專利名稱：：水稻抗病相關(guān)基因OsEDR1和它在改良水稻抗病性中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物基丙工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及一個水稻抗病相關(guān)基因fls^A7的分離克隆、功能驗證和應(yīng)用。fl^"A7基因是水稻抗病反應(yīng)中的負調(diào)控因子。抑制化^"A7基因表達的轉(zhuǎn)基因植株的抗病能力顯著提高。
背景技術(shù)：
：植物在生長的過程中，受到多種病原物的侵害。植物病原物的種類繁多，包括病毒、細菌、真菌和線蟲等。病原物侵入植物導(dǎo)致兩種結(jié)果(1)病原體成功的在寄主植物內(nèi)繁殖，引起相關(guān)的病癥；(2)寄主植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)，殺死病原物或阻止其生長。利用抗性基因資源改良植物的抗病性，是預(yù)防病害同時又保護環(huán)境的根本出路。植物的抗病反應(yīng)是多基因參于調(diào)控的復(fù)雜過程。參于植物抗病反應(yīng)的基因分為兩類(1)抗病基因，又稱W(resistance)基因和(2)抗病相關(guān)基因。根據(jù)目前人們對抗病基因功能的認識，這類基因的產(chǎn)物主要是作為受體，直接或間接與病原蛋白相互作用，啟動植物體內(nèi)的抗病信號傳導(dǎo)路徑(Tang等，1996;Baker等，1997;Jia等，2000;Dangl和Jones，2001:Nimchuk等，2001)?？共』蚪閷?dǎo)的抗病反應(yīng)抗性強，是很好的基因資源。但由于下述原因，使利用抗病基因改良植物抗性受到限制(1)抗病基因的資源有限，如目前知道的抵抗水稻重要病害白葉枯病的抗病基因大約只有30個；(2)抗病基因具有病原種類和病原生理小種特異性，抗病范圍有限；(3)因為病原的快速突變，一個抗病基因的作用往往幾年或者十幾年后就喪失了。抗病相關(guān)基因是指除抗病基因外所有參于抗病反應(yīng)的基因，它們的編碼產(chǎn)物參于合成植物體內(nèi)抗病信號分子、參于信號傳導(dǎo)、阻止信號傳導(dǎo)或參于防衛(wèi)反應(yīng)等。這類基因的共同特點是病原誘導(dǎo)后它們的表達量升高或減少，因此人們可以根據(jù)病原誘導(dǎo)前后基因的表達量的差異大規(guī)模地鑒定植物抗病相關(guān)基因(Maleck等，2000;Schenk等，2000;Zhou等，2002)。目前，人們對抗病相關(guān)基因的認識有限。根據(jù)已有報道，絕大多數(shù)抗病相關(guān)基因單獨作用時的抗性能力可能比抗病基因小。但根據(jù)下述原因，它們是值得大力開發(fā)的基因資源(1)由于絕大多數(shù)抗病相關(guān)基因的產(chǎn)物不需要直接與病原物相互作用，這類基因是具有持久抗性的基因資源；(2)大多數(shù)抗病相關(guān)基因參于的抗病反應(yīng)沒有病原特異性，因此它們是具有廣譜抗性的基因資源；(3)這類基因的資源豐富。但是，水稻中雖然鑒定了很多抗病相關(guān)基因(Zhou等，2002;Chu等，2004)，這些基因在水稻抗病反應(yīng)中的作用機理、以及單個抗病相關(guān)基因是否會引起水稻抗病表型的改變都不清楚。水稻是世界上重要的糧食作物，但病害的影響常常造成其產(chǎn)量和品質(zhì)的下降。水稻白葉枯病由白葉枯病菌(Xa/^力ovzKwasorj^aepv.ory幼e)引起，是世界上對水稻危害最大的細菌性病害(過崇儉，1995)。另外，水稻細菌性條斑病(細條病)由細條病菌(^加力o/zo/2asorjzaepv.oz丁w'co7a)引起，也是水稻的重要病害。因此，了解病害的發(fā)病機制，有助于利用高效途徑改良水稻品種的抗性，控制病害的發(fā)生，減少或避免植物病害所帶來的損失。分離克隆抗病相關(guān)基因是對水稻抗病機理研究的前提.。同時，與抗病基因的應(yīng)用相比，抗病相關(guān)基因3的應(yīng)用能提供植物更為廣譜及長效的抗性。通過抑制作為抗病反應(yīng)負調(diào)控因子的抗病相關(guān)基因的功能進行水稻品種的改良，將進一步增強植物的抗病性，柘寬植物的抗譜。這些方面是采用常規(guī)植物育種和改良技術(shù)所不能達到的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是分離克隆水稻中攜帶的一個抗病相關(guān)基因完整DNA片段，并利用RNA干擾技術(shù)(RNAinterference,RNAi)和水稻T-DNA插入沉默技術(shù)通過使目標基因沉默鑒定該基因在抗病反應(yīng)過程中所起作用，為利用這個基因改良水稻品種或其它植物抵御病害的能力奠定基礎(chǔ)。該基因被命名為fe^W7(gnhanced旦iseaseResistance1)。本發(fā)明涉及分離一種包含基因的DNA片段并鑒定其功能，該片段賦予植物對由白葉枯病菌(Ja/7tA。/。/7aso/xzaepv.oryzae)和細條病菌(^fe/7t力。fl7。朋s。r/zaepv.o/m'co/a)所弓l起的病害產(chǎn)生抗病反應(yīng)。其中，所述片段如序列表SEQIDN0:l所示，或者基本上相當于SEQIDNO:1所示的DNA序列，或者其功能相當于SEQIDNO:1所示序列的亞片段。對其序列進行分析表明它編碼一種絲裂原激活蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activatedproteinkinasekinasekinase,MAPKKKL抑制序歹ij表SEQIDNO:1所示序列的表達可以增強水稻對白葉枯病和細條病的抗性?？梢圆捎靡呀?jīng)克隆的ftSW/基因作探針，從cDNA和基因組文庫中篩選到本發(fā)明的基因或同源基因。同樣，采用PCR技術(shù)，也可以從基因組、mRNA和cDNA中擴增得到本發(fā)明的fla5ZM7基因以及任何感興趣的一段DNA或與其同源的一段DNA。采用以上技術(shù)，可以分離得到包含&￡/7基因的序列或者包含一段fe￡ZM7基因的序列，將這一序列與合適的載體連接，可以轉(zhuǎn)入植物細胞抑制其自身的ft^/M7基因的表達，產(chǎn)生抗病轉(zhuǎn)基因植物。采用這種轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)造抗病植物是傳統(tǒng)育種技術(shù)所不能達到的。