專利名稱：乳酸克魯維斯酵母菌表達外源白蛋白的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術工程領域中的一種乳酸克魯維斯酵母菌表達外源白蛋白 的方法。
背景技術：
自從Lawn等人[Lawn RM ,Adelman J ,Bock S C et al. 1981 。 The sequence of human serum albumin cDNA and its expression in E. coli. Nucleic Acids Research, 1981, 9 ( 22) : 6103-6114]首次報道了重組人血清白蛋白(rHSA)成功在大腸桿菌 表達系統(tǒng)中獲得表達以來，rHSA分別在酵母、動物、植物表達系統(tǒng)中獲得表達。 比較成熟的表達體系主要是畢赤酵母表達系統(tǒng)，原因是酵母表達系統(tǒng)表達量高 (克級)，且提取純化比較方便。例如日本的綠十字公司(GREEN CROSS CO. LTD) 利用畢赤酵母表達系統(tǒng)生產的rHSA,其表達量可達7g/L ，美國富源集團曾報道其 i"HSA表達產量可達20g/L[于在林，富巖.高效表達人血清白蛋白酵母菌株的構建
及發(fā)酵純化工藝.CN 1618967A, 2004-08-27]。甲醇酵母基因表達系統(tǒng)是一種最
近發(fā)展迅速的外源蛋白質生產系統(tǒng)。甲醇酵母是可利用甲醇作為唯一碳源的酵 母，主要有H. Polymorpha、 Candida Bodinii、 Pichia Pastoris即畢赤酵母三種， 其中畢赤酵母作為基因表達系統(tǒng)使用得最多、最廣泛。與以往的基因表達系統(tǒng)相 比，它具有比較的高表達特性，已被認為是最具有發(fā)展前景的生產蛋白質的工具 之一。但是，畢赤酵母表達的白蛋白對環(huán)境有一定危害，畢赤酵母是嗜甲醇酵 母，反應過程對甲醇的運用第一步是將甲醇氧化形成甲醛和過氧化氫[Ledeboer, A.M., Edens, L.， Maat， J., et al. (1985). Molecular cloning and characterization of a gene coding for methanol oxidase in Hansenula polymorpha. M/c/. Jc/cfe 13， 3063-3082.].甲醛和過氧化氫均是對環(huán)境有害的物質。而且，近年來發(fā)現畢赤酵 母是罕見和新生的"條件性致病性真菌病"元兇，在免疫力低下的病人當中引起疾 病，或其它易感因素病例，例如早產，新生兒重量不足、臨床產期延長、以及產 道不開張等疾病。因為畢赤酵母生產過程及副產品有甲醇、甲醛、和過氧化氫， 這些副產品對環(huán)境均有影響。其次，畢赤酵母細胞不是食用菌類，人類對它不適
4應。雖然能夠對蛋白質糖基化，但是為高度木糖醇型，表達的重組藥物在體內半 衰期很短，并有潛在的免疫反應。而本發(fā)明所利用的克魯氏乳酸酵母細胞 (Kluyveromyces K. lactis J是食用菌類，人類在食品工業(yè)方面利用其食用菌類 (KluyveromycesK. lactis)進行大規(guī)模生產蛋白質的歷史已有十幾年，從最廣
泛食用的乳制品中分離出的對人無過敏性的乳糖陽性乳酸克魯維斯酵母可食用 可食用乳糖陽性菌株BVP型(Kluyveromyces lactis BVP)，人類對它已經適應。
其蛋白質糖基化產物無免疫反應或免疫反應低；經過修飾的表達的重組藥物在體
內半衰期較長。是一種非常有前景的食用酵母菌細胞表達體系并對哺乳動物細胞
