專利名稱：牛早期胚胎性別鑒定的分子生物學(xué)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物繁殖技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及牛早期胚胎性別鑒定領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
為了充分發(fā)揮母畜的繁殖潛力和公畜的生長優(yōu)勢，進(jìn)而提高畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益.排除畜群中有害基因 和基因型，防止性連鎖疾病。增加核心群選種中的選擇強(qiáng)度，提高優(yōu)良畜群的繁殖速度，加快奶畜群的更 新?lián)Q代，人為控制家畜性別一直是人們追求的目標(biāo)，特別是對于有經(jīng)濟(jì)價值的家畜,如牛。對牛早期胚胎 尤其是附植前胚胎進(jìn)行性別鑒定，再進(jìn)行移植,在生產(chǎn)中具有重要的科學(xué)研究價值和商業(yè)價值。因為牛繁殖 周期長，繁殖速度慢，如能有效控制后代性別，不僅意味著經(jīng)濟(jì)效益的增加，對促進(jìn)優(yōu)良母?；虻耐茝V、 加速品種改良有重要的意義。動物的某些生產(chǎn)性狀是受性別限制(泌乳等)或性別影響的(產(chǎn)肉、產(chǎn)毛等)， 通過性別控制，達(dá)到理想的性別比例，可以獲得更多的所需性狀及更大的經(jīng)濟(jì)效益。家畜胚胎的早期性別 鑒定技術(shù)，是實現(xiàn)家畜性別控制的一種重要方法。通過移植已知性別的胚胎，控制家畜后代的性別，能加 快優(yōu)良母畜的繁殖速度，促進(jìn)高效畜牧業(yè)的發(fā)展。這在養(yǎng)牛業(yè)上尤為重要。因為牛的妊娠期較長，人們渴 望能夠在胚胎移植前對其進(jìn)行性別鑒定，從而只移植所需性別的胚胎，節(jié)省不必要的時間和花費(fèi)。
到目前，在牛繁殖生產(chǎn)中有實用價值的有2種途徑①含X、 Y染色體精子的分離技術(shù)，即通過X、 Y精 子微弱的生物學(xué)差異，分離出含兩種染色體的精子，用于人工授精或體外受精。流式細(xì)胞分離儀分離精子 的準(zhǔn)確率達(dá)到90%，但目前分離速度太慢(1.8X107個/h),精液價格昂貴，且分離后精液不耐冷凍，后 代有一定的畸形率，因而應(yīng)用受到限制。②早期胚胎性別鑒定是在20世紀(jì)70年代中期，隨著胚胎移植的商 業(yè)化出現(xiàn)的?；仡?0多年的研究，核型分析、免疫學(xué)方法(H2Y抗原法)及生化方法(X2連接酶活力測定法) 在應(yīng)用于生產(chǎn)時都受到靈敏度、準(zhǔn)確性、或所需時間等因素的限制。核型分析法準(zhǔn)確率可達(dá)100%,但要獲 得良好的細(xì)胞中期染色體擴(kuò)散較難，鑒別時間也很長，胚胎可鑒別率較低；H2Y抗原是否為雄性特異性抗 原尚有爭議；由于各種家畜早期雌性胚胎X染色體的失活與激活的確切時間還不清楚，因而降低了X2連接 酶檢測法的準(zhǔn)確率，且使用的染料影響胚胎的存活。而PCR法因其準(zhǔn)確、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，成為目前比 較理想的胚胎性別鑒定方法。PCR法已經(jīng)成功用于鑒別多種哺乳動物的胚胎性別，在養(yǎng)牛業(yè)應(yīng)用的較多也較 成熟。數(shù)以千計的現(xiàn)場牛胚胎性別鑒定結(jié)果表明PCR法性別鑒定較為實用(Shea， 1999)，經(jīng)得起生產(chǎn)考驗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，尋找一種可靠的用于牛早期胚胎性別鑒定的分子生物學(xué) 方法。
實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是 -一種牛早期胚胎性別鑒定的分子生物學(xué)方法，采用巢式PCR方法，其步驟如下 1、試樣的制備與保存
從待檢牛胚胎中分離4個或4個以上的細(xì)胞，用無菌超純水沖洗3次后，放入0.5 mL PCR管中，加入10 UL無菌超純水，100 。C煮沸10 min 15 min，立即置于碎冰中，冷卻后在8228Xg 4'C離心5 min， 取上清液保存于4 'C冰箱中備用； 2、引物設(shè)計
根據(jù)牛i^r基因序列(GeneBank登錄號EU581861)，利用生物學(xué)引物設(shè)計軟件Primer3和Primer Premier 5，設(shè)計巢式PCR擴(kuò)增引物。引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。本發(fā)明設(shè)計了嵌套式 內(nèi)引物，并根據(jù)牛i^S基因(GeneBank登錄號NC_007313)設(shè)計了兩對嵌套式引物作為內(nèi)部對照，以確 定PCR的有效性，防止假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。 設(shè)計的引物序列如下
