專利名稱：一種提高植物穗萌抗性的真核重組質(zhì)粒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種提高植物穗萌抗性的基因、重組質(zhì)粒 及其在改良植物對遇到陰雨潮濕環(huán)境時抗穗萌方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
種子胎萌，在禾本科植物中被稱為穗發(fā)芽或穗萌或早萌，是種子在收獲前遇到陰 雨潮濕環(huán)境時在田間母體植株上就發(fā)芽的現(xiàn)象。這種現(xiàn)象在水稻、小麥、玉米、大麥、 高粱、油菜等作物中非常普遍。穗萌能夠引起作物種子內(nèi)部發(fā)生一系列的生化反應(yīng)，如 提高種子體內(nèi)碳水化合物降解酶和蛋白水解酶等的活性，降解胚和胚乳中的貯藏物質(zhì)， 從而導(dǎo)致種子育性變?nèi)?，種子產(chǎn)量和加工品質(zhì)下降。給農(nóng)作物生產(chǎn)造成很大的影響和經(jīng) 濟損失。
為了控制種子早萌的危害，人們采取了許多措施，包括加強對作物收獲前和收獲后 的管理，以及利用育種的方法培育抗穗萌新品種。對于水稻，目前在生產(chǎn)應(yīng)用中最為廣 泛采用的方法是使用穗萌抑制劑，如多效唑、脫落酸和馬來酸肼等來抑制穗萌，該措施 雖然會使穗發(fā)芽在一定的程度上得到抑制，但要求抑制劑的使用濃度較高，且抑制劑在 種子中殘留的時間較長。因此，無論從經(jīng)濟效益角度還是從無毒安全角度來看，這些方 法均不值得推廣。同時，利用傳統(tǒng)育種方法培育新的穗萌抗性植物的品種周期長， 一般 需要5-8年，并且見效慢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提高植物穗萌抗性的基因、真核重組質(zhì)粒，所述基因的過 量表達(dá)可明顯增強轉(zhuǎn)基因植物對植物激素脫落酸(ABA)的敏感性，從而促進(jìn)種子成熟 和誘導(dǎo)種子休眠，提高植物種子在收獲前陰雨潮濕環(huán)境中的穗萌抗性，以此來提高植物 特別是農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
本發(fā)明所述提高植物穗萌抗性的基因，命名為尸i/S及(pre-harvesting sprouting resistance),其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO: 1所述，所表達(dá)的多肽的氨基酸 序列如序列表中SEQ ID NO: 2所述。該基因的克隆根據(jù)GenBank中番茄cDNA序列 (登錄號:AY911399),利用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5. 0設(shè)計了 2對巢式PCR特 異引物，從番茄成熟種子中提取總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)技術(shù)從番茄中分 離到尸/fM的編碼序列，如序列表中SEQIDNQ: l所示。
本發(fā)明所述真核重組質(zhì)粒，是將SEQ ID NO: 1所述的核苷酸序列插入到真核表達(dá)載體中獲得，所述真核表達(dá)載體為pHB、 pMON1772、 pBE12、 pBC7、 pBI121
中的一種。
將上述真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化水稻和番茄，獲得轉(zhuǎn)基因植株。實驗表明實驗中各取若
干粒水稻和番茄的來自于獨立轉(zhuǎn)基因植株的T2代種子和野生型植株的成熟種子，放置 于帶有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，浸泡在蒸餾水中，每隔24 h用肉眼統(tǒng)計發(fā)芽和未發(fā)芽的 水稻種子的數(shù)量。發(fā)現(xiàn)在萌發(fā)的前期，轉(zhuǎn)基因水稻和轉(zhuǎn)基因番茄的發(fā)芽速率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于 野生型的水稻和野生型的番茄的發(fā)芽速率。但是到萌發(fā)的后期發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因種子的發(fā)芽勢 較前期出現(xiàn)大幅度上升，到最后轉(zhuǎn)基因植株種子與野生型種子一樣，全部發(fā)芽。由此可 見，/W57 基因能夠抑制水稻種子和番茄種子的發(fā)芽勢、降低發(fā)芽速度。因此，本發(fā)明所
述的基因可在植物穗萌抗性的改良中應(yīng)用。 本發(fā)明具有以下有益效果
1、 本發(fā)明為培育穗萌抗性的植物提供了一種新的重組質(zhì)粒，有利于糧食作物增產(chǎn) 增收。
2、 本發(fā)明所述的基因為植物本身自有的基因，所以轉(zhuǎn)基因植物的安全性高。
3、 本發(fā)明較常規(guī)育種培育穗萌抗性的植物新品種的周期縮短4-6年，大大節(jié)省人 力和物力，同時又能很好的解決農(nóng)作物的穗萌危害。
4、 本發(fā)明所述基因的克隆和植物轉(zhuǎn)基因均為常規(guī)方法，所需材料易于獲取。


圖1是用于在水稻中表達(dá)的真核重組質(zhì)粒(/ /75-Pi/SJ )示意圖。
圖2是用于在番茄中表達(dá)的真核重組質(zhì)粒(;^/"7-P/^i )示意圖.
圖3是轉(zhuǎn)基因水稻植株中轉(zhuǎn)基因抗性篩選標(biāo)記潮霉素抗性基因(所7 ) PCR擴增結(jié) 果圖，圖中，1-15泳道PCR模板為候選的轉(zhuǎn)基因水稻植株DNA; 16泳道陽性對照，PCR 模板為用于在水稻中表達(dá)的真核重組質(zhì)粒^〃)9-/5//5^
圖4是轉(zhuǎn)基因水稻植株中/W5"應(yīng)因PCR擴增結(jié)果圖，圖中，l-9泳道PCR模板為轉(zhuǎn) 基因水稻陽性植株DNA; IO泳道陰性對照，PCR模板為野生型水稻DNA; ll泳道陽性對 照，PCR模板為真核重組質(zhì)粒py^-ZW5y ; M泳道分子量標(biāo)記DL1500 (購自大連寶生物 工程公司)。
圖5是轉(zhuǎn)基因番茄植株中轉(zhuǎn)基因抗性篩選標(biāo)記卡那霉素抗性基因(iV/T/"的PCR
擴增結(jié)果圖，圖中，泳道l:陰性對照，PCR模板為野生型番茄植株DNA;泳道2:陽性對
照，PCR模板為用于在番茄中表達(dá)的真核重組質(zhì)粒;^i7i7-泳道3-16: PCR模板為 候選的轉(zhuǎn)基因番茄植株DNA。
圖6是轉(zhuǎn)基因水稻陽性篩選植株RT-PCR鑒定結(jié)果圖，圖中，野生型野生型的水 稻植株；l泳道/^9-/%5^轉(zhuǎn)基因水稻1號植株；2泳道/^9-/%5"7 轉(zhuǎn)基因水稻2號植株；3泳道p 忍-/^Kff轉(zhuǎn)基因水稻3號植株.