表達體系形成了有力挑戰(zhàn)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是公開了一種乳酸克魯維斯酵母菌表達外源白蛋白的方法。 該方法利用基因工程技術與人源化乳酸克魯維斯酵母可食用乳糖陽性菌株BVP 型乳酸克魯維斯酵母(Kluyveromyces lactis BVP)細胞的優(yōu)點，利用重組轉 化技術篩選出來可食用菌表達和大量地生產均一、糖基化相同的重組白蛋白，包 括重組人白蛋白。以克服上述畢赤酵母表達白蛋白系統(tǒng)的某些缺陷。 實現本發(fā)明之目的的技術解決方案如下-
一種乳酸克魯維斯酵母菌表達外源白蛋白的方法，其特征包括如下步驟 (1)進行人血/牛血白蛋白氨基酸序列的設計與選擇，反向翻譯設計人造基因序 列，優(yōu)化白蛋白編碼基因密碼子，選擇乳酸克魯維斯酵母喜歡的密碼子，形成優(yōu) 化密碼子后的白蛋白基因序列，通過化學合成和生物反應進行白蛋白基因的合 成，獲得重組后的牛/人白蛋白基因；(2)重組后的牛/人白蛋白基因經克隆進入 pBVPBluescript SK質粒，篩選后獲得白蛋白基因，再克隆進入表達載體 pBVP-Art，再分別獲得pArtl/ pArt2牛/人白蛋白基因表達載體；(3)將獲得的 pArtl/pArt2牛/人白蛋白基因表達載體導入乳酸克魯維斯酵母菌細胞，利用原生 質球法進行細胞轉化；(4)進行人/牛白蛋白的表達，篩選出陽性高表達菌株， 表達產物經聚丙烯酰胺凝膠電泳后，采用抗體標記進行人/牛白蛋白的鑒定。
所述的一種乳酸克魯維斯酵母菌表達外源白蛋白的方法，其特征是對乳酸克 魯維斯酵母細胞株進行篩選，獲得對人無過敏性的乳酸克魯維斯酵母可食用乳糖 陽性菌株BVP型乳糖陽性乳酸克魯維斯酵母可食用乳糖陽性菌株(Kluyveromyces lactis BVP)，該該菌株含有強啟動子LAC4。
所述的一種乳酸克魯維斯酵母菌表達外源白蛋白的方法，其特征是，對獲得 的乳酸克魯維斯酵母可食用乳糖陽性菌株BVP型乳酸克魯維斯酵母可食用乳糖 陽性菌株細胞轉化和克隆篩選包括如下步驟
(1) 利用pArtBVP表達質粒載體與合成的目的基因克隆，篩選獲得質?？寺?pArt系列質粒克隆、轉化細胞，，。分別將pArt質粒轉化到乳酸克魯維斯酵母感 受態(tài)細胞，獲得食用工程菌轉化細胞。
(2) 進行食用工程菌轉化細胞的克隆篩選，首先進行單拷貝細胞篩選，其次 進行雙拷貝細胞和多拷貝細胞篩選，獲得多個整合進入食用工程菌染色體的雙克 隆細胞或多克隆細胞。
(3) 挑選陽性人白蛋白和牛白蛋白高表達菌株在完全型或基本型培養(yǎng)液中生 長，表達生產大量的重組白蛋白。
(4) 檢查多克隆或單克隆轉化后細胞是否分泌白蛋白，采用SDS —PAGE電泳 法、WB免疫印跡法檢測克隆轉化細胞是否分泌白蛋白，用ELISA定量法測定白 蛋白表達量。
所述的一種乳酸克魯維斯酵母菌表達外源白蛋白的方法，其特征是將受態(tài)細 胞的細胞轉化混合物涂于含有乙酰胺的酵母基本碳源(YCB)培養(yǎng)基上，YCB培 養(yǎng)基含有食用菌細胞生長所需的所有營養(yǎng)物質和碳源，但缺少氮源，只有當乙酰 胺被乙酰胺酶即由沐LAC1上的amdS基因表達降解為氨時，它才能作為氮源被 利用，從而促使轉化的細胞長成菌落后才能在平板上挑選陽性克隆。
所述的一種乳酸克魯維斯酵母菌表達外源白蛋白的方法，其特征是PART質 粒克隆經過整合后進入細胞的基因工程克隆可以被生物體認可，當作自源性基因 表達出人和動物的白蛋白，從細胞內釋放到細胞外的培養(yǎng)液中；分泌表達單元中 的分泌信號子能被克魯氏乳酸酵母的蛋白質分泌系統(tǒng)所識別，重組白蛋白被分泌 到細胞外。
