專利名稱：一種采用組合抑菌劑從天然水域中快速分離異養(yǎng)微藻的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種采用組合抑菌劑從天然水域中快速分離異養(yǎng)微藻的方法，屬于微藻生 物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
微藻富含蛋白質(zhì)、脂肪、EPA、 DHA等多種功能活性物質(zhì)，具有重要的經(jīng)濟價值。開 發(fā)利用微藻已成為人類獲得食品、藥品、生物燃料等的新途徑。微藻屬于低等植物，主要 是利用光合作用轉(zhuǎn)化無機碳源而進行生長。傳統(tǒng)的開放光合自養(yǎng)方式存在光照限制、易污 染和占地面積大等問題，因而生產(chǎn)效率不高。研究表明，某些單細胞微藻(如小球藻)可 在無光照條件下利用有機碳源進行異養(yǎng)生長，其生物量及生產(chǎn)效率均得到大幅度提高，這 為微藻的高效規(guī)?；a(chǎn)提供了可能。
從自然界篩選異養(yǎng)微藻，是為工業(yè)生產(chǎn)提供高效藻株，以及進一步深入研究微藻異養(yǎng) 生長的機制的需要。到目前為止，常用的微藻純化方法主要是在光照自養(yǎng)或混養(yǎng)條件下， 采用物理方法如涂布、劃線、毛細吸管等方法。對于異養(yǎng)藻株篩選來說，這些研究的主要 不足之處在于；(1)主要依賴于光照自養(yǎng)培養(yǎng)的反復分離純化，周期長，設(shè)備要求較高 (一般需要光照培養(yǎng)裝置)；(2)分離的藻株缺乏針對性，大多數(shù)藻株不能在異養(yǎng)條件 下生長；(3)藻種的無菌化效率較低，在多次傳代培養(yǎng)、尤其是異養(yǎng)培養(yǎng)之后易污染雜 菌；(4)目前采用抗生素的微藻無菌化方法主要針對細菌，然而在我們的研究中發(fā)現(xiàn)， 對于異養(yǎng)藻種的篩選來說，克服霉菌污染是一個更為困難的問題。
通過對國內(nèi)專利和文獻檢索，還未見關(guān)于從天然水域中直接分離純化異養(yǎng)微藻方法的 報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種采用組合抑菌劑從天然水域中快速 地分離異養(yǎng)微藻的方法。
本發(fā)明的目的由以下技術(shù)措施實現(xiàn)
采用組合抑菌劑從天然水域中快速分離異養(yǎng)微藻的方法包括以下步驟(1) 配制微藻自養(yǎng)液體培養(yǎng)基(如水生4號培養(yǎng)基、Basal培養(yǎng)基或Kuhl培養(yǎng)基等)；將 配制好的液體培養(yǎng)基裝入三角瓶中，加硅膠塞，在溫度121。C滅菌15-20min，冷卻備用。
(2) 配制微藻固體異養(yǎng)培養(yǎng)基在微藻自養(yǎng)液體培養(yǎng)基中加入1%葡萄糖及1.5-2%瓊脂， 在水浴中加熱攪拌煮沸，裝入三角瓶中，加硅膠塞，在溫度121。C滅菌15 20min，冷卻備 用；
(3) 含組合抑菌劑的培養(yǎng)基平板制備將微藻固體異養(yǎng)培養(yǎng)基加熱融化，冷卻至50-6(TC， 加入20-60pg/mL的氨芐青霉素和200-600pg/mL的納他霉素，混勻后倒平板；
(4) 取天然水樣如水樣中的微藻數(shù)量較多，直接進入步驟(5);如水樣中微藻數(shù)量較 少，則將水樣高速離心(轉(zhuǎn)速^3000rpm,時間》15min)，棄去上清液，重復離心并棄去 上清液3-5次，加入微藻自養(yǎng)液體培養(yǎng)基，自然光照增殖培養(yǎng)一周左右；
(5) 將水樣或經(jīng)過步驟(4)增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)液均勻涂布于含組合抑菌劑的培養(yǎng)基平板， 然后于恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)；
(6) 待平板上長出有色藻落后，用接種環(huán)挑取到空白的含組合抑菌劑的培養(yǎng)基平板上劃 線，于溫度25-35'C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2-3天；