SRY1 (外引物)正向5'CTACTCCCCMCCGTCAGAAC 3';
反向5'AGCCCAAACCCATCMCCTA 3';
SRY2 (內(nèi)引物)正向:5'CCAGGGMCTGCTTGGGTA 3';
反向5'TGCTTCTCCACTTAGGCTCAA 3';
HBB (內(nèi)參照引物)正向5'TATCCCACTTACMGGCAGGTT 3';
反向5'GCAGACAACAGAGMCAAGMTGA 3'
3、 巢式PCR反應(yīng)
第一次PCR反應(yīng)以SRY1外引物和內(nèi)參照HBB引物擴(kuò)增，體系為20 y L: 0. 8 mmol/L的dNTP、 2U 的Taq DNA聚合酶、0. 2 u mol/L的SRY基因外引物SRY1和內(nèi)參照引物HBB、 10XPCK緩沖液(購自TIANGEN 公司)、2.5咖ol/L的MgC12，加適量雙蒸水；反應(yīng)程序為95。C預(yù)變性5 min， 94。C變性30 s, 60 。C退火 30 s， 72 。C延伸30 s， 20個循環(huán)結(jié)束后，72。C再延伸10 min， 4'C保溫2 rain 10min。
第二次PCR反應(yīng)，以SRY2外引物和內(nèi)參照HBB引物擴(kuò)增，取第1次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8 u L，作為第2次 擴(kuò)增模板，同時加入10XPCR緩沖液(購自TIANGEN公司)、2. 5 ramol/L的MgC12 、 0. 8 mmol/L的dNTP 1. 6 n L, 2U的Taq DNA聚合酶、0. 2 u mol/L的SRY基因內(nèi)引物SRY2和內(nèi)參照引物HBB、適量的雙蒸水至 20ixL;反應(yīng)程序為95 'C預(yù)變性5 min， 94 。C變性30 s， 60 。C退火30 s， 72 。C延伸30 s, 34個循環(huán) 后，72 。C再延伸10 min， 4'C保溫2 min 10min。
4、 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測
取5 uL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，1. 0% 1.5%瓊脂糖凝膠電泳(3 V/cm 5V/cm，電泳20 min 30 min)， 溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)檢査，電泳圖譜參見附圖2。
5、 結(jié)果判定
檢測電泳圖譜中是否同時出現(xiàn)558 bp (HBB擴(kuò)增的產(chǎn)物)和219 bp (SRY擴(kuò)增產(chǎn)物)兩條帶；如果電 泳圖譜中出現(xiàn)558 bp (HBB擴(kuò)增的產(chǎn)物)和219 bp (SRY擴(kuò)增產(chǎn)物)條帶，即判定為雄性胚胎；如果電泳 圖譜中只出現(xiàn)558 bp條帶,即可判定為雌性胚胎。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明建立的巢式PCR引物能夠有效地鑒定牛早期胚胎性別(見圖2所示。


序列表SEQ ID NO: 1是SRY1外引物擴(kuò)增的基因序列;序列表SEQ ID NO: 2是SRY2內(nèi)引物擴(kuò)增的基因序列; 序列表SEQ ID NO: 1是HBB內(nèi)參照引物擴(kuò)增的基因序列； 圖l:是本發(fā)明的技術(shù)流程圖2:用提取的牛早期胚胎DNA樣鑒定性別的電泳圖。瓊脂糖膠濃度為1. 2%。圖中編號說明如下泳道1 4均為雌性胚胎樣本，檢出558 bp條帶；泳道5 8均為雄性胚胎樣本，檢出558 bp和219 bp兩個條帶; M為100 bp梯度DNA標(biāo)記物。
具體實施例方式
實施例1
1、 試樣的制備與保存
從待檢牛胚胎中分離4個(或4個以上)細(xì)胞，用無菌超純水沖洗3次后，放入0.5 mL PCR管中， 加入10 iiL無菌超純水，100 。C煮沸10min 15min，立即置于碎冰中，冷卻后4'C離心(8228Xg)5min， 取上清液保存于4 'C冰箱中備用。
2、 引物設(shè)計
5vm(外引物)正向:5'CTACTCCCCAACCGTCAGMC 3';
反向5'AGCCCAAACCCATCMCCTA 3';
化 2(內(nèi)引物)正向:5'CCAGGGAACTGCTTGGGTA 3';
反向5'TGCTTCTCCACTTAGGCTCAA 3';
腳(內(nèi)參照引物)正向5'TATCCCACTTACMGGCAGGTT 3';
反向5'GCAGACMCAGAGAACAAGAATGA 3'。
3、 Si^基因片段'PCR擴(kuò)增
第一次擴(kuò)增體系為20 li L: 0. 8腿ol/L的dNTP、 2U的Taq DNA聚合酶、0. 2 u mol/L的5V F基因外 引物SRY1和內(nèi)參照引物朋》、 10XPCR緩沖液(購自TIANGEN公司)、2. 5 mmol/L的MgC12，加適量雙蒸 水；反應(yīng)程序為95。C預(yù)變性5 min， 94。C變性30 s， 60 。C退火30 s， 72 'C延伸30 s, 20個循環(huán)結(jié)束后， 72。C再延伸10 min, 4'C保溫2 min 10min。