所述的一種乳酸克魯維斯酵母菌表達外源白蛋白的方法，其特征是多克隆或 單克隆轉化后細胞株可以很穩(wěn)定地表達白蛋白，利用食品生物工程的生物反應器 進行工業(yè)化生產，可以大量持續(xù)地表達白蛋白。
本發(fā)明具有如下的積極效果與技術優(yōu)勢1、本發(fā)明所述的食用菌將外源性的酵母化的基因承認為內源性的基因，因此 不用反復克隆，若采用大型發(fā)酵罐來生產，可以24小時不斷發(fā)酵，產量高、成 本低、具有很大的競爭性。
2、 第二是傳統(tǒng)的克隆法表達的效率和產量均均比本方法低。傳統(tǒng)的克隆大多 采用大腸桿菌表達蛋白質，在蛋白活性與功能上均比本方法要差。
3、 本發(fā)明所述的在乳酸克魯維斯酵母細胞中表達的蛋白質可以進行真核蛋白 質所需的折疊和糖基化。
4、 本發(fā)明所述的食用菌大量表達排出的克隆蛋白質是一個a交配子和目標蛋 白(如白蛋白)結合在一起的融合蛋白質。融合蛋白質在被排出的同時，食用菌 內的Kex蛋白酶會自動將a交配子定點切斷，釋放出活性的目標蛋白(如白蛋 白)到細胞外面，蛋白質(沒有詳細說明圖5);。因此，不用采取外加的昂貴的 蛋白酶來切斷蛋白，節(jié)省了工序與成本，提高了純化率。
5、 以前的血液產品采血的血源有限，手段易污染，血液產品很難分離提純， 終極產品仍然有同源的二三種蛋白混在一起；而本方法只是專一性地大量表達釋 放一種外源性(人或動物)蛋白，容易提純到高純度。(圖5如何釋放？)
6、 本發(fā)明所述的食用菌體可以回收焙干后作為酵母粉或回收培養(yǎng)新的食用菌， 也可以作為飼料；具有環(huán)保型生產過程及環(huán)保產品生產的優(yōu)越性。


圖1是本發(fā)明所述的方法流程框圖示意圖。 圖2是本發(fā)明所述的優(yōu)化密碼子后的白蛋白基因序列圖。 圖3是本發(fā)明所述的白蛋白目的基因合成后分離凝膠電泳鑒定圖。 圖4是本發(fā)明所述的白蛋白質粒克隆時pBVP表達質粒載體示意圖。 圖5是所述的a交配子融合蛋白質被食用菌株分泌到細胞培養(yǎng)液中示意圖。 圖6是所述的多拷貝細胞篩選獲得的瓊脂糖膠凝體電泳分析圖。 圖7是所述的鑒定陽性牛/人白蛋白高表達菌株WB結果圖。 圖8是檢測克隆轉化細胞是否分泌白蛋白SD5-PAGE電泳圖。 圖9是利用食品生物工程的生物反應器大量持久地表達白蛋白示意圖。
具體實施例方式
結合附圖給出實施例對本發(fā)明做具體的進一步說明。從圖1可知第一步的設計是重要的。對人血白蛋白氨基酸序列的設計而言，人血白蛋白基因有15個外 顯子和14個內含子，編碼每個結構域的基因組內含子、外顯子結構大體相同。 人血白蛋白含有3個保守的白蛋白結構域:N端前18個氨基酸為信號肽，分泌 表達于細胞外。18個氨基酸的信號肽和6個氨基酸的前肽在轉運和分泌過程中 被切除，成熟的人血白蛋白由585個氨基酸組成，理論相對分子質量約為66. 5 kD，等電點為5. 67，其二級結構的疏水肽段和親水肽段幾乎等量分布，表現出 球蛋白的特征。人血白蛋白信號肽后有三個同源的白蛋白結構域，每個結構域 內部在相對應的位置均含有5 6個二硫鍵。在氨基酸序列的設計中，首先把 信號多肽mkwvtfisimfssays切除，再將前肽rgvfrr去掉，留下成熟白蛋白585個 氨基酸組成。針對牛血白蛋白氨基酸序列的設計而言，牛血白蛋白分子由三個相 同的蛋白結構域組成，共有九個蛋白弧圈的(L1-L9)由17個二硫鍵連接。牛白 蛋白結構是主要是a螺旋結構域(67%)，沒有e板塊。每個a螺旋有兩個亞蛋 白結構域。