(7) 重復步驟(6) 3-5次，獲得純化的可異養(yǎng)培養(yǎng)的微藻。 本發(fā)明具有如下優(yōu)點
1. 不依賴于光照自養(yǎng)培養(yǎng)的反復分離純化，周期短，操作簡單，設(shè)備要求低，不需要
光照培養(yǎng)裝置。
2. 分離藻株具有明確的針對性，可確保分離到的藻株能在異養(yǎng)培養(yǎng)條件下生長。
3. 藻種的無菌化效率高，在多次異養(yǎng)傳代培養(yǎng)之后不易污染雜菌。
4. 能夠有效克服異養(yǎng)藻種篩選過程中的霉菌污染問題。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發(fā)明進行具體的描述，有必要在此指出的是本實施例只用于對本 發(fā)明進行進一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以 根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容對本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整。 實施例1
(1) 配制Basal液體培養(yǎng)基(1000mL) : KN03 1.25g， KH2P04 1.25g, MgS04 lg, A液100mL， B液10mL。其中A液配方(lOOOmL) : H3B031.142 g， CaCl2 '2H:;0 1.11 g, ZnS04 7H20 0. 882 g， MnCl2 4H20 0.142 g， CuS04 5H20 0.157 g， Mo03 0.071 g， Co(N03)2 6H20 0.049 g， EDTA 4 g; B液配方(lOOmL) : FeS04 7H20 0.498 g， EDTA1 g。用5%的NaOH將培養(yǎng)基的pH調(diào)為6.1 。在500 mL三角瓶中加入50mL配制好的Basal 培養(yǎng)基，將瓶口用硅膠塞封閉后在溫度12rC滅菌15min，冷卻備用。
(2) 配制異養(yǎng)Basal固體培養(yǎng)基在Basal液體培養(yǎng)基中加入1 %的葡萄糖和1.5% 的瓊脂，在水浴中加熱攪拌煮沸，稍冷卻后，用5。/。的NaOH將培養(yǎng)基的pH調(diào)為6.1，將 調(diào)好pH的培養(yǎng)基放入三角瓶，將瓶口用硅膠塞封閉后在溫度121'C滅菌15min，冷卻備用。
(3) 抑菌劑平板制備將異養(yǎng)Basal固體培養(yǎng)基加熱融化后冷卻至50°C，加入 40嗎/mL的氨節(jié)青霉素和400嗎/mL的納他霉素，迅速混勻后倒平板。
(4) 將含有微藻的成都府南河水樣，經(jīng)離心機離心(3000rpm, 15min)后倒去上清 液，重復3次后，搖勻離心管底部的藻細胞溶液懸浮，并將此溶液(約共有50mL)移入 裝有50 mL滅菌Basal液體培養(yǎng)基的三角瓶中，放于自然光照下增殖培養(yǎng)一周。
(5) 將增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)液均勻涂布于含組合抑菌劑的培養(yǎng)基平板，然后于28'C恒 溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。
(6) 待平板上長出綠色藻落后，用接種環(huán)挑取到空白的含組合抑菌劑的培養(yǎng)基平板 上劃線，然后于溫度28'C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2天。
(7) 重復步驟(6) 3次，獲得純化的可異養(yǎng)培養(yǎng)的綠藻(初步鑒定為小球藻)。
該藻株可在含葡萄糖的液體或固體Basal培養(yǎng)基上生長。 實施例2