本發(fā)明為增強水稻對白葉枯病菌的抗性提供了一種新的方法。這種方法包括將fl^ZWJ基因的部分片段和與能夠表達雙鏈RNA(doublestrandRNA,dsRNA)的載體連接、轉(zhuǎn)入水稻，通過抑制其自身0s^M7基因的表達改良水稻對白葉枯病的抗性。在本發(fā)明的實施例部分，申請人闡述了fo^W/基因的分離、功能驗證和應(yīng)用過程以及該基因的特點。序列表SEQIDNO:l是fl^HW基因的核苷酸序列和它編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。圖1.本發(fā)明鑒定和分離克隆水稻抗病相關(guān)基因OsfZWi以及驗證6tsfZW/基因功能的流程圖。圖2.用定量反轉(zhuǎn)錄一PCR(quantitativereversetranscription-PCR,qRT-PCR)技術(shù)檢測感病水稻品種中花11和抗病水稻家系MKbFZHl接白葉枯病菌菌株P(guān)X061后ftsSW7基因的表達模式。水稻樣品來源于沒有任何處理的對照材料和接種PX0614、12、24、48、72小時后的材料。圖3.是fefZA7基因的結(jié)構(gòu)。無黑框的數(shù)字表示基因各個結(jié)構(gòu)的核苷酸數(shù)目；有黑框的數(shù)字表示與粳稻日本晴中的&￡^基因比較，本發(fā)明中粳稻中花11中的&￡/7基因的核苷酸替換位點和替換類型(如3310位的"A"在中花11中突變?yōu)?G";5325位的"C"在中花11中突變?yōu)?A";6308位的"C"在中花11中突變?yōu)?G"。核苷酸的替換位點編號是序列表SEQIDNO:1中的序列位點編號，其中翻譯起始密碼的"A"記為1)。"ATG"和"TGA"分別是翻譯起始密碼和終止密碼。短箭頭示用PCR擴增Os^!W基因編碼區(qū)的引物位置。圖4.pDS1301載體攜帶表達fe^M7雙鏈RNA片段(545bp),即克隆D120R。RB和LB代表pDS1301載體(Cao等，2007;Yuan等，2007)上的T-DNA右和左邊界；GTO"代表pDS1301載體上的p—葡萄糖苷酸酶基因(標記基因)；Hpt代表pDS1301載體上的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(篩選基因)。35S代表pDS1301載體上的花椰菜花葉病毒啟動子；Adhl代表pDS1301載體上的玉米乙醇脫氫酶基因內(nèi)含子I:OCS代表4pDS1301載體上的章魚堿合成酸基因終止子Waxy-a代表PDS1301載體上的水稻W(wǎng)axy基因內(nèi)含子。圖5.T。代遺傳轉(zhuǎn)化植株(D120RZ1)中的0aHM7基因表達量降低與植株對白葉枯病菌株P(guān)X061的抗性增強相關(guān)。對照為水稻品種中花ii(遺傳轉(zhuǎn)化的受體)。遺傳轉(zhuǎn)化植株中a^zw/基因的表達量是相對于對照中花11中ft^M7基因的表達量。星號(*)表示與對照相比，轉(zhuǎn)基因植株的病斑面積顯著(尸<0.01)減小。圖6.fefi9V/基因T-DNA插入突變體04Z11MP37中T-DNA插入位點(A)和突變體驗證分析(B)。圖中橫線條代表feiS/W基因的內(nèi)含子、黑色橫柱條表示外顯子的編碼序列。數(shù)字表示T-DNA插入位點前核苷酸位點(按序列表SEQIDNO:l.所示序列編號)。"ATG"和"TAG"分別是翻譯起始密碼和終止密碼。箭頭1F、1R、LBT2分別表示用來驗證突變體是否正確的PCR引物；其中1F和1R引物是根據(jù)0^ZM7基因序列設(shè)計，分別位于T-DNA插入位點兩側(cè)；LBT2是根據(jù)T-DNA內(nèi)部序列設(shè)計的引物。圖6B中的水(對照)表示樣品中的模板DNA用水替代。圖7.L代T-DNA插入突變體植株(04Z11MP37)中的fls^Z%7基因表達減少或消失與植株對白葉枯病菌株P(guān)X061的抗性增強相關(guān)。對照為水稻品種中花11(遺傳轉(zhuǎn)化的受體)。突變體植株中0^M7基因的表達量是相對于對照中花11中ft^M7基因的表達量。星號(*)表示與對照相比，轉(zhuǎn)基因植株的病斑面積顯著(尸<0.01)減小。圖8.sfii7基因的T-DM插入突變體04Z11MP37對水稻細條病菌KH3、JSB2-24、HBN8-47的侵染產(chǎn)生快速的超敏反應(yīng)。圖中箭頭所指為滲透接種細條病菌的位點，剩余斑點為葉片自發(fā)產(chǎn)生的類病斑(lesionmimic)。具體實施例方式以下實施例中進一步定義本發(fā)明，圖i描敘了鑒定和分離克隆a^M7基因以及驗證fts^zw/基因功能的流程。根據(jù)以上的描述和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。實施例一to^ZVW基因在不同水稻品種中的表達模式分析擬南芥的基因參與調(diào)控擬南芥的抗病反應(yīng)，該基因編碼一個絲裂原激活蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activatedproteinki旭sekinasekinase,MAPKKK)(Frye等，2001)。為了分析7jC稻中的J^Z!W同源基因是否也參與抗病反應(yīng)的調(diào)控，申請人采用BLAST分析方法(Altschul等，1997),利用基因的序列檢索水稻全基因組序列數(shù)據(jù)庫[TIGR(TheInstituteforGenomicResearch,h歐〃rice.tigr.org)，發(fā)現(xiàn)在水稻基因組中編號位點為LOC_Os03g06410的基因是的同源基因；該基因編碼蛋白的氨基酸序列與AtEDRl蛋白序列有46.5%—致性(identity),其預(yù)測的激酶區(qū)與AtE加l的激酶區(qū)有80%的氨基酸一致性。L0C—0s03g06410所代表的基因在水稻基因組中是單拷貝。因此，申請人將位點為L0CJ)s03g06410的基因命名為flsfZiW。為了證實&￡/基因是否參于抗病反應(yīng)的調(diào)控，申請人采用定量反轉(zhuǎn)錄一PCR(quantitativereversetranscription-PCR,qRT-PCR)技術(shù)(Qiu等，2007)分析了flafiM7基因在不同水稻品種中接種白葉枯病菌株P(guān)X061(菲律賓生理小種l,見Sun等文獻，2004)后的表達模式。白葉枯病菌接種采用常規(guī)報道的或教科書介紹的剪葉法對成株期的水稻植株進行接種(見Sim等，2004)。