牛白蛋白一級結構在細胞外蛋白質之中是異常的，擁有一個二硫鍵 (Cys-34)組。每一個蛋白分子結構域可以被劃分成10個a螺旋片段。同樣的， 牛血白蛋白總共有約607個氨基酸。與人血白蛋白類似，也有18個氨基酸的信 號肽和6個氨基酸的前肽在轉運和分泌過程中被切除，成熟的牛血白蛋白由 582個氨基酸組成，理論相對分子質量約為64. 5 kD，等電點為4. 7，其二級 結構的疏水肽段和親水肽段幾乎等量分布，表現出球蛋白的特征。在牛血白蛋白 氨基酸序列的設計中，首先把信號多肽mkwv他sllHfssays切除，再將前肽rgvfrr 去掉，留下成熟白蛋白582個氨基酸組成(Yi Y. and Chen， Q.[陳群泉],Synthetic Proteins and Derivatives as the Replacement of Bovine Blood Products, Patent Disclosure, USPTO 602757, 2006, pi-27)。
選擇好蛋白質的氨基酸序列之后，就可以通過反向翻譯過程設計人造基因序 列。要優(yōu)化白蛋白編碼基因密碼子，首先要選擇乳酸克魯維斯酵母喜歡的密碼子。 乳酸克魯維斯酵母喜歡的密碼子總共有21個最佳密碼子。在選擇最佳密碼子時， 為了避免因為偏愛密碼子而造成的AT或GC堿基過于豐富、密碼子重復、或容易 使堿基錯誤配對的片斷。然后再將基因分成約150個寡核苷酸，每個寡核苷酸含 40-60個堿基。優(yōu)化密碼子后的白蛋白編碼基因序列，與實際白蛋白基因序列是 不相同的，相似度為73-75%之間。但是，優(yōu)化密碼子后的白蛋白編碼基因序列翻譯成蛋白質以后，與實際的或設計的白蛋白蛋白質氨基酸序列完全相同。圖2 是本發(fā)明所述的優(yōu)化密碼子后的牛/人白蛋白基因序列圖。
然后通過化學合成和生物反應進行白蛋白基因的合成，化學合成首先采用標 準的亞磷酰胺化學反應合成寡核苷酸，在固相寡核苷酸合成儀(MiiltiSyn，UK) 進行。其次連接酶粘合鏈反應(ligase chain reaction),再其次聚合反應 (Assembly);最后將聚合反應(Assembly)或鏈合反應(ligase chain reaction) 形成的基因片段通過PCR反應擴增，合成后的可能的白蛋白基因篩選采用Chen 的方法(Yi Y. and Chen， Q[陳群泉].,Synthetic Proteins and Derivatives as the Replacement of Bovine Blood Products, Patent Disclosure, USPTO 602757， 2006， pl_27)。反應過程簡述如下PCR擴增反應產物回收及連接反應 取50-100 yl聚合酶擴增反應終產品，通過瓊脂糖凝膠電泳，從瓊脂糖凝膠上切 下含白蛋白基因片斷的電泳條帶，按回收試劑盒使用說明書進行PCR產物凈化 提取。取提取的PCR產物4 wl, pBluescriptll SK載體1 y 1， 5X緩沖液2 u 1， T4麗A連接酶l Ul,加水至IOpI, 16。C過夜。重組質粒轉化及鑒定用CaC12 法轉化DH5A感受態(tài)宿主菌，涂布于含有氨芐青霉素(AMP)和異丙基硫代2B2D2 半乳糖苷(IPTG)的LB培養(yǎng)基平板，37'C培養(yǎng)過夜。挑取白色菌落進行培養(yǎng)提 純陽性質粒克隆進行鑒定。吸取20ul陽性質粒克隆進行限制酶切，同時進行 凝膠電泳鑒定和PCR測序鑒定。吸取10ul含白蛋白基因片段(100ng/ul)的 pBluescriptll SK載體(100ng/ul),用Sal I和Xho I雙酶切下的目的基因 片段，驗證基因片段長度，確認凝膠電泳鑒定經過限制酶切與設計的分子量大小 吻合得到相應的白蛋白基因。圖3顯示的是獲得的白蛋白目的基因分離鑒定圖。 PCR測序鑒定通過正向和反向測序驗證，與設計的人造基因譜完全一致。