(1) 配制水生4號液體培養(yǎng)基(1000mL) : (NH4)2S04 0.2g ，過磷酸鈣 Ca(H2P04) 'H20+2(CaS。4 'H2。)0.03g ， MgS04 '7H2O0.08g, NaHC03 0.10g， KC10.025g， FeCl3(l。/。溶液)0.15mL, 土壤浸出液0.5mL;用5%NaOH將pH調(diào)為6.1。在500mL三角 瓶中加入50mL配制好的Basal培養(yǎng)基，將瓶口用硅膠塞封閉后在溫度121'C滅菌15min， 冷卻備用。
(2) 配制異養(yǎng)水生4號固體培養(yǎng)基在水生4號液體培養(yǎng)基中加入1%的葡萄糖和 1.5%的瓊脂，在水浴中加熱攪拌煮沸，稍冷卻后，用5y。的NaOH將培養(yǎng)基的pH調(diào)為6.1， 將調(diào)好pH的培養(yǎng)基放入三角瓶，將瓶口用硅膠塞封閉后在溫度12rC滅菌15min，冷卻備用。
(3) 抑菌劑平板制備將異養(yǎng)水生4號固體培養(yǎng)基加熱融化后冷卻至5(TC，加入 60嗎/mL的氨芐青霉素和600嗎/mL的納他霉素，迅速混勻后倒平板。
(4) 將含有微藻的成都江安河水樣，經(jīng)離心機離心(3000rpm， 15min)后倒去上清 液，重復3次后，搖勻離心管底部的藻細胞溶液懸浮，并將此溶液(約共有50mL)移入裝有50 mL滅菌Basal液體培養(yǎng)基的三角瓶中，放于自然光照下增殖培養(yǎng)一周。
(5) 將增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)液均勻涂布于含組合抑菌劑的培養(yǎng)基平板，然后于35°。直 溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。
(6) 待平板上長出綠色藻落后，用接種環(huán)挑取到空白的含組合抑菌劑的培養(yǎng)基平板 上劃線，然后于溫度35'C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3天。
(7) 重復步驟(6) 5次，獲得純化的可異養(yǎng)培養(yǎng)的綠藻。該藻株可在含葡萄糖的 液體或固體水生4號培養(yǎng)基上生長。
實施例3
(1) 配制Basal液體培養(yǎng)基(1000mL) : KN03 1.25g， KH2P04 1.25g， MgS04 lg， A液100mL， B液10mL。其中A液配方(lOOOmL) : H3B031.142 g， CaCI2 '2H20 1.11 g， ZnS04 7H20 0.882 g， MnCl2 4H20 0.142 g， CuS04 5H20 0.157 g， Mo03 0.071 g， Co(N03)2 6H20 0.049 g， EDTA 4 g; B液配方(lOOmL) : FeS04 7H20 0.498 g， EDTA 1 g。用5%的NaOH將培養(yǎng)基的pH調(diào)為6.1 。在500 mL三角瓶中加入50mL配制好的Basal 培養(yǎng)基，將瓶口用硅膠塞封閉后在12rC滅菌15min，冷卻備用。
(2) 配制異養(yǎng)Basal固體培養(yǎng)基在Basal液體培養(yǎng)基中加入1 %的葡萄糖和2%的 瓊脂，在水浴中加熱攪拌煮沸，稍冷卻后，用5n/。的NaOH將培養(yǎng)基的pH調(diào)為6.1，將調(diào) 好pH的培養(yǎng)基放入三角瓶，將瓶口用硅膠塞封閉后在溫度12rC滅菌15min，冷卻備用。
(3) 抑菌劑平板制備將異養(yǎng)Basal固體培養(yǎng)基加熱融化后冷卻至50°C，加入 20嗎/mL的氨芐青霉素和200ng/mL的納他霉素，迅速混勻后倒平板。
(4) 將含有微藻的成都府南河水樣，經(jīng)離心機離心(3000rpm， 15min)后倒去上清 液，重復3次后，搖勻離心管底部的藻細胞溶液懸浮，并將此溶液(約共有50mL)移入 裝有50 mL滅菌Basal液體培養(yǎng)基的三角瓶中，放于自然光照下增殖培養(yǎng)一周。
(5) 將增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)液均勻涂布于含組合抑菌劑的培養(yǎng)基平板，然后于25'C恒 溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。