白葉枯病菌菌株P(guān)X061由菲律賓國際水稻研究所惠贈(Sun等，2004)。白葉枯病菌的培養(yǎng)遵循已經(jīng)公開發(fā)表的方法(Sun等，2004)。接種后分不同時間點取接種葉片抽提總RNA(Zhou等，2002)。取1-5pg總RNA用DNasel(美國Invitrogen公司)處理15分鐘以去除基因組DNA污染，然后參照Zhou等(Zhou等，2002)的方法，使用oli'go(dT)155寡聚引物和M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(美國Promega公司)進行反轉(zhuǎn)錄。采用實時定量PCR分析試劑盒SYBRGreenPCRMasterMix(寶生物工程(大連)有限公司)，并根據(jù)試劑盒使用說明書，在ABI7500Real-TimePCRsystem(美國A卯liedBiosystems公司)儀器上進行實時定量PCR反應(yīng)。用水稻內(nèi)源肌動蛋白(actin)基因的表達量衡量、并均一化樣品RNA含量(Qiu等，2007)。qRT-PCR分析中的fls￡ZW2基因特異PCR引物是EDR1F2(5'-MGCGGCTCGATATTCCCMG-3')和EDR1R2(5'-GGMTGCCCCTCMCATCMG-3')，肌動蛋白基因PCR引物是水稻內(nèi)源肌動蛋白(actin)F(5'-TCCTATGTACGTCGCCATCCAG-3')和actinR(5,-MTGAGTMCCACGCTCCGTCA-3')。實驗結(jié)果顯示接種白葉枯病菌PX061后誘導(dǎo)Gft6M7基因在中等感病粳稻品種中花11(&了za幼z^Vassp./a/w/2ica,—個公開使用的水稻品種)和抗病轉(zhuǎn)基因株系MKbFZHl(見Cao等，2007,該轉(zhuǎn)基因株系有中花ll背景)中表達(圖2)。MKbFZHl攜帶抗白葉枯病主效基因^/fei^(Cao等，2007)。在沒有白葉枯病菌侵染時，&￡M7基因在抗病水稻MKbFZHl中的表達量顯著低于在感病水稻中花11中的表達量(圖2)。接種PX061后雖然都誘導(dǎo)tts^M7基因在MKbFZHl和中花11中表達，但在MKbFZHl中該基因的總體表達水平仍顯著低于感病水稻中花11(圖2)。這些結(jié)果提示0if/M7基因可能作為抗病反應(yīng)的負調(diào)控基因參于抗白葉枯病反應(yīng)的調(diào)控。實施例二確定水稻品種中花l1中的tt^Z^7基因的序列和結(jié)構(gòu)1.水稻品種中花11中的化必ZM7基因的序列水稻全基因組序列數(shù)據(jù)庫的LOC一Os03g06410位點信息中包含有6t^M7基因的cDNA序列[GenBank(http:〃兩.ncbi.nlm.nih.gov)注冊號:AK1U595]，該cDNA序列長3645bp。7jC稻全基因組序列數(shù)據(jù)庫中的水稻序列來自于粳稻品種日本晴(&yzasa"rassp./apo"ics)，cDNA序列AK111595也來自于日本晴。申請人根據(jù)水稻品種日本晴中的基因編碼區(qū)兩側(cè)的序列設(shè)計了一對PCR引物EDR1F3(5'-ATGGTACCGTTGACGAGATGMGAATCT-3')(下劃線代表用于載體連接的接頭中的Aiwl限制性內(nèi)切酶消化位點)和EDR1R3(5'-TMGGTACCAC織CTTMCAGCAACMTCATCA-3')(下劃線代表用于載體連接的接頭中的i^/I限制性內(nèi)切酶消化位點)(圖3)。利用這對PCR引物從粳稻品種中花11中擴增包含OsiZW/基因的DNA片段(圖3)。利用PCR引物EDR1F3、EDR1R3和位于基因內(nèi)部的PCR引物EDR1F1(5'-TMCTAGTGGTACCGAAGATGACTTCTAC-3')、EDR1R1(5'-TAGAGCTCGGATCCAGCACCCATGAAGAG-3')、EDR1F13(5'-ATTGGATCCCTTGTGATTGGTGAAA-3')'EDR1F15(5'-GAGTAATTATACTGGTGATGA-3')和EDR1R15(5'-TCATCACCAGTATAATTACTC-3'),以及美國AppliedBiosystems公司的測序試劑盒，以雙脫氧核苷酸末端終止法(美國AppliedBiosystems公司)分別從PCR擴增片段兩端測序。序列拼接后得到一長6401bp的咖A序列，它包含完整的基因的編碼序列(圖3)。.2.水稻品種中花11中的fl^HW基因結(jié)構(gòu)分析與水稻品種日本晴中的&￡17基因序列比較，水稻品種中花11中的fe^HW序列有3個核苷酸的替換，它們分別位于第4、7、13外顯子的內(nèi)部(圖3);位于第7外顯子的核苷酸替換造成一個編碼氨基酸的差異(由日本晴OsEDRl蛋白中的脯氨酸變?yōu)橹谢?1OsEDRl蛋白中的丙氨酸)，位于第13外顯子的核苷酸替換也造成一個編碼氨基酸的差異(由日本晴OsEDRl蛋白中的脯氨酸變?yōu)橹谢?1OsEDRl蛋白中的組氨酸)。因此，兩個水稻品種中同一個基因序列的高度相似性，申請人可以利用日本晴中ftrSM7基因的cDNA序列確定中花11中的fls^aw基因的結(jié)構(gòu)。比較分析中花11中的0sf/M7基因的基因組序列和日本晴中的flsf"W基因的cDNA序列，確定中花ll中的flsfiHW基因包含十三個外顯子和十二個內(nèi)含子。^一個外顯子由445個核苷酸組成'(位于序列表SEQIDNO:1的1—445bp處)，第一個內(nèi)含子由811個核苷酸組成(位于序列表SEQIDNO:1的446—1256bp處)，第二個外顯子由422個核苷酸組成(位于序列表SEQIDNO:1的1257—1678bp處)，第二個內(nèi)含子由465個核苷酸組成(位于序列表SEQIDNO:1的1679—2143bp處)，第三個外顯子由IOI個核苷酸組成(位于序列表SEQIDNO:1的2144—2244bp處)，第三個內(nèi)含子由642個核苷酸組成(位于序列表SEQIDNO:1的2245—2886bp處)，第四個外顯子由1264個核苷酸組成(位于序列表SEQIDNO:1的2887—4150bp處)，第四個內(nèi)含子由185個核苷酸組成(位于序列表SEQIDNO:l的4151—4335bp處)，第五個外顯子由40個核苷酸組成(位于序列表SEQIDNO:1的4336—4375bp處)，第五個內(nèi)含子由111個核苷酸組成(位于序列表SEQIDNO:1的4376—4486bp處)，第六個外顯子由70個核苷酸組成(位于序列表SEQIDNO:l的4487—4556bp處)，第六個內(nèi)含子由129個核苷酸組成(位于序列表SEQIDNO:1的4557