圖7是轉(zhuǎn)基因番茄陽性篩選植株RT-PCR鑒定結(jié)果圖，圖中，野生型野生型的番 茄植株；l泳道/^/7"-/%5^轉(zhuǎn)基因番茄1號植株；2泳道/W5y 轉(zhuǎn)基因番茄 2號植株；3泳道；^/7^7-/%57 轉(zhuǎn)基因番茄3號植株；4泳道； "77"-/^57 轉(zhuǎn)基因番 茄4號植株。
圖8是;^5-/%57 轉(zhuǎn)基因水稻1號植株T2代種子和水稻野生型種子在0pM的ABA 的溶液中的4天后萌發(fā)結(jié)果及10天后的幼苗的生長結(jié)果圖，圖中，(a):野生型水稻種 子萌發(fā)4天后的植株，(b): /W5"v 轉(zhuǎn)基因水稻1號植株T2代種子萌發(fā)4天后的植 株，(c):水稻野生型種子萌發(fā)IO天后的植株，(d): p//5-/W57 轉(zhuǎn)基因水稻1號植株T2 代種子萌發(fā)10天后的植株。
圖9是/W5V 轉(zhuǎn)基因水稻T2代種子和野生型水稻種子在0 的ABA的溶液 中的發(fā)芽速率圖，圖中，/ 服-Z^K -7為/7〃5-/%57 轉(zhuǎn)基因水稻1號植株的T2代種子； ;^5-/%57 -2為/^9-/% / 轉(zhuǎn)基因水稻2號植株的T2代種子；/W57 -^為/ v7i9-ZW6^轉(zhuǎn) 基因水稻3號植株的T2代種子。
圖10是/^9-ZW5V 轉(zhuǎn)基因水稻T2代種子和野生型水稻種子在1.5 的ABA的溶 液中的發(fā)芽速率圖，圖中，/為/^5-/W5V 轉(zhuǎn)基因水稻1號植株的T2代種子
/%57 -^為/^^-/^5^轉(zhuǎn)基因水稻2號植株的T2代種子；p^9-< 為/^9-/￥57 轉(zhuǎn) 基因水稻3號植株的T2代種子。
圖11是/^5-/%57 轉(zhuǎn)基因水稻T2代種子和野生型水稻種子在5 pM的ABA的溶液 中的發(fā)芽速率圖，圖中，為/W5^轉(zhuǎn)基因水稻1號植株的T2代種子； p朋-ZW67P-2為p^5-ZW5/ 轉(zhuǎn)基因水稻2號植株的T2代種子；p^9-為p^9-尸/fiV 轉(zhuǎn) 基因水稻3號植株的T2代種子。
圖12是番茄野生型種子，p^7W-/W5y 轉(zhuǎn)基因番茄植株T2代種子在1/2MS培養(yǎng)基 中三天后的萌發(fā)結(jié)果圖，圖中，(a):野生型番茄種子，(b): /^i7i7-/W67P-7轉(zhuǎn)基因番茄 1號植株T2代種子，(c) : p5/7i7-/W5V -2轉(zhuǎn)基因番茄2號植株T2代種子，(d): /^/"/-/^S/iS 轉(zhuǎn)基因番茄3號植株T2代種子。
圖13是/^/7^-/%57 轉(zhuǎn)基因番茄1號植株T2代種子和番茄野生型種子置于含有 不同濃度ABA的1/2MS培養(yǎng)基上8天后的萌發(fā)結(jié)果圖，每幅圖的左邊4株為番茄野生 型植株，右邊4株為/^i7i7-/%57 轉(zhuǎn)基因番茄1號T2代植株；圖中，(a): OpMABA.， (b): 0.5拜ABA， (c): 2.5一ABA， (d): 5一ABA， (e): IO一ABA， (f): 50一ABA。
具體實施例方式
,下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。下述實施例中，凡未注明具體實驗條件的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)條件，例如Sambrook, Russell的分子克隆: 實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或
按照制造廠商所建議的條件。
實施例l:提高植物穗萌抗性的基因的克隆 1、試劑
限制性內(nèi)切酶、71^DNA聚合酶、T4DNA連接酶、PrimeStar熱啟動高保真DNA 聚合酶、pMD18-T克隆載體等購自大連寶生物工程公司Trizol試劑購自北京天為時代 科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本ToYoBo公司；質(zhì)粒提取及DNA回收試劑盒購 自安徽優(yōu)晶生物工程有限公司公司；PCR引物由上海英俊生物公司合成；其余試劑均為 進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。
2、 大腸桿菌菌株和植物材料
大腸桿菌克隆菌株為co// JM109，購自Clontech公司。水稻野生型種子為日本晴， 番茄野生型種子為AC+，可通過市場購買。
3、 培養(yǎng)基和溶液
LB培養(yǎng)基胰蛋白胨10 g /L，酵母粉5 g /L， NaCl 10 g/L。用NaOH調(diào)pH至7.0，
高壓滅菌。
SOB培養(yǎng)基胰蛋白胨20g/L，酵母粉5 g/L, NaC10.58g/L， KC10.19g/L， 100xMg2+10mL。用NaOH調(diào)pH至7.0，高壓滅菌。
SOC培養(yǎng)基SOB + 20 mM葡萄糖。
TB buffer(臨用前配置)1 M KC14 mL， 0.45 M MnCl22.4 mL， 0.50 M CaCl20.6 mL，
0.50 M K-MES 0.5 mL， ddH20 12.5 mL (總體積20 mL)。 100xMg2+溶液20.33 g MgCl2.6H20和24.65 g MgSO4.7H20定容于100 mL H20，高
壓滅菌。
20%葡萄糖溶液20g葡萄糖定容于100mLH2O，過濾除菌。
1 M KC1溶液7.45 g KC1定容于100 mLH20，高壓滅菌。
0.45 M MnCl2溶液8.9 g MnCl2.4H20定容于100 mLH20，高壓滅菌。
0.50 M CaCl2溶液7.35 g CaCl2.2H20定容于100 mL H20，高壓滅菌。
0.50 M K-MES溶液9.76 gMES定容于100 mLH20,用KOH調(diào)pH至6.3，過濾
除菌，分裝成0.5mL每管，-20'(:儲存。 DMSO:分裝200pl新鮮DMSO， -20°0儲存。
4、 實驗方法4.1質(zhì)粒微量提取
1) 將帶有克隆載體pMD18-T質(zhì)粒(購自大連寶生物工程公司)的五.CO//JM109接 種于裝有5mlLB培養(yǎng)液(含適量抗生素)的試管中，37'C搖床培養(yǎng)12 16hr，以擴
增質(zhì)粒。
2) 取1.5 5ml的菌液，于室溫下10,000xg離心lmin。倒凈培養(yǎng)基，往沉淀中加 入250pl的ZL-I/RnaseA (購自安徽優(yōu)晶生物工程有限公司)混和液，漩渦振蕩使細(xì) 胞完全重新懸浮。
3) 往重懸混和液中加入250^1 ZL-II (購自安徽優(yōu)晶生物工程有限公司)，輕輕翻轉(zhuǎn) 試管4 6次混和溶液，以獲得一澄清的裂解液。
4) 往上述混和液中加入350ulZL-m (購自安徽優(yōu)晶生物工程有限公司)，并溫和 地上下顛倒離心管數(shù)次，直至形成白色絮狀沉淀。于室溫下10,000xg離心10min。
5) 取一干凈的Mu-Pu (購自安徽優(yōu)晶生物工程有限公司)質(zhì)粒微量分離柱裝在一 個2ml收集試管上(已備)。小心吸出上清，并將其轉(zhuǎn)至于柱子內(nèi)，確保轉(zhuǎn)至柱內(nèi)的上 清中沒有細(xì)胞雜質(zhì)沉淀。于室溫下10,000xg離心lmin，使裂解液完全流過柱子。
6) 棄去離心甩出液，加入50(HU的ZL緩沖液(購自安徽優(yōu)晶生物工程有限公司) 到柱子上，室溫下10，000xg離心lmin洗滌柱子，確保除去殘余的蛋白質(zhì)以得到后 面操作所需的高質(zhì)量DNA。
7) 棄去收集液，加入720pl用無水乙醇稀釋的DNA洗滌緩沖液洗滌柱子，室溫 10,000xg離心10min，棄去洗滌液。
8) 可選做步驟重復(fù)步驟7，再用720^1的DNA洗滌緩沖液洗滌柱子一次。
9) 室溫下10,000xg離心空柱lmin以甩干柱子基質(zhì)。
10) 把柱子置于一干凈的1.5ml小離心管上，直接加入50 100pl滅菌去離子水或 TE緩沖液液到柱子基質(zhì)上(所加的量取決于預(yù)期終產(chǎn)物濃度)，10，000xg離心lmin以 洗脫出DNA。