取第1次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8 u L，作為第2次擴(kuò)增模板，同時加入10XPCR緩沖液(購自TIANGEN公司)、 2. 5 mmol/L的MgC12 、 0. 8 mmol/L的dNTP 1. 6 u L， 2U的Taq DNA聚合酶、0. 2 u mol/L的^SViT基因內(nèi) 引物SRY2和內(nèi)參照引物朋!e、適量的雙蒸水至20uL;反應(yīng)程序為95 'C預(yù)變性5 min, 94 。C變性30 s， 60 。C退火30 s， 72 。C延伸30 s， 34個循環(huán)后，72 。C再延伸10 min， 4。C保溫2 min 10min。
4、 結(jié)果判定
取5 uLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，1. 0% 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳(3 V/cm 5V/cm，電泳20 min 30 min),溴 化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)檢査，電泳圖譜參見附圖2。
檢測電泳圖譜中是否同時出現(xiàn)558 bp (AE5擴(kuò)增的產(chǎn)物)和219 bp (5W7擴(kuò)增產(chǎn)物)條帶。如果電泳 圖譜中出現(xiàn)558 bp (^E^擴(kuò)增的產(chǎn)物)和219 bp (S^T擴(kuò)增產(chǎn)物)條帶，即判定為雄性胚胎；如果電泳圖 譜中只出現(xiàn)558 bp條帶，即可判定為雌性胚胎。<110> <120> <130> <141〉 <薩 <170> <210〉 <211〉 <212> 〈213〉 <220> <221> <222> <223> <220> <221〉 <222> <223> <220〉 <221> 〈222> <223〉 〈220〉 <221> <222> <223> <220> <221〉
序列表
華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
牛早期胚胎性別鑒定的分子生物學(xué)方法
2009-01-06 3
Patentln version 3. 1 1
598 DNA
牛(Bos primigenius)
g6H6
(l).. (598)
primer_bind (262).. (282)
primer—bind (579).. (598)
primer—bind (l)..加
primer—bind〈222> (64).. (82) <223>
<400> 1
ctactccccaaccgtcagaaccctttgaagtgttatatta60
ac3ccagggaactgcttgggtaccaaggttatgtgttttttcttttaatggaacaggttt120
ttaatctaattttagttgtatctgagattgcctgttaaatatgtgttagtatetattagc180
attctgs冊gtcgttagcacagataatagaattaccagttattagctactgg犯tacgts240
catagatttttcagctgcactttgagcctacagggttagtg3tt3gC3tg300
gattgggt￡Ltcctgtgtattcaaatatataacagg3ttgggctgtt"tttcatcttttttt360
gttt犯gateacattctcttacattcataaccgtagacaatttgctagtatgtctgctgc420
accttcatcctttgaaataaataacttcataatgacactttttgtatttt480
t犯gc鄉(xiāng)tgttagcacattcaca犯ttctg3ttsg3tgtg犯agc卿g540
ccttaatatcctgttaagtagctttgcttgggttgatgggtttgggct598
<210> 2
<211> 219
<212> 腿
<213〉 牛(Bos primigenius) <220>
〈221> gene
〈222〉 (1)..(219) 〈223〉 〈220〉
〈221> primer—bind
〈222> (199).. (219) <223> 〈220>
〈221> primer—bind
〈222〉 (1)..(19) <223>
<400> 2
7ccaggg肌ctgcttgggtaccasggttatgtgttttttct tttaatggaa caggttttta
atctaattttagttgtatctgagattgcctgttaaatatg tgttagtata tattagcatt
ctgaasgtcgttagcacagat犯tagaatt accagttatt 3gctactgga atacgtacatagatttttcagctgcactttgagcct犯gtgg卿agca
<210>3
<211>558
〈212〉DNA
<213>牛(Bos primigenius)
<220>