—4685bp處)，第七個外顯子由100個核苷酸組成(位于序列表SEQIDNO:1的4686—4785bp處)，第七個內(nèi)含子由337個核苷酸組成(位于序列表SEQIDNO:1的4786—5122bp處)，第八個外顯子由79個核苷酸組成(位于序列表SEQIDNO:1的5123—5201bp處)，第八個內(nèi)含子由78個核苷酸組成(位于序列表SEQIDNO:1的5202—5279bp處)，第九個外顯子由100個核苷酸組成(位于序列表SEQIDNO:1的5280—5379bp處)，第九個內(nèi)含子由88個核苷酸組成(位于序列表SEQIDNO:1的5380—5467bp處)，第十個外顯子由67個核苷酸組成(位于序列表SEQIDNO:l的5468—5534bp處)，第十個內(nèi)含子由92個核苷酸組成(位于序列表SEQIDNO:1的5535—5626bp處)，第H^—個外顯子由52個核苷酸組成(位于序列表SEQIDNO:1的5627—5678bp處)，第十一個內(nèi)含子由243個核苷酸組成(位于序列表SEQIDNO:1的5679—5921bp處)，第十二個外顯子由176個核苷酸組成(位于序列表SEQIDNO:1的5922—6097bp處)，第十二個內(nèi)含子由108個核苷酸組成(位于序列表SEQIDNO:l的6098—6205bp處)，第十三個外顯子由138個核苷酸組成(位于序列表SEQIDNO:l的6206—6343bp處)。下文中涉及的0s^M7基因均來自水稻品種中花11。3.ft5ZM7基因編碼產(chǎn)物的分析OsfZW/基因的編碼區(qū)由3051個核苷酸組成，編碼一個長度為1017個氨基酸的蛋白質(zhì)。根據(jù)Ichimura等(2002)的絲裂原激活蛋白激酶蛋白質(zhì)家族的分類，OsEDRl蛋白屬于典型的該家族中的MAPKKK蛋白。利用己有的生物信息學工具InterProScan(http:〃雨.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/)和ExPASy(http:〃ww,expasy.ch/orosite/)進行分析，發(fā)現(xiàn)它屬于MAPKKK蛋白中的第二亞類，具有一個保守的激酶結(jié)構(gòu)域(IVHRDLKSPNLLVDN)和一個熱激蛋白70結(jié)構(gòu)域。實施例三fl^HW基因的功能驗證1.遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建本發(fā)明采用RNA干擾(RNAinterference,RNAi)技術(shù)、通過抑制水稻品種中花11中ft5Z^7基因的表達，驗證該基因的功能。這個技術(shù)途徑的主要機理將目標基因的部分片段以反向重復(fù)的形式與能夠表達雙鏈RNA(doublestrandRNA，dsRNA)的載體連接，通過遺傳轉(zhuǎn)化將該載體導(dǎo)入植物中。獲得的轉(zhuǎn)化植株大量表達與目標基因部分片段同源的dsRNA。這些dsRNA迅速形成短干擾RNA(shortinterferingRNA,siRNA、這些siRNA與目標基因的轉(zhuǎn)錄子(inRNA)互補配對，在細胞內(nèi)特殊酶的作用下使目標基因的轉(zhuǎn)錄子降解，從而在mRM水平上抑制目標基因的功能。研究者可以通過轉(zhuǎn)基因植株表型的改變，驗證目標基因的功能。RNA干擾技術(shù)己被廣泛用于基因功能的驗證(Smith等，2000;McGinnis等，2005)。本發(fā)明中用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的載體是pDS1301，它是常用的水稻遺傳轉(zhuǎn)化RMi載體(Cao等，2007;Yuan等，2007)。該載體攜帶具有組成型表達的花椰菜花葉病毒啟動子，能夠組成性抑制目標基因的表達(圖4)。申請人首先采用上述方法從水稻品種中花11中抽取總RNA和通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。用PCR引物EDR1F1(5'-TAACTAGTGGTACCGATTGGGMGGTTC-3')(下劃線代表用于載體連接的接頭中的《/wl限制性內(nèi)切酶消化位點)和EDR1R1(5'-TAGAGCTCGGATCCAGCACCCATGMGAG-3')(下劃線代表用于載體連接的接頭中的5aclfeffiHI限制性內(nèi)切酶消化位點)以中花11的cDNA為模板，擴增得到一個545bp(位于序列表SEQIDN0:l的3769—4150、4336—4375、4487—4556、4686—4738bp處)的cDNA片段。用限制性內(nèi)切酶和分別消化酶切該cDNA片段、加入了和A"pnl酶切位點的中間載體pGENKi(美國Promega公司)和遺傳轉(zhuǎn)化載體pDS1301,酶切完全后在65"C水浴10min滅活限制性內(nèi)切酶。將酶切片段在0.8%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收目的條帶。用T4-DNA連接酶將的cDNA片段分別與中間載體pGEM-G和遺傳轉(zhuǎn)化載體pDS1301進行連接。將連接好的載體利用電轉(zhuǎn)化的方法(Wilson和Gough，1988)轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株DH10B(Sun等，2004)。所用電轉(zhuǎn)化儀為Electroporator2510(德國印pendorf公司)，操作參照Electr叩orator2510工作手冊進行，轉(zhuǎn)化的電壓為1800V，電容為10pF，2500V脈沖放電，時間參數(shù)為5毫秒/樣品。通過5』I和A"/ml酶切篩選外源片段正向插入的陽性克隆。用5"acl和&el酶切攜帶的cDNA片段的pGEM-G載體質(zhì)粒和已經(jīng)連入第一鏈的cDNA片段的pDS1301載體質(zhì)粒。酶切完全后在65'C水浴10min滅活限制性內(nèi)切酶。用TrDNA連接酶將6te￡Z7的cDNA片段連接到攜帶fls卻A7的cDNA片段的pDS1301質(zhì)粒的5acl/5^el酶切位點。用上述電轉(zhuǎn)化方法將連接好的載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株DH10B，通過feci和Spel雙酶切反應(yīng)篩選陽性克隆，陽性克隆命名為D固(圖4)。2.遺傳轉(zhuǎn)化和T。