(6) 待平板上長出紅色藻落后，用接種環(huán)挑取到空白的含組合抑菌劑的培養(yǎng)基平板 上劃線，然后于溫度25'C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3天。
重復步驟(6) 4次，獲得純化的可異養(yǎng)培養(yǎng)的紅球藻。該藻株可在含葡萄糖的液體或 固體Basal培養(yǎng)基上生長。
權(quán)利要求
1.一種從天然水域中快速分離可異養(yǎng)培養(yǎng)微藻的方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)配制微藻自養(yǎng)液體培養(yǎng)基將配制好的液體培養(yǎng)基裝入三角瓶中，加硅膠塞，在溫度121℃滅菌15-20min，冷卻備用；(2)配制微藻固體異養(yǎng)培養(yǎng)基在微藻自養(yǎng)液體培養(yǎng)基中加入1％葡萄糖及1.5-2％瓊脂，在水浴中加熱攪拌煮沸，裝入三角瓶中，加硅膠塞，在溫度121℃滅菌15～20min，冷卻備用；(3)含組合抑菌劑的培養(yǎng)基平板制備，將微藻固體異養(yǎng)培養(yǎng)基加熱融化后冷卻至50-60℃，加入20-60μg/mL的氨芐青霉素和200-600μg/mL的納他霉素，混勻后倒平板；(4)取天然水樣如水樣中微藻數(shù)量較多，直接進入步驟(5)；如水樣中微藻數(shù)量較少，則將水樣高速離心，轉(zhuǎn)速≥3000rpm，時間≥15min，棄去上清液，重復離心并棄去上清液3-5次，加入微藻自養(yǎng)液體培養(yǎng)基，自然光照增殖培養(yǎng)一周左右；(5)將水樣或經(jīng)過步驟(4)增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)液均勻涂布于含組合抑菌劑的培養(yǎng)基平板，于溫度25-35℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)；(6)待平板上長出有色藻落后，用接種環(huán)挑取到空白的含組合抑菌劑的培養(yǎng)基平板上劃線，然后于恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2-3天；(7)重復步驟(6)3-5次，獲得純化的可異養(yǎng)培養(yǎng)的微藻。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種采用組合抑菌劑從天然水域中快速分離純化異養(yǎng)微藻的方法。其特點是該方法包括以下步驟a)配制微藻自養(yǎng)液體培養(yǎng)基；b)配制微藻固體異養(yǎng)培養(yǎng)基(在微藻自養(yǎng)液體培養(yǎng)基中加入1％葡萄糖及1.5-2％瓊脂)；c)制備含組合抑菌劑(20-60μg/mL氨芐青霉素，200-600μg/mL納他霉素)的培養(yǎng)基平板；d)將天然水樣或經(jīng)過增殖培養(yǎng)的水樣涂布于含組合抑菌劑的培養(yǎng)基平板，于溫度25-35℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；e)待平板上長出有色藻落后，用接種環(huán)挑取到空白的含組合抑菌劑的培養(yǎng)基平板上劃線，然后于25-35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；f)重復步驟e)3-5次，即可獲得純化的可異養(yǎng)培養(yǎng)的微藻。本發(fā)明具有操作簡便、快速、可靠，能在較短時間內(nèi)從天然水域中分離純化出可異養(yǎng)培養(yǎng)微藻的優(yōu)點。
文檔編號C12N1/12GK101608164SQ20091006001
公開日2009年12月23日 申請日期2009年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月17日
發(fā)明者吳正云, 張文學, 娟 曾 申請人:四川大學