4.2 DNA回收方案
1) 處理瓊脂糖凝膠-EB電泳混和物以分別分離DNA片段。任何類型或等級的瓊脂 糖都可以使用。
2) 當(dāng)帶紋間的間距達(dá)到足夠的量的時候，在紫外燈上小心的把所需的DNA片段切 下來。這樣就能保證把含DNA的凝膠盡量多的取出來
3) 通過把凝膠薄片裝在1.5ml小離心管中稱其重量的方法，近似地確定其體積。 例如其密度為lg/ml，于是凝膠的體積便可通過如下方法得到凝膠薄片的重量為0.2g 則其體積為0.21111。加入體積為凝膠體積3 4倍的NJ緩沖液，把混和物置于55 65t: 水浴中溫浴7min,或至凝膠完全融化。4) 把75(^1的DNA—瓊脂糖溶液加到一個Mu-Pu DNA回收純化柱上，并把柱子 裝在一個干凈的2ml收集管內(nèi)，室溫下于10,000xg離心lmin，棄去液體。
5) 選做步驟用300^1 NJ緩沖液來洗滌柱子，并在10,000 xg下離心lmin。
6) 用75(^1無水乙醇稀釋的DNA洗滌緩沖液洗滌柱子。室溫下10,000xg離心lmin。
7) 棄去流出液，重復(fù)第6步一次。
8) 棄去液體，把空柱10,000xg離心lmin以甩干柱基質(zhì)殘余的液體。
9) 把柱子裝在一個干凈的1.5ml離心管上，加入30 50^1 10,000xg離心(具體取 決于預(yù)期的終產(chǎn)物濃度)的滅菌去離子水(或者PH8.0的TE緩沖液)到柱基質(zhì)上，10,000xg 離心lmin以洗脫DNA。
4.3番茄種子RNA提取
1) 液氮迅速研磨番茄成熟的種子，按50-100mg組織/mlTrizo1 (購自北京天為時代 科技有限公司)加入Trizol，劇烈震蕩，室溫放置5min。
2) 12,000rpm離心5min。
3) 取上清，按200ul氯仿/mlTrizol加入氯仿，劇烈震蕩15s，室溫放置3min。
4) 4°C 12，000g離心15min。
5) 取上清，按0.5ml異丙醇/mlTrizol加入異丙醇混勻，室溫放置10min。
6) 4°C 12，000g離心10min,棄上清，RNA沉于管底。
7) 按lml75o/Q乙醇/mlTrizol加入75。/。乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。
8) 4 °C 8，000g離心5min，盡量棄上清。
9) 室溫干燥5-10min (RNA樣品不要過于干燥，否則很難溶解。)。
10) 用50ulDEPC-H2O溶解RNA樣品，55-60°C,5-10min。 4.4 RT-PCR
1) RT
冰上在一個20(Hil EP管中加入以下組分
5 xRT Buffer4^1
dNTP Mixture(各10 mM)2^1
RNaselnhibitor(10，)1 pi
Oligo(dT)20(10pmol4il)1 ^
Total RNAXpl
RNase-Free H20(ll-X)pl
ReverTra Ace1 [il
按以下程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄42。C20min (反應(yīng))；99°C 5 min (酶變性)；4°C 5 min (保存)。i))轉(zhuǎn)水稻pas及基因的克隆
冰上在一個的20(Hd EP管中加入以下組分:
5 xPrimeStar Buffer 10 pi
dNTP Mixture(各2.5 mM) 4 pi
RT產(chǎn)物 1 ^
PHSR-Fl 1 pi
PHSR-Rl 1 ^
ddH20 32.5 pi
PrimeStar 0.5 pi
按以下程序進(jìn)行擴增985C 3 min (預(yù)變性)；98°C 10 s (變性)，58°C 15 s (復(fù) 性)，72°C2min (延伸)，所述變性-復(fù)性-延伸30個循環(huán)；72°C 5 min (終延伸)。
以上述PCR產(chǎn)物為模板，以巢式引物mSR-F2和PHSR-R2進(jìn)行第二輪高保真PCR，延 伸時間2min，其它條件同上。 引物序列如下
PHSR-Fl: 5， -CAAGTCAAAATCAAGAATGMAAGG-3' PHSR-Rl: 5， -ATTGATTTCTCTTTTCCTGGACTAT-3' raSR-F2: 5， -AGAATGAAAAGGGAGTTAAATGATGT-3， PHSR-R2: 5， - ACTATCCAACAGCTTGTGCAAATG-3' 通過上述操作，獲得了用于構(gòu)建/7/ -戶//57 水稻表達(dá)重組質(zhì)粒的PHSR基因。 2))轉(zhuǎn)番茄PflS及基因的克隆 冰上在一個的200)al EP管中加入以下組分
5 xPrimeStar Buffer 10 pi dNTP Mixture(各2.5 mM) 4 pl
RT產(chǎn)物 1 pl
PHSR-Fl 1 pi
PHSR-Rl 1 ^
ddH20 32.5 ^
PrimeStar 0.5 jil
按以下程序進(jìn)行擴增98。C 3 min (預(yù)變性)；98°C 10 s (變性)，58。C 15 s (復(fù) 性)，72。C2min (延伸)，所述變性-復(fù)性-延伸30個循環(huán)；72°C 5 min (終延伸)。 以上述PCR產(chǎn)物為模板，以巢式引物L(fēng)EPBI-F1和LEPBI-Rl進(jìn)行第二輪高保真PCR，
9延伸時間2min，其它條件同上。
引物序列如下LEPBI-Fl: 5' - TCTAGAATGAAAAGGGAGTTAAATGA—3，
通過上述操作，獲得了用于構(gòu)建; 5/"/-尸/^/ 番茄表達(dá)重組質(zhì)粒的PHSR基因。 4.5高保真PCR產(chǎn)物加尾以及和克隆載體pMD18-T連接
在第二輪高保真PCR產(chǎn)物中加1 pl7b《DNA聚合酶，72'C反應(yīng)15 min即可。若PCR 產(chǎn)物不純，則必須先回收純化目標(biāo)片段，再加入適量的PCRBuffer、 dNTPs和ra9DNA
聚合酶進(jìn)行加尾。
加尾后的PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD18-T按摩爾分子數(shù)比3/1連接，反應(yīng)體系如下
16。C連接過夜。 4.6大腸桿菌轉(zhuǎn)化
1) 感受態(tài)細(xì)胞 的制備
a) 接種大腸桿菌單菌落于2mLSOB培養(yǎng)液中，37'C過夜培養(yǎng)；
b) 轉(zhuǎn)接0.5 mL過夜培養(yǎng)物至50 mL SOB培養(yǎng)液中，18。C劇烈震蕩18 24h至A600 -0.55;
c) 將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，冰浴10 min, 4°C 4000rpm離心10 min;
d) 去上清，加16 mL預(yù)冷的TB緩沖液懸浮細(xì)胞(注意輕輕旋轉(zhuǎn)，不要用振蕩器或吹 吸混勻)，冰浴10 min， 4°C4000 rpm離心10 min;
e) 去上清，加4mL預(yù)冷的TB緩沖液懸浮細(xì)胞，加入280^1的DMSO，輕柔混勻， 冰浴10 min;
f) 分裝于預(yù)冷得1.5mLEP管中，液氮凍存。
2) 轉(zhuǎn)化
a) 從液氮中取出一管感受態(tài)細(xì)胞冰浴解凍；
b) 將lOpl連接產(chǎn)物與感受態(tài)細(xì)胞輕輕混勻，冰浴30 min;
c) 42。C熱沖擊90 s,立即冰浴1-2 min;
d) 加0.8 mL的SOC，混勻，37'C溫和搖床lh。
e) 室溫13， 000rpm離心lmin，倒掉一部分上清液，留約200W的上清液，用槍 頭將上清液與細(xì)胞混勻，涂布LB + amp(50pg/ml)平板,37'C培養(yǎng)過夜。
LEPBI-Rl: 5' — GAGCTCTATCCAACAGCTTGTGCAMT—3 ，
l(Migase Buffer pMD18-T (50ng4U) 加尾的PCR產(chǎn)物( 150pg4d) Ligase (350 U楊 ddH20
1 pi 1 pi 1 pi 1 pi 6pl4.7細(xì)胞快速裂解法鑒定重組質(zhì)粒