代遺傳轉(zhuǎn)化植株分析采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Lin和Zhang，2005)將D120R陽性克隆導(dǎo)入水稻感病品種中花11。獲得的遺傳轉(zhuǎn)化植株被命名為D120RZ1(其中前面部分為遺傳轉(zhuǎn)化載體名稱，Zl代表水稻品種中花11)。本發(fā)明共獲得獨立轉(zhuǎn)化植株15株。采用上述接種方法對全部轉(zhuǎn)化植株在成株期階段接種白葉枯病菌株P(guān)X061(Sun等，2004)，與對照中花11及遺傳轉(zhuǎn)化陰性植株相比，所有的陽性遺傳轉(zhuǎn)化植株的抗性顯著增強(戶<0.01),其病斑面積減小了大約96%至98%(表l)。表1.T。代遺傳轉(zhuǎn)化植株(D120RZ1-)對白葉枯病菌株P(guān)X061的反應(yīng)水稻材料病斑面積(％)(1)尸值<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>D120RZ1-13"'51.2±5.50.1800D120RZ1—14(2)51.3±100.1887D120RZ1—151.8±0.70.0001D120RZ1-19_1,8±0.6_0.0001(1)每株轉(zhuǎn)化基因植株接種3—5片葉，14天后調(diào)查病斑和病葉長度，每個數(shù)據(jù)來自于多個葉片的平均值。(2'陰性轉(zhuǎn)化植株，其它植株為陽性轉(zhuǎn)化植株。為進一步驗證轉(zhuǎn)化植株的抗病能力增強是否與fe^W/基因表達量相關(guān)，申請人采用上述定量RT-PCR方法檢測了這15株T。代轉(zhuǎn)化植株中fl^ZW/基因的相對表達量。實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化植株中&￡/7基因的表達量變化與植株的表型變化密切相關(guān)(圖5)?？共⌒栽鰪姷霓D(zhuǎn)化植株中0^ZW7基因的表達量與對照材料中花11相比顯著減少。而抗病表型無明顯變化的陰性轉(zhuǎn)化植株中0^ZM7基因表達量與中花11相比無明顯降低。該結(jié)果說明遺傳轉(zhuǎn)化植株對白葉枯病菌的抗性增強是因為ft^M7基因的表達量降低；fts^MV基因的編碼產(chǎn)物在水稻抗白葉枯病反應(yīng)中發(fā)揮負調(diào)控因子的作用；抑制水稻中fts^ZM7基因的表達，可增強水稻對白葉枯病的抗性。3.篩選水稻突變體庫和突變體植株抗性分析為進一步驗證ft^H//基因在水稻抗病反應(yīng)中的作用，申請人利用fe^HW基因的序列檢索水稻T-DM插入突變體數(shù)據(jù)庫RMD(Zhang等，2006)，發(fā)現(xiàn)該數(shù)據(jù)庫中的突變體04Z11MP37具有354bp的側(cè)翼序列(序列表SEQIDNO:1中的3464—3817bp)與(9sfi!^/基因同源。提示T-DNA插入在(9siSC^基因內(nèi)部。序列比較分析提示T-DNA插入在序列表SEQIDNO:1所示序列的3817bp后，即T-DNA插入在fl^ZA7基因的第4個外顯子內(nèi)(圖6A)。為了驗證所獲得突變體的正確性，申請人根據(jù)tt^ZA7基因的序列設(shè)計了一對位于T-DNA插/位點兩側(cè)的PCR引物(圖6A):IF(5'-CCATCAACTTATTTGCCGACC-3')和1R(5'-GTCGACGCATMTCCGCAC-3')。另外，根據(jù)T-DNA序列設(shè)計了PCR引物LBT2(5'-ATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCAT-3')(Wu等，2003)。利用這3條PCR引物分析所獲得突變體的T-DNA是否插入在fef/W/基因的內(nèi)部。這一分析的基本原理是在04Z11MP37的純合突變體(一對同源染色體中都有T-DNA的插入)植株中，由于插入的T-DNA片段大約14kb(Wu等，2003),利用引物1F和1R、采用常規(guī)PCR方法無法擴增如此大的DNA片段，而用引物1F和LBT2—段大小己知的水稻基因組和T-DNA的雜合DNA片段；在04Z11MP37的雜合突變體(一對同源染色體中只有一條染色體中有T-DNA插入)植株中，用引物1F和引物1R可以擴增一段大小已知的水稻基因組的DNA片段，用引物1F和LBT2也可以擴增一段大小已知的水稻基因組和T-DNA的雜合DNA片段；在04》11MP37的陰性(家系中分離出的沒有T-DNA插入的)植株中，用引物1F和1R可以擴增一段大小已知的水稻基因組DNA片段，但是用引物1F和LBT2不能夠擴增DNA片段。申請人對15株04Z11MP37家系的L植株進行了上述PCR分析。結(jié)果顯示其中4株是純合突變體，4株是陰性植株，7株是雜合突變體(圖6B)。這些結(jié)果說明申請人獲得的水稻材料04Z11MP37是Os"M7基因突變體。04Z11MP37突變體具有粳稻品種中花11的遺傳背景(Wu等，2003)。對上述15株04Z11MP37家系的T,植株接種白葉枯病菌株P(guān)X061,與遺傳轉(zhuǎn)化受體中花ll以及遺傳轉(zhuǎn)化陰性植株相比，所有的陽性遺傳轉(zhuǎn)化植株的抗性顯著增強(,<0.01),其病斑面積減小了大約93%至97%((表2)。表2.04Z11MP37株系接種白葉枯病菌PX061后的病斑面積水稻材料病斑面積(％)">.f904Z11MP37-12,6±0.60.000104Z11MP37-23.0±1.40.000104Z11MP37-32.2±1.20.000104Z11MP37-42.2±0.60.000104Z11MP37-5(2)49.7±8.80.211004Z11MP37-62.1±0.60.000104Zl鵬7-71.80.50.000104Z11MP37-81.5±0.60.000104ZllMP37-9。)51.1±3.90.186504Z11MP37-101.7±0.60.000104Z11MP37-111.6±0.70.000104Z11MP37-12(2>58.2±4.80.139204Z11MP37-131.8±0.60,000104Z11MP37-144.0±0.40.000104Z11MP37-15(2)54.2±2.40.4629中花ll(對照)53.9±4.3(1)每株轉(zhuǎn)化基因植株接種3—5片葉，14天后調(diào)査病斑和病葉長度，每個數(shù)據(jù)來自于多個葉片的平均值。(2>陰性轉(zhuǎn)化植株，其它植株為陽性轉(zhuǎn)化植株。為進一步驗證突變體植株的抗病能力增強是否與fl^aw基因表達量相關(guān)，申請人采用上述定量RT-PCR方法檢測了這15株植株中fls^HW基因的相對表達量。