獲得重組后的牛/人白蛋白基因后，取雙酶切下的目的白蛋白基因片段，同時 用Sail和Xho I雙酶切l(wèi)Oul含白蛋白基因片段(100ng/ u 1)的pBVP載體，經試 劑盒回收后,用T4 DNA連接酶連接,氯化鈣法轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，篩選得 到白蛋白基因表達載體pBVP-Art系列。用這個方法分別得到pArtl牛白蛋白基 因表達載體，pArt2人白蛋白基因表達載體；參見圖4pBVP表達質粒載體。圖4 詳細說明pKLAClBVP (9051 bp)包含5'和3'兩個末端LAC4啟動子。在載體導 入由內酰胺酶基因(e-lactamase, AmpR)和pMBl起點(ori)基因使其能夠在大腸桿菌(E.Coli)中表達。乳酸克魯維斯酵母食用菌的a交配子(a-MF)分泌 引導序列(a -MF)，雙克隆位點(DCS)和LAC4啟動子終止碼(Transcription Terminator, TT)緊隨3'端的PLAC4啟動子下游。食用菌的ADH2啟動子(PADH2) 驅動乙酰胺酶(acetamidase)選擇標志基因(amdS)的表達。目的基因被克隆到 pBVP上的a交配子下游，a -MF最終將在高爾基體上被剪切以使目的蛋白質分泌 表達。表達質粒載體可以由限制酶Sail或BstX I切斷后，去掉內酰胺酶基因(0 -lactamase, AmpR)和pMBl起點(ori)基因，提純線性的目的基因片段來整合 插入食用菌染色體內的LAC4啟動子區(qū)域。需要說明的是對乳酸克魯維斯酵母細 胞株進行篩選，獲得對人無過敏性的乳糖陽性乳酸克魯維斯酵母可食用乳糖陽性 菌株(Kluyveromyces lactis BVP)，該該菌株因含有強啟動子LAC4因而是非常 重要的。該食用菌株的背景決定食用菌中的調控子LAC4位點的抑制受到轉錄激 活因子Lac9p (KLGal4p)的調控。菌株與菌株間的Lac9p的表達水平的微小差 異顯示了 PLAC4的糖抑制水平。對于某些實驗用食用菌株中，表達由突變的強啟 動子LAC4調控，該菌株可以在完全型或基本型培養(yǎng)液中生長，能夠很快到達高 密度和工業(yè)化的生產水平，并表達生產大量的重組蛋白質。野生型PLAC4在含有 半乳糖或乳糖培養(yǎng)基中調控的表達水平比含有葡萄糖培養(yǎng)基中高100倍。該食用 菌含有pLACl，可以嵌入含有pLAC的表達載體pBVP，當含有pLAC的表達載體一 旦轉化進食用菌細胞，含有pLAC的表達載體就會插入到該食用菌染色體的LAC4 位點的啟動子區(qū)域，形成單拷貝或多拷貝細胞的數量，以便獲得更高產量的蛋白 質。利用pBVP-Art質粒轉化乳酸克魯維斯酵母宿主細胞，獲得食用工程菌轉化 細胞，即含有pLAC的表達載體。要達到蛋白質分泌物，白蛋白基因必須被克隆 入pLACl下游的食用菌a交配子領域，導致a交配子融合蛋白質的表達。a交配 子領域指導融合蛋白質有效地通過酵母分泌途徑。a交配子融合蛋白質經過核膜 和高爾基體中信號肽酶和Kex蛋白酶切斷以后，被食用菌株以天然蛋白質的形式 分泌到細胞培養(yǎng)液中，，參見圖5蛋白質分泌過程說明在細胞核中，編碼有ci 交配子a -MF結構域(A)和目的重組蛋白質(B)的基因與酵母染色體整合。PLAC4 啟動子調控表達。 