1) 挑取單個轉(zhuǎn)化子接種于500pl含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)液中，37'C振蕩培養(yǎng)至 八600為0.6 0.8。
2) 取20(Vl菌液至0.5mlEP管中，13， 000 rpm離心1 min，去上清，留約20pl上清。
3) 加20pl2x快速裂解液
，劇烈振蕩。
4) 13000rpm離心15min。
5) 取5iil上清直接電泳。與對照比，電泳帶滯后的即可能是重組載體。 4.8菌落PCR鑒定重組質(zhì)粒
經(jīng)過快速裂解法鑒定的重組質(zhì)粒再做菌落PCR以確定插入片段是目標(biāo)片段，反應(yīng)體
系如下
10xPCR Buffer 2 pl
Mg2+(1.5mM) 1.2^1 dNTP Mixture (各2.5 mM) .6 pl
菌液 1 pl
PHSR-F2 0.4 pl
PHSR-R2 0.4 pl
ddH20 12.4 pi
DNA聚合酶 1 pl
反應(yīng)條件94°C5min (預(yù)變性)；94。C 40 s (變性)，58。C30s (復(fù)性)，72。C 2min (延伸)，所述變性-復(fù)性-延伸30個循環(huán)；72°C 5 min (終延伸)。
對菌落PCR確定的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序結(jié)果為序列表中SEQIDNO: l所示的核 苷酸序列。
實施例2:提高植物穗萌抗性的基因在水稻和番茄中的表達(dá)
1、材料
1.1試劑與材料
常規(guī)試劑與實施例l相同。
用于轉(zhuǎn)基因的農(nóng)桿菌菌株為(購自Clontech公司)；真核表達(dá)載體pHB和 PBI121 (購自大連寶生物工程公司)。 1.2培養(yǎng)基與溶液
YEB培養(yǎng)基酵母提取物lg/L，牛肉膏5g/L,蛋白陳5 g/L，蔗糖5 g/L， MgS04.7H2O 0.5 g/L。用NaOH調(diào)pH至7.0，高壓滅菌。YEP培養(yǎng)基酵母提取物10g/L，蛋白陳10g/L， NaC15g/L。用NaOH調(diào)pH至 7.0，高壓滅菌。
常規(guī)用組織培養(yǎng)基 _
組分
MS基本培養(yǎng)基(g/L)B5基本培養(yǎng)基(g/L)N6基本培養(yǎng)基
(g/L)
大量元素 KN03
(NH4)2S04
MgS04-7H20
CaCl2
KH2P04
NaH2P04-H20
1.900000 1.650000 n/a
0.370000 0.332020 0.170000 n/a
2.500000 n/a
0.13400 0.250000 0.113240 n/a
0.150000
2.830000 n/a
0.463000 0.185000 0.125330 0.400000 n/a
微量元素
MnS04-H20
H3B03
ZnS04-7H20
NaMo04-2H20
CuSO^
KI
CoCl-6H20
0.016900 0.006200 0.008600 0細(xì)250 0扁025 0扁830 0.000025
O扁OOO 0.002000 0細(xì)250 0.000025 0細(xì)750 0.000025
0.003330 0.001600 0.001500
n/a
n/a
0.000800 n/a
鐵鹽
FeS04-7H20 Na2-EDTA
0.027800 0.037300
0.027800 0.037300
0.027800 0.0373000
有機成分
肌醇
甘氨酸
煙酸
鹽酸吡眵醇 鹽酸硫胺素
0.100000 0.002000 0.000500 0.000500
0.100000 n/a
n/a
0.002000 0.000500其它
蔗糖 30 20 50
瓊脂 8 8 8
pH
2、方法
2.1戶jy5^基因在水稻和番茄中表達(dá)的真核重組質(zhì)粒的構(gòu)建
2丄i構(gòu)建用于在水稻中表達(dá)的真核重組質(zhì)粒(p好5-pay及)的引物如下
PHSR-F2: 5， -AGAATGAAAAGGGAGTTAAATGATGT-3， PHSR-R2: 5， - ACTATCCAACAGCTTGTGCAAATG-3'
按以下程序進(jìn)行擴增94'C5min (預(yù)變性)；94°C 40 s (變性)，58'C30s (復(fù) 性)，72'C2min (延伸)，所述變性-復(fù)性-延伸30個循環(huán)；72°C 5 min (終延伸)。
高保真PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳回收后，然后進(jìn)行普通Tag酶加尾。再把加尾的片段與 pMD18-T克隆載體連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌(JM109)，第二天挑單克隆，提陽性克隆 質(zhì)粒后，然后用限制酶酶切PstI和XbaI雙酶切，最后與用相同限制酶酶切的pHB載體 連接(連接位點PstI和XbaI)，獲得含/W6V 基因的過量表達(dá)真核重組質(zhì)粒，命名為 pHB-PHSR (圖1)。
2.1.2構(gòu)建用于在番茄中表達(dá)的真核重組質(zhì)粒(i>5/"J-/ iKi )的引物如下 LEPBI-Fl: 5' - TCTAGMTGAAAAGGGAGTTAAATGA-3 ， (Xbal) LEPBI-Rl: 5， - GAGCTCTATCCAACAGCTTGTGCAMT-3 (Sacl)
按以下程序進(jìn)行擴增94'C5min (預(yù)變性)；94°C 40 s (變性)，58。C30s (復(fù) 性)，72'C2min (延伸)，所述變性-復(fù)性-延伸30個循環(huán)；72°C 5 min (終延伸)。
高保真PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳回收后，然后進(jìn)行普通Tag酶加尾。再把加尾的片段與 pMD18-T克隆載體連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌(JM109),第二天挑單克隆，提陽性克隆 質(zhì)粒后，然后用限制酶酶切XbaI和SacI雙酶切，最后與用相同限制酶酶切的pBI121 載體連接(連接位點XbaI和SacI)，獲得含P/Ki 基因的過量表達(dá)真核重組質(zhì)粒，命 名為pBI121-PHSR (圖2)。
2.2農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
1) 挑取農(nóng)桿菌單菌落于2ml的YEB液體培養(yǎng)基(含Rif50^ig/ml)中，28'C振蕩培養(yǎng) 過夜；
2) 取過夜培養(yǎng)液500pl轉(zhuǎn)接于50ml YEB(含Rif50嗎/ml)液體培養(yǎng)基中，28'C振蕩 培養(yǎng)至OD6G()=0.5;3) 4°C 5000rpm離心5min收集菌體，力IHO ml 0.15 M的NaCl溶液懸浮菌體，冰 浴10 min;
4) 4°C 5000卬m離心5 min收集菌體，用1 ml預(yù)冷的20 mM CaCl2溶液懸浮菌體， 冰浴10 min;
5) 制備好的細(xì)胞立即使用，或分裝成200pl/管，液氮中速凍lmin,置-70。C保存?zhèn)溆谩?br> 23農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化
1) 取200pl感受態(tài)細(xì)胞，冰上解凍；
2) 力口l昭構(gòu)建好的真核重組質(zhì)粒，輕彈混勻，冰浴30min;
3) 液氮中速凍lmin， 37。C水浴5min，然后加入lml YEB培養(yǎng)基，28'C慢速振蕩 培養(yǎng)4h;
4) 將培養(yǎng)物涂布于含50嗎/ml Kan和50嗎/ml Rif的YEB平板上，28'C培養(yǎng)約48h。 2.4農(nóng)桿菌陽性克隆的鑒定