實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化植株中fls^ZW/基因的表達量變化與植株的表型變化密切相關(guān)(圖7)?？共⌒栽鰪姷闹仓曛谢虻谋磉_與對照中花11相比顯著減少或消失。而抗病表型無明顯變化的陰性轉(zhuǎn)化植株中&￡^7基因表達量與中花11相比無明顯變化(圖7)。該結(jié)果進一步說明ft必ZM7基因的編碼產(chǎn)物在水稻抗白葉枯病反應(yīng)發(fā)揮負調(diào)控因子的作用。抑制水稻中tt^HW基因的表達，可增強水稻對白葉枯病的抗性。實施例四抑制to^W/基因的植株對細條病的抗性顯著增強申請人對純合的G^ZW/基因T-DM插入突變體的T2家系(04Z11MP37-3)和具有同樣遺傳背景的對照水稻品種中花11在孕穗期接種細條病菌JSB2-24、RH3、HNB8-47(Lai等，2004;Chen等，2006)。申請人采用滲透法和針剁法兩種方法接種細條病菌(Chen等，2006)。采用滲透法接種10天后發(fā)現(xiàn)水稻品種中花11對這三個菌株均不產(chǎn)生超敏反應(yīng)(hypersensitiveresponse),而04Z11MP37-3植株產(chǎn)生明顯超敏反應(yīng)(圖8)，提示抑制&^ZW/基因也使水稻增強對細條病的抗性。申請人進一步采用針刺法接種細條病菌，定量檢測突變體植株的抗性程度。接種14天后檢測發(fā)病情況(Chen等，2006),發(fā)現(xiàn)與感病對照中花11相比，具有同樣遺傳背景的04Z11MP37-3植株對細條病菌JSB2-24、RH3、HNB8-47的抗性顯著增強(尸<0.01)，其病斑長度減短了大約48%至67%(表3)。表3.04Z11MP37株系接種不同細條病菌后的病斑長度<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>transcriptomeofArahidopsisthalianaduringsystemicacquiredresistance.Nat.Genet.26:403-410McGinnisK，ChandlerV，ConeK，Ka卿lerH，Ka印plerS，KerschenA，PikaardC，RichardsE，SidorenkoL，SmithT，SpringerN，WulanT(2005)Transgene-inducedRNAinterferenceasatoolforplantfunctionalgenomics.MethodsEnzymol.392:1—24NimchukZ，RohmerL，Chang瓜Detngl幾(2001)Knowingthedancerfromthedance:R-geneproductsandtheirinteractionswithotherproteinsfromhostandpathogen.Curr.Opin.PlantBiol.4:288-294QiuD，XiaoJ，DingX，XiongM，CaiM，CaoY，LiX，XuC，WangS(2007)0sWRKY13mediatesricediseaseresistancebyregulatingdefense-relatedgenesinsalicylate-andjasmcmeLte-dependentsignaling.Mol.PlantMicrobeInteract.20:492-499SchenkPM，KazanK，WilsonI，AndersonJP，RichmondT，SomervilleSC，MannersJM(2000)CoordinatedplantdefenseresponsesinArabidopsisrevealedbymicroarrayanalysis.Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:11655-11660SmithNA，SinghSP，WangMB,StoutjesdijkPA，GreenAG,WaterhousePM(2000)Geneexpression-Totalsilencingbyintron-splicedhairpinRNAs.Nature407:319-320SunX，CaoY,YangZ，XuC,LiX，WangS，ZhangQ(2004)i^鄰ageneconferringresistancetoXanthomormsoryzaepv.oryzaeinrice，encodingaLRRreceptorkinase—likeprotein.PlantJ.37:517-527.T犯gXY，F(xiàn)rederickRD，ZhouJM，HalterraanM，J"iaYL，MartinGB(1996)InitiationofplantdiseaseresistancebyphysicalinteractionofAvrPtoandPtokinase.Science274:2060—2063WilsonTA，GoughNM(1988)HighvoltageE.colielectro-transformationwithDMfollowingligation.Nucl.AcidsRes.16:11820WuC，LiX，YuanW，ChenG，KilianA，LiJ，XuC，LiX，ZhouDX，WangS，ZhangQ(2003)Developmentofenhancertr即linesforfunctionalanalysisofthericegenome.PlantJ.35:418-427YuanB，ShenX，LiX，XuC，WangS(2007)Mitogen-activatedproteinkinase0sMPK6negativelyregulatesricediseaseresistancetobacterialpathogens.Planta226:953-960ZhangJ，LiC，WuC，XiongL，ChenG，ZhangQ，WangS(2006).RMD:arice腿tantdatabaseforfunctionalanalysisofthericegenome,Nucl.AcidsRes.34:745—748ZhouB，.PengKM,Chu2H，WangSP，ZhangQF(2002)Thedefense-responsivegenesshowingenhancedandrepressedexpressionafterpathogeninfectioninrice((2ry幼sWraL.).ScienceinChinaSeriesC-LifeSciences45:449-46712序列表<110〉華中農(nóng)業(yè)大學<120〉水稻抗病相關(guān)基因0sEDRl和它在改良水稻抗病性中的應(yīng)用〈130〉〈141〉2009-03-22<160〉2<170〉Patentlnversion3.3<210〉1<211〉6343<212〉DNA<213〉水稻(Oryzasativa)<220〉<221〉gene<222〉(1)..