一旦融合蛋白質開始表達，位于a交配子a-MF上的信號肽就 會指導融合蛋白質(C-A-B體)轉運到內質網(ER)膜上，在此信號肽酶將信號 肽(C)切除。分泌小泡將融合蛋白質轉運至高爾基體，Kex蛋白酶在此將a交配子(i-MF結構域(A)切除，釋放成熟的目的蛋白質。隨后，目的蛋白質通過 分泌小泡運輸到細胞膜，從那里分泌到胞外。人源化乳酸克魯維斯酵母食用菌株 含有pLACl，當它一旦轉化進食用菌細胞，表達載體pBVP插入到食用菌染色體 組的LAC4位點的啟動子區(qū)域，成為整合表達載體，表達可分泌的酵母重組蛋白 質。對獲得的乳酸克魯維斯酵母可食用乳糖陽性菌株細胞轉化和克隆篩選包括如 下步驟
(1) 利用pArt質粒克隆、轉化細胞，分別將pArt質粒轉化到乳酸克魯維
斯酵母感受態(tài)細胞。實施例如下①挑單克隆接種到5ml YPD培養(yǎng)基中，在30'C 搖床中，以每分鐘2000轉培養(yǎng)16H ;②用細胞計數板確定酵母培養(yǎng)物的密度， 取2.5Xl(f個細胞，離心沉淀細胞，6000g離心5min;③然后棄上清，將細胞 重懸在1. 0ml無菌水中； 吸取0. lml細胞懸液到一個新1. 5ml離心管，13000g 離心30sec，棄上清；⑤然后向其中加入0. 36ml轉化混合物(含PEG3350 50%W/V， 醋酸鋰1M，攜帶DNA2mg/ml， pArt質粒)，將細胞重新懸浮，⑥將與細胞混合 好的轉化混合物在42。C水浴中熱激5分鐘，熱激完的細胞立即進行13000g離心 30sec沉淀細胞，棄上清；⑦用1.0ml無菌超純水重懸洗滌細胞，13000g離心 30sec沉淀細胞，棄上清；⑧取0. lml細胞懸液均勻涂布在YCB平板上，倒置放 在培養(yǎng)箱中30。C培養(yǎng)3-5天，直到較大的菌落形成；⑨在YPD培養(yǎng)基平板上挑 選陽性克隆，挑選單個菌落，在YCB平板上分離；⑩挑選經劃線分離的單菌落在 5mlYPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得食用工程菌轉化細胞。
(2) 進行食用工程菌轉化細胞的克隆篩選。實施例如下首先進行單拷貝 細胞篩選，將挑選的單個菌落做活體PCR，檢査整合表達載體pArt質粒系列是 否能整合插入到食用工程菌宿主的染色體組當中；①將轉化后的食用工程菌在含 有5毫升摩爾乙酰胺的YCB瓊脂板生長后收獲單細胞克?。虎趯渭毎寺?浮在含有10 mg/ml溶壁酶(Lyticase， Sigma弁L-2524)的25微升1M的山梨糖醇
(sorbital)溶液中，混合后在37°C孵化1小時；③孵化后取15 pl作PCR模版， 2plPl/P2引體，PCR反應總體積100pl中。PCR反應條件如下95。C變性10min， 80。C降火2min，加入Taq DNA聚合酶(NEB #M0267)，進行30個循環(huán)(95。C變性 30s， 50。C退火30s和72。C延伸3min) 。 72。C延伸10min。在1%瓊脂糖膠凝體電 泳分析10y l擴增反應物。其次進行雙拷貝細胞和多拷貝細胞篩選，參見圖6，。獲得多個整合進入食用工程菌染色體的雙克隆細胞或多克隆細胞。
(3)進行人/牛白蛋白的表達，篩選出陽性高表達菌株。表達產物經聚丙烯 酰胺凝膠電泳后，采用抗體標記進行人/牛白蛋白的鑒定。具體而言是挑選陽性 人白蛋白和牛白蛋白高表達菌株，在完全型或基本型培養(yǎng)液中生長，能夠很快到 達高密度，并表達生產大量的重組白蛋白。在液體培養(yǎng)基中誘導表達，表達產物 經聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉移到NC薄膜，采用特定的牛白蛋白抗體(ProMab， USA)和人白蛋白抗體(Sigma， USA)在免疫印跡法(Western blotting) 上 標記鑒定結果證明獲得與天然人白蛋白和牛白蛋白分子量相同的具有同樣空間 結構的產品(參見圖7)。