挑取平板上長出的單菌落，接種于含50昭/ml Kan和50pg/ml Rif的YEB液體培養(yǎng) 基中，28'C振蕩培養(yǎng)過夜，以菌液為模板進(jìn)行PCR擴增鑒定。 2.5農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻 2. 5.1胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及繼代
水稻日本晴成熟種子手工去殼，75%乙醇消毒1分鐘，25%次氯酸鈉溶液中振蕩消毒 25分鐘，滅菌蒸餾水再沖洗3次，然后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，24-26'C暗培養(yǎng)條件下誘 導(dǎo)愈傷組織形成。
2. 5.2愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)
選取自然分散、顏色鮮黃、直徑約為2-3mm的顆粒狀愈傷，轉(zhuǎn)接到預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中， 置于27'C暗培養(yǎng)4天。
2. 5. 3農(nóng)桿菌的培養(yǎng)及處理
從一80。C低溫凍存管中刮取少量含有/W57 植物過量表達(dá)載體的菌液于附加卡 那霉素(Kanamycin ， Kan) 50mg/L和Rif 50mg/L YEB固體培養(yǎng)基劃線，然后在28。C暗 培養(yǎng)36-72h進(jìn)行活化；取活化平板上的單菌落轉(zhuǎn)接劃菌，28'C培養(yǎng)兩天后，用適量添 加有100MM/L乙酰丁香酮的AAM培養(yǎng)基將菌洗脫，懸浮于添加有100幽/L乙酰丁香酮20 ml AAM培養(yǎng)基中，劇烈搖動lmin后，調(diào)整菌液濃度至0D600nm=0. 8-1. 0，靜置lh，讓 農(nóng)桿菌形成懸浮液。
2. 5. 4共培養(yǎng)
取經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的愈傷于滅菌的培養(yǎng)瓶中，加入上述處理的農(nóng)桿菌菌液，略微搖動后靜 置15min，于無菌濾紙上晾干愈傷后接種于共培養(yǎng)基，25'C暗培養(yǎng)3d。
142. 5. 5洗除農(nóng)桿菌
挑取共培養(yǎng)后的愈傷于廣口培養(yǎng)瓶中，用無菌水沖洗3-5次，每次搖動數(shù)次，直至 水中不見絲狀菌體。最后一次用含250 mg/L羧卞青霉素的無菌水靜置lh,然后置于無 菌濾紙上晾干。
2. 5. 6愈傷組織的篩選
將愈傷轉(zhuǎn)移至含有潮霉素抗性的選擇培養(yǎng)基篩選抗性愈傷，每兩周轉(zhuǎn)接1次。 2. 5. 7抗性愈傷組織的繼代與植株的再生
每兩周將愈傷轉(zhuǎn)移至新的選擇培養(yǎng)基上，約需三周即可見瘤狀鮮黃色抗性愈傷從褐 化干癟的愈傷中長出。待愈傷長大后挑選抗性愈傷的一部分轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上，約2 周或更長時間后愈傷開始轉(zhuǎn)綠，3周或更長時間后即可長出幼芽，隨后根也長出。將幼 苗移至生根培養(yǎng)基上，每培養(yǎng)瓶l個克隆。待幼苗生根長成后，移出培養(yǎng)瓶，洗凈根上 的培養(yǎng)基后，移至溫室盆栽。
2.6農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化番茄
構(gòu)建好的真核重組質(zhì)粒pBI121-PHSR轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中備用。
用10 %次氯酸鈉浸泡番茄種子10 min，再用無菌水清洗4 5次，用無菌濾紙吸 干種子表面水分后于1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，25 'C，暗培養(yǎng)4 d左右，露白后轉(zhuǎn)置于光 照下，光照1500 lx， 16h/d，在其第一片真葉長出前取下子葉，置于預(yù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2d。 轉(zhuǎn)化法采用葉盤法。將帶有目的基因的農(nóng)桿菌28 'C過夜培養(yǎng)，5000 r/min， 5 min，室 溫下離心，去除上清液，用誘導(dǎo)培養(yǎng)基將農(nóng)桿菌稀釋至OD-O.l，將預(yù)培養(yǎng)2d的子葉浸 入其中10 15min，倒掉菌液將子葉置于無菌濾紙上，吸干多余菌液后轉(zhuǎn)到共培養(yǎng)基上 培養(yǎng)3d。然后轉(zhuǎn)入再生培養(yǎng)基上繼代篩選培養(yǎng)，每3周換一次培養(yǎng)基，待不定芽長到3 cm左右時，切下轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上生根。等根發(fā)育好后，移出，溫室盆栽。
(1)預(yù)培養(yǎng)基MS +1 mg/L6BA+0.04mg/LIAA。 (2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基(100mL): 5 mLAB鹽+2mLMES緩沖齊lj +211^磷酸鈉鹽緩沖劑+91mLl%葡萄糖。(3)共培 養(yǎng)基MS + 0,2mg/LKH2PO4 + 0.1 mg/LKinetin + 0.2mg/L2， 4-D + 15 mg/L乙酰丁香 酮。(4〗再生培養(yǎng)基MS + 500mg/L羧卞青霉素鈉+ 50mg/L硫酸卡那霉素+2mg/L 6-BA+0.2mg/LIAA。 (5)生根培養(yǎng)基MS + 500 mg/L羧卞青霉素鈉+2mg/LIAA。 以上各培養(yǎng)基的pH值均為6.0。
2.7轉(zhuǎn)基因植株的鑒定
2.7.1基因組DNA的提取
(1)取100mg新鮮的材料，在添加液氮狀況下研成細(xì)粉，分裝于1.5mL印pendorf 管中，每管加入500uL65。C預(yù)熱的2XCTAB提取緩沖液(100咖ol/LTris—Hcl pH8, 0， 20 mmol/L EDTA pH 8.0， 1.4 mol/L NaCl, 40咖ol/L 2-巰基乙醇，2% CTAB)混勻。(2) 65° C水浴保溫60 min，冷卻至室溫，加入等體積的氯仿。
(3) 5000 g離心10 min，取上清液，加入等體積的異丙醇，室溫放置15 min，沉 淀DNA。
(4) 12000 g離心10 min,棄上清留沉淀，用70%乙醇至少洗兩遍，吹干沉淀。
(5) 將沉淀溶于200uL TE中，加入RNase A (10 mg/mL)， 37° C保溫30 min， 加入等體積的酚/氯仿，混勻。
(6) 12000 g離心IO min，取上清，加入1/10體積3mol/L NaAc和2. 5倍體積的 無水乙醇，室溫放置IO min。
(7) 12000 g離心IO min，棄上清，用70%乙醇沖洗后吹干沉淀，溶于20uL滅 菌ddH20中。
2.7.2水稻和番茄的基因組DNAPCR檢測
為了確定戶/ff及基因已經(jīng)整合到陽性篩選水稻和番茄的基因組，我們分別以水稻和 番茄基因組DNA為模板，分別對基因全長編碼序列，水稻潮霉素抗性標(biāo)記基因 (/ffD和番茄卡那霉素抗性標(biāo)記基因(iWTa)進(jìn)行了PCR擴增。/^57 基因特異引物 為lseq-Fl和lseq-Rl，潮霉素抗性基因特異引物為HPT-f和HPT-r,卡那霉素抗性基 因特異引物為NPTII Fl和NPTII Rl 。
lseq-Fl: 5， -CACGAGCTCCGAAACGATTGGGAAGTACTA-3' lseq-Rl: 5， -GACCTGCAGTGATTCTGAGTCTGATGACGATA-3， 按以下程序進(jìn)行擴增94。C5min (預(yù)變性)；94°C 40 s (變性)，58。C40s (復(fù) 性)，72'C40s (延伸)，所述變性-復(fù)性-延伸30個循環(huán)；72。C5min (終延伸) HPT-f:: 5'-TCGTTATGTTTATCGGCACTTTG-3' HPT-r: 5'-GCGTCTGCTGCTCCATACAAG曙3' 按以下程序進(jìn)行擴增94'C5min (預(yù)變性)；94°C 40 s (變性)，58。C40s (復(fù) 性)，72°C40s (延伸)，所述變性-復(fù)性-延伸30個循環(huán)；72'C5min (終延伸) NPTII-F1: 5 ， -TCTCATGCTGGAGTTCTTCGC-3' NPTII-R1: 5 ，-GTCACCGACTTGAGCCATTTG-3' 按以下程序進(jìn)行擴增94°C5min (預(yù)變性)；94°C 40 s (變性)，60°C 40 s (復(fù) 性)，72°Clmin (延伸)，所述變性-復(fù)性-延伸30個循環(huán)；72'C5min (終延伸)。 2.7.3轉(zhuǎn)基因水稻陽性篩選植株RT-PCR鑒定