<221〉gene
<222>(1)..(558)
〈223>
<220>
<221〉primer—bind
<222>(535).. (558)
<223>
〈220〉
<221>primer—bind
<222>(1)..(22)
<223>
〈400〉3
tatcccacttttta^ggagsgtgaaatgca cctgggcgtg tgaggacaga
gccgtccctgagctgctggcttcctctgac cttgtgctgt tttctccccc
taggctgctggttgtctacccctggactcagaggttcttt gagtcctttg gggacttgtc
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tcctcagtgttctccttcttctttttatggtcaagctcat gtcatgagga gaaagctg犯
tggcaggacacagttt3g犯gtattctggt tagattacta aggactcctc
agaaccgtttagactcttttaacctctttgttcacaacca gtatttcctc tgattcattc
ttgttctctgttgtctgc
60 120 180 219
60 120 180 240 300 360 420 480 540 558
8
權(quán)利要求
1、一種用于牛早期胚胎性別鑒定的分子生物學(xué)方法，其特征在于下列步驟(1)試樣的制備與保存從待檢牛胚胎中分離4個或4個以上的細(xì)胞，用無菌超純水沖洗3次后，放入0.5mL PCR管中，加入10μL無菌超純水，100℃煮沸10min～15min，立即置于碎冰中，冷卻后在8228×g，4℃下離心5min，取上清液保存于4℃冰箱中，備用；(2)巢式PCR反應(yīng)第一次PCR反應(yīng)以SRY1外引物和內(nèi)參照HBB引物擴(kuò)增，體系為20μL0.8mmol/L的dNTP、2U的Taq DNA聚合酶、0.2μmol/L的SRY基因外引物SRY1和內(nèi)參照引物HBB、10×PCR緩沖液、2.5mmol/L的MgCl2，加適量雙蒸水；反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，20個循環(huán)結(jié)束后，72℃再延伸10min，4℃保溫2min～10min；第二次PCR反應(yīng)，以SRY2外引物和內(nèi)參照HBB引物擴(kuò)增，取第1次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8μL，作為第2次擴(kuò)增模板，同時加入10×PCR緩沖液、2.5mmol/L的MgCl2、0.8mmol/L的dNTP1.6μL，2U的TaqDNA聚合酶、0.2μmol/L的SRY基因內(nèi)引物SRY2和內(nèi)參照引物HBB、適量的雙蒸水至20μL；反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，34個循環(huán)后，72℃再延伸10min，4℃保溫2min～10min；(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，1.0％～1.5％瓊脂糖凝膠電泳，所述的條件是3V/cm～5V/cm，電泳20min～30min，用溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)檢查，得到電泳圖譜；檢測電泳圖譜中是否同時出現(xiàn)558bp和219bp兩條帶；其中，步驟(2)所用的特異引物如下SRY1外引物正向5′CTACTCCCCAACCGTCAGAAC3′； 反向5′AGCCCAAACCCATCAACCTA3′；SRY2內(nèi)引物正向5′CCAGGGAACTGCTTGGGTA3′； 反向5′TGCTTCTCCACTTAGGCTCAA3′；HBB內(nèi)參照引物 正向5′TATCCCACTTACAAGGCAGGTT3′； 反向5′GCAGACAACAGAGAACAAGAATGA3′。
全文摘要
本發(fā)明屬于動物繁殖技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種牛早期胚胎的性別鑒定領(lǐng)域。其步驟是從待檢牛胚胎中分離出4個或4個以上的細(xì)胞，用無菌超純水沖洗后放入PCR管中，加入適量無菌超純水，煮沸，置于碎冰中，冷卻后在低溫下離心，取上清液液進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到電泳圖譜，觀察電泳圖譜中是否同時出現(xiàn)558bp和219bp兩條帶，從而判別所檢測的牛早期胚胎的性別。
文檔編號C12Q1/68GK101475989SQ200910060529
公開日2009年7月8日 申請日期2009年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月19日
發(fā)明者勇 余, 輝 劉, 劉文舉, 吳俊靜, 張淑君, 易建明, 翔 李, 楊利國, 胡修忠 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)