化的大規(guī)模無(wú)血清培養(yǎng)采用專利200610147535.7"—種高效表達(dá)重組蛋白的方法"中三段流加法進(jìn)行，培養(yǎng)過(guò)程中，發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行了以下的優(yōu)化步驟l)中，于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加半乳糖100mg/L，流加培養(yǎng)基中添加葡萄糖3mmol/L和谷氨酰胺5.0mmol/L，控制培養(yǎng)過(guò)程中葡萄糖濃度維持在0.5-0.6g/L。實(shí)施例5優(yōu)化的大規(guī)模無(wú)血清培養(yǎng)釆用專利200610147535.7"—種高效表達(dá)重組蛋白的方法"中三段流加法進(jìn)行，培養(yǎng)過(guò)程中，發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行了以下的優(yōu)化步驟l)中在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加半乳糖20mg/Lmg/L，流加培養(yǎng)基中添加葡萄糖12mmol/L和谷氨酰胺7.8mmol/L，控制培養(yǎng)過(guò)程中葡萄糖濃度維持在2.0g/L。對(duì)實(shí)施例35得到的產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，控制培養(yǎng)過(guò)程中葡萄糖濃度通過(guò)在線監(jiān)測(cè)，PID控制葡萄糖濃度維持在0.5-2.0g/L，葡萄糖濃度在此范圍有利于葡萄糖的完全利用及較少的乳酸堆積，使培養(yǎng)過(guò)程pH維持在較好的狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)例l培養(yǎng)產(chǎn)物糖基化比較按實(shí)施例3、實(shí)施例4、實(shí)施例5步驟進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后產(chǎn)物糖基化比較(利用BECKMAN毛細(xì)管電泳結(jié)合BECKMAN糖基化檢測(cè)試劑盒(BeckmanCoulter,477600)按說(shuō)明書(shū)中的方法進(jìn)行操作)。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表格中數(shù)值為各種糖基化形式所占的百分含量，其中G2型為最完整的糖基化形式。各種糖基化形式的結(jié)構(gòu)如下<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>無(wú)血清培養(yǎng)基中添加半乳糖，可以顯著增加G2型糖基化的比例，這種完全半乳糖化形式與人體內(nèi)天然的糖基化形式一致，從而降低由糖基化差異帶來(lái)的免疫原性及抗體的功能差異問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)例2培養(yǎng)過(guò)程及產(chǎn)品的病毒檢測(cè)NSO及CHO(按實(shí)施例35步驟進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后得到的產(chǎn)物)細(xì)胞病毒檢測(cè)結(jié)果如下表所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)—+傳代細(xì)胞培養(yǎng)—+透射電鏡檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒(透射電子顯微鏡觀察)-+動(dòng)物和雞胚試驗(yàn)—+動(dòng)物抗體產(chǎn)生試驗(yàn)—+逆轉(zhuǎn)錄酶活性測(cè)定—+相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法按國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局《生物組織提取制品和真核細(xì)胞表達(dá)制品的病毒安全性評(píng)價(jià)技術(shù)審評(píng)一般原則》、《人用單克隆抗體質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》進(jìn)行，方法參照《中華人民共和國(guó)藥典》三部附錄。《中華人民共和國(guó)藥典》三部附錄IXM逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢査法?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》三部附錄xnc病毒外源因子檢查法?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》三部附錄XIIH鼠源性病毒檢査法。逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2，結(jié)果表明，CHO細(xì)胞中未見(jiàn)逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，NSO細(xì)胞中，可見(jiàn)大量的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒(圖中黑色的小點(diǎn))。權(quán)利要求1.一種抗CD25抗體的培養(yǎng)方法，包括以下步驟a)細(xì)胞培養(yǎng)溫度36℃-38℃，PH值6.5-6.9，培養(yǎng)24-48小時(shí)，當(dāng)動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)至2.0-3.5×106cells/ml時(shí)，在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中補(bǔ)加流加培養(yǎng)基，進(jìn)行流加培養(yǎng)，流加稀釋率為0.1-0.3/天，流加培養(yǎng)時(shí)間72-96小時(shí)；b)細(xì)胞培養(yǎng)溫度降至32.5℃-35℃，PH值7.0-7.3，進(jìn)行流加培養(yǎng)，流加稀釋率為0.1-0.2/天，流加培養(yǎng)時(shí)間120-144小時(shí)；c)停止流加，細(xì)胞培養(yǎng)溫度升至36℃-38℃，PH值7.0-7.3，進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為24-48小時(shí)；其特征在于，在步驟a)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加半乳糖20～100mg/L，流加培養(yǎng)基中添加葡萄糖3-12mmol/L和谷氨酰胺5.0-7.8mmol/L，控制培養(yǎng)過(guò)程中葡萄糖濃度維持在0.5-2.0g/L。2.權(quán)利要求1所述的抗CD25抗體的培養(yǎng)方法，其特征在于在步驟a)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加半乳糖50mg/L，流加培養(yǎng)基中添加葡萄糖7mmol/L和谷氨酰胺6.0mmol/L，控制培養(yǎng)過(guò)程中葡萄糖濃度維持在0.8-1.0g/L。3.權(quán)利要求1所述的抗CD25抗體的培養(yǎng)方法，其特征在于在步驟a)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加半乳糖100mg/L，流加培養(yǎng)基中添加葡萄糖3mmol/L和谷氨酰胺5.0mmol/L，控制培養(yǎng)過(guò)程中葡萄糖濃度維持在0.5-0.6g/L。4.權(quán)利要求1所述的抗CD25抗體的培養(yǎng)方法，其特征在于在步驟a)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加半乳糖20mg/L，流加培養(yǎng)基中添加葡萄糖12mmol/L和谷氨酰胺7.8mmol/L，控制培養(yǎng)過(guò)程中葡萄糖濃度維持在2.0g/L。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種抗CD25抗體的培養(yǎng)方法，在三段流加培養(yǎng)的基礎(chǔ)上在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加半乳糖20～100mg/L，流加培養(yǎng)基中添加葡萄糖3-12mmol/L和谷氨酰胺5.0-7.8mmol/L，控制培養(yǎng)過(guò)程中葡萄糖濃度維持在0.5-2.0g/L。利用本發(fā)明公開(kāi)的培養(yǎng)方法可以減少細(xì)胞表達(dá)的蛋白與人體天然存在蛋白的差異，提高培養(yǎng)產(chǎn)物對(duì)人體的安全性。文檔編號(hào)C12P21/08GK101624614SQ200910057759公開(kāi)日2010年1月13日申請(qǐng)日期2009年8月14日優(yōu)先權(quán)日2009年8月14日發(fā)明者何進(jìn)秋,盛侯,郭亞軍,郭懷祖,錢衛(wèi)珠申請(qǐng)人:上海抗體藥物國(guó)家工程研究中心有限公司