由于P/ZS及基因在野生型水稻中的表達(dá)具有組織特異性，它只在成熟的種子中表 達(dá)，在其他的組織中不表達(dá)，而在p/Z5-Pi/Si 轉(zhuǎn)基因水稻中P//Si 是組成型表達(dá)。所 以通過做野生型水稻幼苗和pi/5-戶/f57 轉(zhuǎn)基因水稻幼苗的RT-PCR，可以鑒定P/Ki 基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)情況。所以我們?nèi)∫吧退?日本晴)和p/^-戶/^7 轉(zhuǎn)基因陽性株的3個獨立的植株的T2代的成熟種子發(fā)苗,20天后，分別提取幼苗的mRNA， 反轉(zhuǎn)錄后，做RT-PCR分析，同時我們以水稻內(nèi)參基因C4"/")做為對照。P/fS及基因 的RT-PCR擴增引物為RT-PHSRF1和RT-PHSR1;爿c""基因的RT-PCR擴增引物為 RT-ActinFl和RT-ActinRl 。
RT-PHSRF1: 5'曙GTTCACCGATTCGTCCTCTG曙3' RT-PHSRR1: 5'-GGATTGTTAGCTTGAGATATTGC-3' 按以下程序進(jìn)行擴增94°C 5 min (預(yù)變性)；94°C 40 s (變性)，55°C 40 s (復(fù) 性)，72'C30s (延伸)，所述變性-復(fù)性-延伸26個循環(huán)；72。C5min (終延伸) RT-ActinFl: 5'-AAGATCCTGACGGAGCGTGGTTAC -3' RT-ActinRl: 5' -CTTCCTAATATCCACGTCGCACTTC- 3' 按以下程序進(jìn)行擴增94'C5min (預(yù)變性)；94'C 40 s (變性)，60°C 40 s (復(fù) 性)，72°C30s (延伸)，所述變性-復(fù)性-延伸26個循環(huán)；72。C5min (終延伸) 2.7.4轉(zhuǎn)基因番茄陽性篩選植株RT-PCR鑒定
由于戶/7S及基因在野生型番茄中的表達(dá)具有組織特異性，它只在成熟的種子中表達(dá)， 在其他的組織中不表達(dá)，而在轉(zhuǎn)基因番茄中尸/ZSi 是組成型表達(dá)。所以通 過做野生型番茄幼苗和/75//2/-/>//幼轉(zhuǎn)基因番茄幼苗的RT-PCR，可以鑒定iW朋基因 在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)情況。所以我們?nèi)∫吧头?AC+)和/^/^/-戶//57 轉(zhuǎn)基因陽性 株的4個獨立的植株的T2代的成熟種子發(fā)苗，IO天后，分別提取幼苗的mRNA，反轉(zhuǎn) 錄后，做RT-PCR分析，同時我們以番茄內(nèi)參基因(t/5/3)做為對照。尸i/57 基因RT-PCR 擴增引物為RT-PHSRF1和RT-PHSR1; f/￡/3基因的RT-PCR擴增引物為RT-UBI3F1 和RT-UBI3R1。
RT誦PHSRF1: 5，-GTTCACCGATTCGTCCTCTG-3' RT-PHSRR1: 5 ，-GGATTGTTAGCTTGAGATATTGC-3' 按以下程序進(jìn)行擴增94。C5min (預(yù)變性)；94。C40s (變性)，55。C40s (復(fù) 性)，72'C30s (延伸)，所述變性-復(fù)性-延伸30個循環(huán)；72'C5min (終延伸) RT-UBI3F1: 5，-AGAAGAAGACCTACACCAAGCC-3， RT-UBI3R1: 5，-TCCCAAGGGTTGTCACATACATC-3， 按以下程序進(jìn)行擴增94'C5min (預(yù)變性)；94°C 40 s (變性)，60'C40s (復(fù) 性)，72'C30s (延伸)，所述變性-復(fù)性-延伸26個循環(huán)；72°C5min (終延伸) 2.8轉(zhuǎn)基因水稻種子和野生型水稻種子萌發(fā)實驗
選擇成熟度好、籽粒飽滿的野生型水稻種子和轉(zhuǎn)基因水稻的三個不同植株 (pHB-PHSR-l,pHB-PHSR-2和pHB-PHSR-3 )的T2代成熟種子各40粒，均勻放置 于帶有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，浸泡在含有不同ABA (0 pM， 1.5 ^M和5 ^M)濃度處
17理的蒸餾水中，每隔24 h用肉眼統(tǒng)計發(fā)芽和未發(fā)芽的水稻種子的數(shù)量。待培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn) 基因水稻和野生型水稻幼苗有足夠差異時照相，測量苗長和根長(每個獨立植株的幼苗 測10株，重復(fù)三次實驗，最后去平均值)。
2.9轉(zhuǎn)基因番茄種子和野生型番茄種子萌發(fā)實驗
選擇成熟度好、籽粒飽滿的野生型番茄種子和轉(zhuǎn)基因番茄的三個不同植株 (pBI121-PHSR-l， pBI121-PHSR-2和pBI121-PHSR-3)的T2代成種子各50粒，用70% 酒精漂洗lmin;然后浸泡于活性氯含量2 5%的次氯酸鈉溶液中，振蕩15 20min; 用無菌水洗漆4 5次，用滅菌濾紙吸干多余的水分，接種于含有不同ABA(OpM.， 0.5 pM ， 2.5 ， 5pM ， 10nM ， 50 pM)濃度的處理的1/2MS培養(yǎng)基上8d后觀察種 子的萌發(fā)情況并拍照。 3、結(jié)果
3.1轉(zhuǎn)基因植株的鑒定
3.1.1轉(zhuǎn)基因水稻陽性篩選植株P(guān)CR鑒定結(jié)果
經(jīng)組織培養(yǎng)和抗性篩選獲得40株再生水稻植株，經(jīng)PCR鑒定成功獲得了 15株轉(zhuǎn)基 因水稻，圖3為部分轉(zhuǎn)基因水稻植株進(jìn)行潮霉素抗性篩選標(biāo)記基因(借TO PCR擴增結(jié) 果，擴增結(jié)果顯示抗性植株均擴增出與陽性對照擴增產(chǎn)物大小一致的特異條帶,證明朋7 基因已整合到轉(zhuǎn)化水稻的基因組中；陽性植株再以番茄戶/^i 基因的特異引物對該基因 部分序列片段進(jìn)行PCR擴增，結(jié)果顯示陽性轉(zhuǎn)基因植株均擴增到特異的長度為568 bp 的特異條帶，表明外源基因尸/ffi 已經(jīng)整合到水稻基因組中(圖4)
3丄2轉(zhuǎn)基因番茄陽性篩選植株P(guān)CR鑒定結(jié)果
經(jīng)組織培養(yǎng)和抗性篩選獲得30株再生番茄植株，經(jīng)PCR鑒定成功獲得了 12株轉(zhuǎn)基 因水稻，圖5為部分轉(zhuǎn)基因番茄植株進(jìn)行卡那霉素抗性篩選標(biāo)記基因(AP77/) PCR擴 增結(jié)果,擴增結(jié)果顯示抗性植株均擴增出與陽性對照擴增產(chǎn)物大小一致的特異條帶，證 明yV/77/基因己整合到轉(zhuǎn)化水稻的基因組中。
3.1.3轉(zhuǎn)基因水稻陽性篩選植株RT-PCR鑒定結(jié)果
經(jīng)鑒定后，發(fā)現(xiàn)pHB-戶Z/Si 轉(zhuǎn)基因水稻的3個獨立的植株(pHB-PHSR-l， pHB-PHSR-2和pHB-PHSR-3)尸/ZSi 的mRNA的量明顯升高，而野生型水稻中卻檢測 不到尸Z/Si 的mRNA (圖6)。
3.1.4轉(zhuǎn)基因番茄陽性篩選植株RT-PCR鑒定結(jié)果
經(jīng)鑒定后，發(fā)現(xiàn)/^//"-尸//朋轉(zhuǎn)基因番茄的4個獨立的植株(pBI121-PHSR-l， pBI121-PHSR-2， pBI121-PHSR-3和pBI121-PHSR-4)尸/Ki 的mRNA的量明顯升高， 而野生型番茄中卻檢測不到戶7/57 的mRNA (圖7)。