(6343)<220〉<221>CDS<222>(1)..(445)<220〉<221〉Intron<222〉(446)..(1256)<220><221>CDS<222〉(1257)..(1678)<220〉<221>Intron<222〉(1679)..(2143)〈220〉<221>CDS<222>(2144)..(2244)<220:><221〉Intron<222〉(2245)..(2886)<220><221>CDS<222〉(2887).(4150)<220><221>Intron<222>(4151):.(4335)<220><221〉CDS<222〉(4336).(4375)<220>〈221>Intron<222>(4376).(4486)<220>〈221〉CDS<222>(4487).(4556)<220><221>Intron<222>(4557)..(4685)<220><221>CDS<222>(4686)..(4785)<220〉〈221〉Intron<222>(4786)..(5122)<220><221>CDS<222>(5123)..(5201)<220><221>Intron〈222〉(5202)..(5279)〈220〉〈221>CDS<222>(5280)..(5379)〈220〉<221〉Intron<222〉(5380)..(5467)<220>〈221>CDS<222>(5468)..(5534)<220><221>Int織<222〉(5535)..(5626)<220>〈221〉CDS<222>(5627)..(5678)<220〉<221><222〉<220><221〉<222><220><221〉<222><220><221><222><400〉atgaagMetLys1g3CCCCAspProccgccgProProctatecLeuSer50CCg3CgProThr65ggtggg6lyGlygCg3tgAlaMetggggsgGlyGlucgcttcArgPheIntron(5679)CDS(5922).Intron(6098).CDS(6206)1aatAsn(5921).(6097)(6205)(6340)gcgAlategSer35gtgValgggGlygagGlugcgAlacagGin115gecAlactgLeutegSer20ccaProtegSergetAlagatAspctgLeu100ateliegecAlattcPhe5tegSertegSeracgThrgetAlatacTyr85tegSerArggtcVal犯gLysGinccgProgtaValgcgAla70atgMetgcgAla幼gLyseggArgagtSergggGlygcgAlategSer55gcgAlattgLeutecSergecAlaAsp33g3tCLyslieC3gGinSer40tegSergggGlytegSer肪cAsnLys120AspgggGly25tecSertegSergcgAlagsgGluageSer105ctgLeugsgGlusagLys10cagGintggTrpgggGlyC3gGinctgLeucaceggHisArgccgteggggProSerGlytecSerggaGlygagGlu9QgagGlucctProtecSer60gggGlyggtGly75gagttcGluPhetgcgtgCysValata3gcetclieSerLeuc犯3CCgcgGinThrAhccgProgggGly45gecAlaggtGlyGinggcGlyggcGly125AspcagGin30ccgProgecAlagggGlyatgMetgacAsp110鄉(xiāng)ArggcgAlategSer15C3gGin33CAsnThrcctgcgProAlagcgacgAlaThrGlyC8gGin95ctgLeuggcGlyetcLeuacgThr80ctgLeugacAspgacAsptecSer489614419224028833638443215130135140cgccgctacegggtgagtcgecatgaccaaggattcgattcgagatggattat485ArgArgTyrArg145ctatgcaaccgtgtgactaggtttgcattg545gtagacttsttgcggggg肌ggsttgttttac3tgt城gattaccagtt605tccatgctaccattgttctcgtcgaattcaatggattggatagtagcttc665cgtggctatgtctagaccatgtaaatgtgaatcttcaccttgg肌tgg犯aatcacacat725agggctcctatctagcatct3C3tgt3ttCattcctgtgg785cctcctttggtctcttccaggttcccggtgatcaacccattaaaacaatt845tgccatgtttttgctggtgcattgegatag905atcagagtcttgcattggatEittgcccagg犯"t犯aggactattgtttctgtggscggcg965gggaagt卿tgatattaca鄉(xiāng)cagcgagattttctagactgg鄉(xiāng)ttcttttgcgggc1025aattgtagctttgtagcttgttggttacatcaatctatgtcttttacatgttgggttgat1085tccattctgttacttagtgagtgatatttceLtatttgtagatattttgettggtagatca1145cttttttccttccatgatgtgtcaatt犯gctcaaacatggggatg由agtatatttgc1205ttgctggattgtctgacattctatcactgtgcttctattctgactttcaggact￡LCAspTyr1261150aactttcttgattaccatgagaaagttattgatggcttctatgacatt1309AsnPheLeuAspTyrHisGluLysVallieAspGlyPheTyrAsplie155160165tttggcccctctatggaateateaaagcaagggaagatgccateaeta1357PheGlyProSerMetGluSerSerLysGinGlyLysMetProSerLeu170175180gcagatcttcaaacgggcataggcgacctgggttttgaagtcategta1405AlaAspLeuGinThrGlylieGlyAspLeuGlyPheGluVallieVal185190195ateaatcgtgccattgataccaccttacaggagatggaacaagttgca1453lieAsnArgAlalieAspThrThrLeuGinGluMetGluGinValAla.200205210caatgtatectgcttgactttcctgttgcaaatattgcagccttagtt1501GinCyslieLeuLeuAspPheProValAlaAsnlieAlaAlaLeuVal215220225230caaagaatagccgagcttgttacagatcacatgggtggacctgtgaaa1549GinArglieAlaGluLeuValThrAspHisMetGlyGlyProValLys235240245gatgcaaatgacatgetcactagatggetagagaaaageactgageta1597AspAlaAsnAspMetLeuThrArgTrpLeuGluLysSerThrGluLeU16250255260agaaccteactacacacaagtttgttgcctattggctgcateaagata1645ArgThrSerLeuHisThrSerLeuLeuProlieGlyCyslieLyslie265270275ggtctgtctcgtcaccgtgccetacttttcaaggtcagttctctctcagaaaa1698GlyLeuSerArgHisArgAlaLeuLeuPheLys280285tcctcaatatattgaatgttatgaattgtctagggtaagggttcaa^gsctsggggatat1758ggcactcgccttct犯t犯cggtggcagggcttctccctgctgagctaaaagaggatttg1818aggcttagggctaactttagagattcattgattgattgat犯t柳gtacgtgggggtcc1878ctttaLtagggaggacatactctcta_gt3ttat3taaax;ca1938atccaatctctatctctaactttctaataaacttcatctctttcctaactagataatctc1998ctatatttatatgatttattcctaatttatcatgcccaaactgctgcatgggectatget205Satgt犯gcactagatttcttcatttgtcca3C3tatatagatgtccgctt2118atggctactgtatatcttcgtgC3g3ttetcgetgatagtgttggcattcct2170lieLeuAlaAspSerValGlyliePro290295tgcaagcttgtcaaagggagtaattat.actggtgatgatgatgatget2218CysLysLeuValLysGlySerAsnTyrThrGlyAspAspAspAspAla300305310ate犯cataata肌gatgaatg￡iaaggtattgatgtatttgatcat2264lieAsnlielieLysMetAsnGluArg315320tgctgtttctctgggggaaaactatagtaaaaa幼cccggaccggtgggtgacctggccg2324accttctggttcaccggtctgaccggtggctcggatggttgaaccacggttcacatgtgt2384tgttattccctcctactcacatatggtgcafitagcataagggttaggcca2444tccttccgtg3gC3C3CtgCccagggttcgattcccaccaaatgcgccactccttgccaa2504ttttgcggaacagccacagcaagcattgatgaaatgggcctcaggcagcc2564catttstggcecatttgeaggttgacctgtccaaccagtatcggtttaatgtccggttcg2624ccta^g犯ccggccggttcagccggttc肌3gCggtttg3atgcatgtccggtctttg犯2684gcaaaccgaaccgtgct叫g(shù)gtctggttcccatttttttccggtcgaaccgccggtccgg2744tctggttttttctactatgggg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sThr985SerHisGinGluSerGinSerProlieProThrGlyAspAsn975GinPro960LeuArg1000ThrProVal990ProValAlaGin1005101010152權(quán)利要求1、一種影響水稻對白葉枯病和細菌性條斑病產(chǎn)生抗性的OsEDR1基因，它是序列表SEQIDNO1中所示的DNA序列。2、基因編碼區(qū)的DNA，它是編碼序列表SEQIDNO:1所示蛋白質(zhì)的DNA序列。3、權(quán)利要求1所述的O^D/^基因和權(quán)利要求2所述的Os五Z)//基因編碼區(qū)的DNA序列在增加水稻對白葉枯病和細菌性條斑病抗性中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及植物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及包含水稻抗病相關(guān)基因OsEDR1的DNA片段的分離克隆和功能驗證。利用基于RNA干擾(RNAinterference，RNAi)原理的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將OsEDR1基因的部分DNA片段與能夠表達雙鏈RNA的載體連接并轉(zhuǎn)入水稻品種，抑制水稻品種中OsEDR1基因的表達。OsEDR1基因表達量顯著降低的遺傳轉(zhuǎn)化水稻對白葉枯病菌和細菌性條斑病菌的抗性明顯增強，證明OsEDR1基因在水稻抗白葉枯病和抗細菌性條斑病反應(yīng)中是負調(diào)控因子，可以通過抑制OsEDR1基因的表達改良水稻的抗病性。文檔編號C12N15/29GK101514343SQ20091006126公開日2009年8月26日申請日期2009年3月25日優(yōu)先權(quán)日2009年3月25日發(fā)明者沈祥陵,王石平,斌袁申請人:華中農(nóng)業(yè)大學