(4)檢查多克隆或單克隆轉化后細胞是否分泌白蛋白；實施例如下在搖瓶培 養(yǎng)條件下每升發(fā)酵液中含有30-50毫克白蛋白。白蛋白的分泌pKLACl轉化子在 YCB完全培養(yǎng)基中經不同時間的搖瓶培養(yǎng)后，培養(yǎng)液經離心去菌體，上清液用丙 酮沉淀，然后進行SD5-PAGE電泳，取上樣15微升原始酵母培養(yǎng)液，電泳后用考 馬斯亮藍染色，分子量在65000道爾頓左右，與預期的白蛋白的分子量相符。圖 8是部分ART3培養(yǎng)基SDS-PAGE檢測，上樣15ul培養(yǎng)上清。其中1， 3， 8號為 陽性，第10號條帶是蛋白標記(Marker)。
用ELISA定量法測定白蛋白表達量，實施例如下將標準品用100ml樣品稀釋 液準確復溶(200ng/ml)。取10u 1,用樣品稀釋液作5次倍比稀釋，得濃度為200、 150、 100、 50、 25、 10 ng/ml 6個標準點。每孔加不同濃度標準品或待測樣品IO U 1,空白對照中加入樣品稀釋液10u 1, 37。C孵育90min,加酶標抗體工作液IOO lU，顯色后，用酶標儀檢測492nm OD值。結果顯示白蛋白帶在培養(yǎng)18小時后即出 現，并隨培養(yǎng)時間的延長而加深，到96小時呈直線趨向最高值，然后分泌速度減 慢，但是仍然增加分泌量。7天后最高可達；用上述方法鑒定篩選出陽性高表達 菌株。需要提特別指出的是，將受態(tài)細胞的細胞轉化混合物涂于含有乙酰胺的酵 母基本碳源(YCB)培養(yǎng)基上是非常重要的一步，YCB培養(yǎng)基含有食用菌細胞生長 所需的所有營養(yǎng)物質和碳源，但是缺少氮源，只有當乙酰胺被乙酰胺酶即由 pKLACl上的amdS基因表達降解為氨時，它才能作為氮源被利用，從而促使轉化的 細胞長成菌落后才能在平板上挑選陽性克隆。pART質?？寺〗涍^整合后進入細胞 的基因工程克隆可以被生物體認可，當作自源性基因表達出人和動物的白蛋白，從細胞內釋放到細胞外的培養(yǎng)液中。分泌表達單元中的分泌信號子能被克魯氏乳 酸酵母的蛋白質分泌系統(tǒng)所識別，重組白蛋白被分泌到細胞外。多克隆或單克隆 轉化后細胞株可以很穩(wěn)定地表達白蛋白，利用食品生物工程的生物反應器進行工 業(yè)化生產，可以大量長期地表達白蛋白。參見圖9可知通過1、 2、 3級生物反應器
發(fā)酵后經過細胞分離器將上清液與干物質分離獲得液體保健品，干物質經過兩級 提純通過冷凍干燥機獲得白蛋白粉片狀產品。
權利要求
1、一種乳酸克魯維斯酵母菌表達外源白蛋白的方法，其特征包括如下步驟(1)進行人血/牛血白蛋白氨基酸序列的設計與選擇，反向翻譯設計人造基因序列，優(yōu)化白蛋白編碼基因密碼子，選擇乳酸克魯維斯酵母喜歡的密碼子，形成優(yōu)化密碼子后的白蛋白基因序列，通過化學合成和生物反應進行白蛋白基因的合成，獲得重組后的牛/人白蛋白基因；(2)重組后的牛/人白蛋白基因經克隆進入pBVP質粒，篩選后獲得白蛋白基因表達載體pBVP-Art，再分別獲得pArt1/pArt2牛/人白蛋白基因表達載體；(3)將獲得的pArt1/pArt2牛/人白蛋白基因表達載體導入乳酸克魯維斯酵母菌細胞，利用原生質球法進行細胞轉化；(4)進行人/牛白蛋白的表達，篩選出陽性高表達菌株，表達產物經聚丙烯酰胺凝膠電泳后，采用抗體標記進行人/牛白蛋白的鑒定。