3.2轉(zhuǎn)基因水稻種子和野生型水稻種子萌發(fā)實驗結(jié)果在萌發(fā)的前期，p/ffi-P/ffi 轉(zhuǎn)基因水稻植株的T2代種子發(fā)芽速率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于野生 型水稻種子的發(fā)芽速率(圖8)。在萌發(fā)2天后，野生型水稻種子和/ /ffi-P/ff及轉(zhuǎn)基因 水稻植株的T2代種子都沒有萌發(fā)；在萌發(fā)3天后，野生型水稻種子的萌發(fā)率30%,而 / //5-戶//1^轉(zhuǎn)基因水稻植株的丁2代種子都沒有萌發(fā)；在萌發(fā)4天后，野生型水稻種子 的萌發(fā)率100%,而; /ffi-尸i/Si 轉(zhuǎn)基因水稻植株的T2代種子只有少部分萌發(fā)，萌發(fā)率不 到30%;在萌發(fā)5天后，/7/ffi /ffi 轉(zhuǎn)基因水稻植株的T2代種子萌發(fā)率達(dá)到50%左右； 此后的時間里，/7/ffi i/SJ 轉(zhuǎn)基因水稻植株的T2代種子的發(fā)芽勢率較前期出現(xiàn)大幅度 上升，萌發(fā)8天后，/7//5-尸/ZS7 轉(zhuǎn)基因水稻植株的T2代種子基本全部發(fā)芽(圖9)。并 且隨著ABA濃度的升高轉(zhuǎn)基因水稻植株的T2代種子的發(fā)芽速率隨之降低(圖10,圖 11)。由此可見，P/ZS7 基因能夠抑制水稻種子的發(fā)芽勢、降低發(fā)芽速度，但對轉(zhuǎn)基因種 子的最終發(fā)芽率的無影響。綜上所述，PZ/Si 基因在水稻植物體內(nèi)的過量表達(dá)能夠有效 地提高水稻的穗萌抗性。
3.3轉(zhuǎn)基因番茄種子和野生型番茄種子萌發(fā)實驗結(jié)果
在萌發(fā)的前期，；^/7"-戶/ZSi 轉(zhuǎn)基因番茄植株的T2代種子的發(fā)芽速率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于 野生型番茄種子的發(fā)芽速率(圖12)，把野生型番茄種子和;^/"/-/>/^及轉(zhuǎn)基因番茄植 株的T2代種子放到不同濃度的ABA處理的1/2MS培養(yǎng)基中觀察種子的萌發(fā)的情況。 在萌發(fā)的8天后發(fā)現(xiàn)隨著ABA濃度的升高，；^/"7-P/ff; 轉(zhuǎn)基因番茄植株的T2代種 子與野生型番茄種子相比，種子萌發(fā)所受到的抑制也越嚴(yán)重，在(HiMABA的條件下， p5/7"-戶/ffi 轉(zhuǎn)基因番茄植株的T2代種子與野生型番茄種子都能夠正常的萌發(fā)，在0.5
， 2.5 ， 5^^八的濃度下,/^/"/-尸/^7 轉(zhuǎn)基因番茄植株的丁2代種子的萌發(fā) 受到的抑制明顯比野生型番茄種子的嚴(yán)重，在10pM ， 50pM的ABA濃度下， /^/"7-戶/7Si 轉(zhuǎn)基因番茄植株的T2代種子不能正常的萌發(fā)，但是野生型番茄種子還能 夠正常萌發(fā)，不過幼苗的生長和發(fā)育也受到了明顯的抑制(圖13)。由此可見， 基因在番茄植物體內(nèi)的過量表達(dá)能夠有效抑制種子的萌發(fā)，從而提高番茄的穗萌抗性。
序列表
〈110〉四川大學(xué)
〈120〉 一種提高植物穗萌抗性的真核重組質(zhì)粒及其應(yīng)用 <160> 2
<170> Patentln Version 3.2
<210> 1
<211〉 1754
<212〉 DNA
<213> 番茄(Z^co; ers/cow ew/e她m)〈220>
<221> mRNA
〈222〉 (1) 一 (1754)
〈223〉提高植物穗萌抗性的基因
<400〉 1
犯gttgtC33gtcaaaatca3g犯tgaaaaggg已gtt犯3tgatgtttatt已tggtggC360
acaaagaagatgtgC3tgg3tttgagaatattaatatggtgcctactgattttgatccta120
tggatgatacagatatttggtt犯atgg犯atttctctaatgattttacttctcttcaag180
attttccatgcatgtcttcttcatcatcaacttccaattcccttcctactgaacaatctg240
atccatcttctggttgggctgttcaaaaatctgstgctgatgagcaagatttCg3C3C犯300
ttagtgatcaagaatgtcta犯tgtgatgg3ttt犯tcgacggggatcatg犯tttcttg360
accctatgatatcttttttcaat caacaacgagc犯gtgt420
ctatttttca鄉(xiāng)gg咖gtgaacttgcactaatgtttttggattggtta480
aagataacatttctgctgaagatatgaggagtattaELgc1:taaacgttcgac犯ttgaga540
gcgcgtcgaa3Cg3ttggg3agtactaaag已C3gttgttgagactca,ttc600
ttgELttgggt3ggttgcaaELcagagtatcc660
aaaactctgccccttttaactttaataatccaaatgcttgcttttataatgcctcgttca720
ccgattcgtcctctgtaatgacagggccaatacaggggtacttcgtgcctccgtataatc780
aaacaatgagtggaagttcaacttctcagtcctggtctcagtcgcaatttat犯tggcga840
acgcttctcaatac犯tcgatttcctgeigaataatattacgaat犯tgttgctatacctg900
atcagcctttattcagtgctcaatatgatcagt8cca犯ttttcgatgggagcggtg,960
g3ttggC犯ggttgggcacttgtgctacta犯g幼gccagg犯g3tcagaatggctaggc1020
卿g3CgELgtaccattgcatcattatcgtcatcagactcaga^tcaaagscaaBttagta1080
3tgagaa犯gtgtaatgatgggt卿a卿tt犯taattgtgcaatatctc犯gctaac31140
atccaggaaattgggtatattggccttgtgctgctgctgctccgcc犯tcgccatggtac薦
cattggctgatactccgcaatcacttcctatgg鄉(xiāng)ggtcacccgtgc幼1260
cggttcaacagacaaaagacaggcttgcaaaac3g3gaagaat c t caaat1320
ttctcatgca犯犯gtgctg犯gcaaagtgatgttggccatctaggaagaattgtgttac1380
agcaga犯gtcatctcccgca^cttgaaac犯g卿cggaatctcaattg1440
ccatggaagacattgggacttgtcgtgtttgg犯catg犯atatagattttggccaaata1520
a_c^^gc￡igg3tgt6LCCttctcgagaeicEicaggtgattttgtcgtagct肌tgggicttc1580aagaaggtga tttcatagta atatacgccg gggtaaaagt gaggccgaat ggagcaaaat ttcgtaaaat agctgctgtt gcgtcatctc aaagagaaeit csat
acataaagtg tggcaaatat ttgatacgag 1620 cagatggcat gcagccagca aagaaaattg 1680 catttgcaca agctgttgga tagtccagga 1740
1754
〈210〉 2
<211> 569
〈212〉 PRT
〈213〉 番茄(Arcc^erw'co" a c〃7e"t〃邁) 〈223〉提高植物抗逆性的多肽
〈400〉 2 MET Lys Arg 1
Asp Val His Asp Pro MET Asn Asp Phe