2、 根據權利要求l所述的一種乳酸克魯維斯酵母菌表達外源白蛋白的方法，其特征 是對乳酸克魯維斯酵母細胞株進行篩選，獲得對人無過敏性的乳糖陽性乳酸克魯維 斯酵母可食用乳糖陽性菌株(Kluyveromyces lactis BVP)，該該菌株含有強啟動子 LAC4。
3、根據權利要求1、 2所述的一種乳酸克魯維斯酵母菌表達外源白蛋白的方法， 其特征是，對獲得的乳酸克魯維斯酵母可食用乳糖陽性菌株BVP型細胞轉化和克隆 篩選包括如下步驟(1) 利用pBVP表達質粒載體與合成的目的基因克隆，篩選獲得pArt系列質粒克隆、 轉化細胞，分別將pArt質粒轉化到乳酸克魯維斯酵母感受態(tài)細胞，獲得食用工程菌 轉化細胞。(2) 進行食用工程菌轉化細胞的克隆篩選，首先進行單拷貝細胞篩選，其次進行雙 拷貝細胞和多拷貝細胞篩選，獲得多個整合進入食用工程菌染色體的雙克隆細胞或 多克隆細胞。(3) 挑選陽性人白蛋白和牛白蛋白高表達菌株在完全型或基本型培養(yǎng)液中生長，表 達生產大量的重組白蛋白。(4) 檢査多克隆或單克隆轉化后細胞是否分泌白蛋白采用SDS —PAGE電泳法、WB免疫印跡法檢測克隆轉化細胞是否分泌白蛋白，用ELISA定量法測定白蛋白表達量。
4、 根據權利要求l、 2或3所述的一種乳酸克魯維斯酵母菌表達外源白蛋白的方法， 其特征是將受態(tài)細胞的細胞轉化混合物涂于含有乙酰胺的酵母基本碳源(YCB)培養(yǎng) 基上，YCB培養(yǎng)基含有食用菌細胞生長所需的所有營養(yǎng)物質和碳源，但缺少氮源，只 有當乙酰胺被乙酰胺酶即由pKLACl上的amdS基因表達降解為氨時，它才能作為氮 源被利用，使轉化的細胞長成菌落后才能在平板上挑選陽性克隆。
5、 根據權利要求l所述的一種乳酸克魯維斯酵母菌表達外源白蛋白的方法，其特征 是pART質?？寺〗涍^整合后進入細胞的基因工程克隆可以被生物體認可，當作自源 性基因表達出人和動物的白蛋白，從細胞內釋放到細胞外的培養(yǎng)液中；分泌表達單 元中的分泌信號子能被克魯氏乳酸酵母的蛋白質分泌系統(tǒng)所識別，重組白蛋白被分 泌到細胞外。
6、 根據權利要求l-5所述的一種乳酸克魯維斯酵母菌表達外源白蛋白的方法，其特 征是多克隆或單克隆轉化后細胞株可以很穩(wěn)定地表達白蛋白，利用食品生物工程的 生物反應器進行工業(yè)化生產，可以大量持續(xù)地表達白蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種乳酸克魯維斯酵母菌表達外源白蛋白的方法，涉及生物技術工程應用領域。發(fā)揮基因工程技術與人源化乳酸克魯維斯酵母細胞的優(yōu)點，利用重組轉化技術篩選出可食用菌來表達和大量地生產均一、糖基化相同的重組白蛋白，包括重組人白蛋白，以克服畢赤酵母表達白蛋白系統(tǒng)的某些缺陷。其pART質粒克隆經過整合后進入細胞的基因工程克隆可以被生物體認可，當作自源性基因表達出人和動物的白蛋白，從細胞內釋放到細胞外的培養(yǎng)液中；分泌表達單元中的分泌信號子能被克魯氏乳酸酵母的蛋白質分泌系統(tǒng)所識別，重組白蛋白被分泌到細胞外。產生的多克隆或單克隆轉化后細胞株可以很穩(wěn)定地表達白蛋白，利用食品生物工程的生物反應器進行工業(yè)化生產，可以大量持續(xù)地表達白蛋白。
文檔編號C12R1/645GK101550426SQ20091005826
公開日2009年10月7日 申請日期2009年2月3日 優(yōu)先權日2009年2月3日
發(fā)明者陳群泉 申請人:陳群泉