Ser Gly Trp Asp Thr lie
Glu Leu Asn Asp Val Tyr Tyr Gly Gly Asn 5 Phe 20
Gly Asp
Thr
Ser Ser Thr Ser
Ala
Ser
Glu Asn lie Asn
Val Pro Thr
Asp
35
Ser
50
Asn
65
Val
80
Asp
95
Thr
Asp lie
40
Leu Gin Asp Phe Pro
55
Ser Leu Pro Thr Glu Gin Ser Asp Pro
70
Gin Lys Ser Asp Ala Asp Glu Gin Asp
85
Gin Glu Cys Leu Asn Val MET Asp Leu
100
Lys Asp
10 MET 25
Trp Leu Asn Gly Asn Phe
Cys MET Ser Ser
Glu
15 Phe
30 Ser
45 Ser
60 Ser
75 Phe
90 lie 105
Asp Gly Asp His Glu Phe Leu Asp Pro MET lie Ser Phe Phe Asn
110115 120
Gin Gin Gin Lys Glu Gin Ala Asn Glu Glu Gin Val Ser lie Phe
125130 135
21Gin Gly Asp Ser Gin Asn Lys Asp Leu Lys Arg Ser Thr Lys Glu Gly Val Glu Gin His Ser工le Gin Asn
Glu L>eu 140
Asn lie 155
Thr工le 170
Lys Lys 185
Arg Leu 200
Ser Ala 215
Ala Leu MET Phe Leu Asp Trp Leu 145
Ser Ala Glu Asp MET Arg Ser lie
Glu Ser Ala Ser Lys Arg Leu Gly
Gin Leu Leu Arg Leu lie Leu Asp 190
Gin Lys Lys Gin MET Arg Glu Glu 205
Pro Phe Asn Phe Asn Asn Pro Asn
Cys Phe Tyr Asn Ala Ser Phe Thr Asp Ser Ser Ser Val MET Gly Pro lie Gin Gly Tyr Phe Val Pro Pro Tyr Asn Gin Thr Ser Gly Ser
Ser Thr Ser
MET Ala Asn Ala Ser Gin
Thr Asn Asn Val Ala lie
Ala 230 Gly 245 Thr 260 Ser 275 Ala 290 Gin 305 Cys 320 Arg 335
Tyr Gin lie
Tyr Asp Gin Arg Leu Gly
Ala Arg Gin Arg Arg Val Pro Leu His
Thr Cys Ala
Gin Ser Trp Tyr Asn Arg Pro Asp Gin Phe Asp Gly Thr Lys Glu
Phe 145 Asp 160 Ser 175 Arg 190 Gin 205 Phe 220 Ser 235 Pro 250 Ser 265 Phe 280 Pro 295 Ser 310 Ala 325 His 340
Gin Ser Gin Phe
Pro Glu Asn Asn Leu Phe Ser Ala Gly Glu Arg Leu Arg Lys lie Arg Tyr Arg His Gin
Gin Asn Gin Arg Gin lie Ser Asn Glu Lys Ser Val MET MET
350 355
Asn Cys Ala lie Ser Gin 365 370
Arg Lys lie Asn Asn Cys Ala lie Ser Gin Ala Asn Asn Pro
Lys 150 Lys 165 Ser 180 Trp 195 Gin 210 Ala 225 Thr 240 MET
255 lie 270 lie 285 Gin 300 Ala 315 MET 330 Thr 345
Gly 360 Gly 375Asn Trp Val Tyr MET Val Pro Leu Ser Pro Val Gin Lys Arg Gin Ala Gin Lys Val Leu Val Leu Pro Lys Gly
Thr Arg Arg Val Arg MET Gly Leu Cys Gly Ala Lys
Asp Trp Tyr
Lys
Ser
Asn
Leu
Gin Glu
Tyr Asp
lie Ala Ala Val
Trp 380 Ala 395 Ser 410 Cys 425 Lys 440 Lys 455 lie 470 MET 485 Leu 500 Gly 515 Leu 530 Gly 545 Ala 560
Pro Cys Ala Ala Asp Thr Pro Gin Gin Lys His Gin Lys Thr Glu Lys Gin Ser Asp Val Glu Ala Glu Ser
Ser lie Ala MET Glu Asp lie Gly
Lys Tyr Arg Phe Trp Pro Asn Asn
Glu Asn Thr Gly Asp Phe Val Val
Asp Phe lie 工le Arg Gly
Val
Val
MET Gin Pro Ala Lys Lys lie Val
Ser Ser Pro Phe
Ala 385 Ser 400 Lys 415 Asn 430 Gly 445 His 460 Glu 475 Trp 490 Asp 505 lie 520 Lys 535 Lys 550 Ala 565
Ala Pro Pro
Leu Pro MET
Asn
Leu
His
Gly Ser Lys Phe Lieu Gly
Leu P:co Gin
Tyr
Val
Ala Asp Arg Pro
Gin Ala Val
lie Ala
390 Glu Arg
405 Thr Asp
420 Leu MET
435 Arg lie
450 Leu Glu
465 Thr Cys
480 Lys Ser
495 Ala Asn
510 lie Lys
525 Asn Gly
540 Arg Lys
555
Gly
權(quán)利要求
1、一種提高植物穗萌抗性的基因，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO1所述的核苷酸序列。
2、 一種提高植物穗萌抗性的真核重組質(zhì)粒，其特征在于它由序列表中SEQIDNO: 1所述的核苷酸序列插入到真核表達(dá)載體中獲得。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的真核重組質(zhì)粒，其特征在于所述真核表達(dá)載體為pHB、 pMON1772、 pBE12、 pBC7、 pBI121中的一種。
4、 權(quán)利要求2所述真核重組質(zhì)粒在植物穗萌抗性改良中的應(yīng)用。
全文摘要
一種提高植物穗萌抗性的基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO1所示。將SEQ ID NO1所述的核苷酸序列插入到真核載體中，獲得本發(fā)明所述真核重組質(zhì)粒。將上述真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化水稻和番茄，獲轉(zhuǎn)基因植株。實驗表明本發(fā)明所述SEQ IDNO1基因能夠抑制水稻等種子的發(fā)芽勢、降低發(fā)芽速度，但對種子的最終發(fā)芽率沒有影響；與野生型種子相比，轉(zhuǎn)基因種子隨著脫落酸(ABA)濃度的升高，種子萌發(fā)所受到的抑制也越明顯。因此，本發(fā)明所述的基因可在植物穗萌抗性的改良中應(yīng)用。
文檔編號C12N15/82GK101597611SQ20091005981
公開日2009年12月9日 申請日期2009年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月29日
發(fā)明者旭 余, 劉永生, 劉永勝, 劉繼愷, 鵬 張, 牛向麗, 晶 范, 高永峰 申請人:四川大學(xué)